北五味子多糖對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用

劉 蕾，趙雪東，王智彬

急性心肌梗死是臨床常見的缺血性心血管疾病類型，近年來，缺血性心血管疾病發(fā)生率及死亡率逐年增加，嚴(yán)重威脅人類生命。臨床采用冠狀動脈介入等方式治療急性心肌梗死，但心肌再灌注導(dǎo)致心肌缺血再灌注損傷發(fā)生[1-2]。目前關(guān)于心肌缺血再灌注損傷的分子機(jī)制尚未明確。有研究顯示，九龍?zhí)倏傸S酮等中醫(yī)藥具有抗氧化、抗炎等作用[3]，但關(guān)于中醫(yī)藥對心肌細(xì)胞氧化損傷的作用機(jī)制尚未明確。五味子是我國傳統(tǒng)中藥，具有補(bǔ)腎寧心、益氣生津的功效，其中北五味子多糖(schisandra chinensis polysaccharide，SCP)具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤等作用，有研究表明，SCP可抑制促炎因子釋放，抑制炎癥反應(yīng)[4]。但SCP對缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)心肌細(xì)胞氧化損傷的作用機(jī)制尚未明確。巨噬細(xì)胞中微小RNA(microRNA，miR)-212-3p表達(dá)下調(diào)，miR-212-3p通過靶向調(diào)控高遷移率族蛋白B1(HMGB1)抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[5]。生物信息學(xué)分析顯示，10號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)可能是miR-212-3p的靶基因，抑制PTEN表達(dá)可抑制H/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡[6]。本研究通過分析SCP對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激損傷的影響，分析對miR-212-3p/PTEN分子軸的調(diào)控作用，為SCP治療急性心肌梗死等心血管疾病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 SCP購自秦皇島旭光生物科技有限公司，采用二氧化碳瘤體萃取SCP，分離水溶性成分與脂溶性成分，應(yīng)用超聲波攪拌，超聲波預(yù)處理40 min后浸潤，采用酶法與三氯乙酸結(jié)合脫蛋白得到SCP，提取有效率為77.6%，純度為50%[7]。大鼠心肌細(xì)胞H9c2由深圳市百恩維生物科技有限公司提供；miR-212-3p mimics、anti-miR-212-3p、miR-NC、anti-miR-NC由廣州銳博生物科技有限公司提供；兔抗鼠PTEN抗體由北京百奧萊博科技有限公司提供；兔抗鼠Bax、Cleaved Caspase-3抗體均由美國Santa Cruz公司提供；山羊抗兔二抗由美國Abcam公司提供；凋亡試劑盒由美國Sigma公司提供；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)試劑盒均由北京天根生化科技有限公司提供；乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。Lipofectamine 2000由美國Invitrogen公司提供。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 心肌細(xì)胞用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基在常規(guī)培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2、95%空氣)中培養(yǎng)，胰酶消化80%融合細(xì)胞，之后以每孔150 μL接種96孔板，加入預(yù)先用95%N2與5%CO2飽和過的不含血清的培養(yǎng)基，細(xì)胞置于厭氧培養(yǎng)箱(95%N2和5%CO2)中缺氧處理2 h，棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，更換為含血清培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于常規(guī)培養(yǎng)箱內(nèi)復(fù)氧處理4 h[8]，作為H/R組。正常培養(yǎng)細(xì)胞作為Con組。分別使用25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的SCP對心肌細(xì)胞進(jìn)行24 h的處理[9]，同時進(jìn)行H/R處理，依次作為H/R+SCP-L組、H/R+SCP-M組、H/R+SCP-H組。分別將anti-miR-NC、anti-miR-212-3p轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞后加入100 μg/mL SCP處理心肌細(xì)胞24 h，并進(jìn)行H/R處理，分別作為H/R+SCP-H+anti-miR-NC組、H/R+SCP-H+anti-miR-212-3p組。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 將轉(zhuǎn)染后的心肌細(xì)胞常規(guī)接種，并按上述分組方法進(jìn)行處理，常規(guī)培養(yǎng)并收集細(xì)胞1.0×106個，使用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)進(jìn)行2次清洗，與500 μL細(xì)胞懸液混勻，并依次加入5 μL染色液(Annexin V-FITC)及碘化丙啶(PI)，混勻后避光孵育15 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀嚴(yán)格按照凋亡試劑盒操作說明對細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行分析。

