枯草芽孢桿菌生防菌株SEM-9根際定植及對(duì)根際土壤微生物多樣性的影響

李慶榮，邢東旭，肖 陽，廖森泰，鄒宇曉，劉 凡，黎爾納，周東來，楊 瓊

(1 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所, 廣東 廣州, 510610；2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南都市農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州, 510610)

在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中，可持續(xù)和環(huán)境友好的作物種植策略越來越依賴于生物肥料及生物農(nóng)藥的使用。我國研究、生產(chǎn)和應(yīng)用微生物肥料已有50多年的歷史，但其一直未得到很好的發(fā)展。其中一個(gè)重要的原因是在實(shí)驗(yàn)室篩選研究過程中微生物菌株肥效很好，但在溫室和田間試驗(yàn)中則出現(xiàn)肥效不穩(wěn)定或達(dá)不到預(yù)期效果的情況。這可能是由于土壤環(huán)境條件復(fù)雜以及大量競(jìng)爭(zhēng)性微生物的存在影響目標(biāo)菌株生物活性因子的表達(dá)，以及菌株根際定植能力不良等原因造成[1-3]。因此，探討微生物在復(fù)雜土壤環(huán)境中的活性和定植情況對(duì)更好地評(píng)價(jià)微生物菌株在肥料、生防等方面的應(yīng)用潛力具有重要的意義。

自然界中，細(xì)菌主要靠生物膜黏附于生物或非生物體表面，生物膜對(duì)細(xì)菌自身適應(yīng)環(huán)境及遺傳進(jìn)化起著重要的作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，形成生物膜是細(xì)菌穩(wěn)定定植在宿主植物根系的重要機(jī)制之一，細(xì)菌通過形成致密的生物膜，在根系周圍穩(wěn)定定植，提高定植量，發(fā)揮促生防病等作用[5-6]?？莶菅挎邨U菌生物膜的主要骨架成分包括胞外多糖、蛋白質(zhì)、胞外核酸及其他多聚體分子等。胞外多糖的表達(dá)、修飾及分泌主要由含有16個(gè)基因的 epsA-O 操縱子調(diào)控[7-8]，而胞外蛋白的編碼調(diào)控基因主要由 yqx-M (tapA)-sipW-tasA操縱子調(diào)控[9-10]。此外，生物膜的形成主要有3條調(diào)控途徑：Spo0A下游的 SinR/SinI、AbbA/AbrB、SlrR/SlrA 和獨(dú)立于 Spo0A的 YwcC和DegU/DegS 等途徑[8,10-11]。

SEM-9菌株是廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所蠶桑與南藥資源綜合利用團(tuán)隊(duì)從蠶沙堆肥發(fā)酵的高溫期分離得到的1株枯草芽孢桿菌，具有明顯的解磷、解鉀及拮抗鐮刀菌的功能，具有很好的生防和微生物肥料應(yīng)用開發(fā)的潛力[12]。在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其基因組序列中含有枯草芽孢桿菌生物膜形成的主要調(diào)控基因，包括epsA-O 操縱子基因、yqx-M (tapA)-sipW-tasA 及生物膜形成的主要調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Spo0A及 DegU/S途徑的基因[12]。為更好地探討該菌株在作物根際和根際土壤的定植能力及其對(duì)根際土壤微生物群落的影響，本文通過對(duì)SEM-9菌株進(jìn)行綠色熒光蛋白標(biāo)記，然后利用盆栽試驗(yàn)分析該菌株在作物根際土壤、根表面及根系內(nèi)組織的定植情況，并以土傳病害土壤為試驗(yàn)對(duì)象，初步分析SEM-9菌株處理后根際土壤中微生物多樣性的變化情況，以期