1.2.3 氧化應(yīng)激指標(biāo)LDH、SOD、MDA含量檢測 收集各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照LDH試劑盒說明加入相應(yīng)試劑，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的吸光度值，計算LDH含量。取對數(shù)生長期心肌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個/mL，接種于培養(yǎng)皿(100 mm×20 mm)，室溫孵育24 h，按照1.2.1分組處理后，棄上清液，加入0.25%胰蛋白酶消化，離心后收集細(xì)胞，根據(jù)試劑盒步驟檢測細(xì)胞SOD活性、MDA含量。

1.2.4 RT-qPCR檢測細(xì)胞miR-212-3p、PTEN mRNA表達(dá)水平 按上述分組方法進(jìn)行處理，Trizol法常規(guī)提取細(xì)胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并配置RT-qPCR反應(yīng)體系，按照熒光定量試劑盒使用說明完成PCR，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算miR-212-3p、PTEN mRNA相對表達(dá)量。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測miR-212-3p的靶基因 starBase證實PTEN與miR-212-3p有結(jié)合位點(diǎn)。常規(guī)構(gòu)建野生型及突變型PTEN的熒光素酶載體WT-PTEN及MUT-PTEN，并將其分別與miR-NC、miR-212-3p mimics共轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后，嚴(yán)格依據(jù)說明完成細(xì)胞相對熒光素酶活性的檢測。

1.2.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測PTEN、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá) 心肌細(xì)胞常規(guī)加入RIPA裂解液完成細(xì)胞總蛋白的提取。蛋白變性后進(jìn)行十二烷硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，常規(guī)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉2h，依次常規(guī)加入一抗稀釋液(1∶1 000)，孵育、洗膜，加入二抗稀釋液(1∶5 000)，孵育、洗膜。加入電化學(xué)發(fā)光液(ECL)，暗室顯影、拍照，以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用Image J軟件分別對各蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 SCP對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響 H/R組細(xì)胞凋亡率及Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平高于Con組(P<0.05)；與H/R組比較，H/R+SCP-L組、H/R+SCP-M組、H/R+SCP-H組細(xì)胞凋亡率及Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平降低，且呈劑量依賴性(P<0.05)。詳見圖1、表1。

圖1 SCP對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響(A為各組細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖；B為各組Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)條帶圖)

表1 SCP對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡、Bax及Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響(±s)

2.2 SCP對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 H/R組心肌細(xì)胞LDH、MDA含量高于Con組(P<0.05)，SOD含量低于Con組(P<0.05)；與H/R組比較，H/R+SCP-L組、H/R+SCP-M組、H/R+SCP-H組心肌細(xì)胞LDH、MDA含量降低(P<0.05)，SOD含量升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性。詳見表2。

表2 SCP對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響(±s)

2.3 SCP對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞miR-212-3p、PTEN mRNA表達(dá)量的影響 H/R組心肌細(xì)胞miR-212-3p相對表達(dá)量低于Con組(P<0.05)，PTEN mRNA相對表達(dá)量高于Con組(P<0.05)；與H/R組比較，H/R+SCP-L組、H/R+SCP-M組、H/R+SCP-H組心肌細(xì)胞miR-212-3p相對表達(dá)量升高(P<0.05)，PTEN mRNA相對表達(dá)量降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性。詳見表3。

表3 SCP對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-212-3p、PTEN mRNA表達(dá)量的影響(±s)

2.4 miR-212-3p靶向調(diào)控PTEN的影響 starBase預(yù)測顯示PTEN的3′UTR中含有與miR-212-3p互補(bǔ)的核苷酸序列，詳見圖2。miR-212-3p過表達(dá)導(dǎo)致WT-PTEN熒光素酶活性降低(P<0.05)，對MUT-PTEN熒光素酶活性影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表4。miR-212-3p組細(xì)胞PTEN蛋白水平低于miR-NC組(P<0.05)，anti-miR-212-3p組細(xì)胞PTEN蛋白水平高于anti-miR-NC組(P<0.05)。詳見圖3、表5。

圖2 PTEN的3′UTR中含有與miR-212-3p互補(bǔ)的核苷酸序列

表4 miR-212-3p過表達(dá)對熒光素酶活性的影響(±s)

圖3 PTEN蛋白表達(dá)條帶圖

表5 miR-212-3p靶向調(diào)控PTEN蛋白表達(dá)的影響(±s)

2.5 干擾miR-212-3p表達(dá)減弱SCP對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激損傷的影響 與H/R+SCP-H+anti-miR-NC組比較，H/R+SCP-H+anti-miR-212-3p組細(xì)胞凋亡率及LDH、MDA含量升高(P<0.05)，Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，miR-212-3p、SOD含量降低(P<0.05)。詳見圖4、表6。

圖4 干擾miR-212-3p表達(dá)能減弱SCP對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激損傷的影響(A為細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖；B為PTEN、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)條帶圖)

表6 干擾miR-212-3p表達(dá)能減弱SCP對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激損傷的影響(±s)

3 討 論

心肌再灌注是治療急性心肌梗死的主要手段，臨床主要采用經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)等血管再通術(shù)進(jìn)行治療，但心肌再灌注可能造成心肌細(xì)胞損傷。相關(guān)研究顯示，傳統(tǒng)中藥具有抗氧化、抑制血栓形成等作用[10-12]，但其在急性心肌梗死治療中的作用機(jī)制尚未明確。本研究探討SCP對H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響和保護(hù)機(jī)制，為急性心肌梗死等心血管疾病的治療提供新方向。

SCP通過改善高脂血癥大鼠脂質(zhì)代謝從而減輕肝損傷[13]。SCP具有降血脂、保護(hù)血管內(nèi)皮功能的作用，可減輕氧化應(yīng)激損傷[14]。SCP可抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心室重構(gòu)[15]。本研究結(jié)果顯示，H/R可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，而SCP使H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率降低，提示SCP對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡具有抑制作用。心肌細(xì)胞缺氧后導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)減少，從而促使LDH等心肌酶從胞漿內(nèi)漏出，LDH活性可反映心肌損傷程度，SOD可清除體內(nèi)自由基及活性氧，屬于抗氧化酶類；MDA屬于過氧化脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，其水平升高可加重氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生[16]。本研究結(jié)果顯示，H/R可提高心肌細(xì)胞MDA含量，提高培養(yǎng)液LDH活性，降低SOD活性，而SCP呈劑量依賴效應(yīng)降低H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞MDA含量，提高SOD活性，并抑制培養(yǎng)液LDH活性，提示SCP可抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷。

miR-212-3p通過下調(diào)SOX5的表達(dá)，抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而減輕炎癥反應(yīng)[17]。miR-212-3p通過靶向MeCP2調(diào)節(jié)早期神經(jīng)發(fā)生[18]。抑制PTEN表達(dá)可抑制敗血癥誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[19]。本研究結(jié)果顯示，miR-212-3p可靶向結(jié)合PTEN，H/R后，心肌細(xì)胞miR-212-3p表達(dá)降低，PTEN表達(dá)升高。使用不同劑量的SCP處理后，心肌細(xì)胞miR-212-3p表達(dá)升高，PTEN表達(dá)降低，提示SCP可能通過上調(diào)miR-212-3p表達(dá)，下調(diào)PTEN表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激損傷的作用。為驗證上述推測，本研究轉(zhuǎn)染anti-miR-212-3p至心肌細(xì)胞，使用SCP處理后進(jìn)行H/R處理，結(jié)果顯示，干擾miR-212-3p表達(dá)能減弱SCP對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。提示SCP可能通過對miR-212-3p/PTEN分子軸的調(diào)控作用，減弱H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述，SCP可抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激損傷，作用機(jī)制可能與SCP對miR-212-3p/PTEN分子軸的調(diào)控作用有關(guān)，為SCP抗心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激提供實驗依據(jù)，同時為急性心肌梗死等心血管疾病的治療提供新思路。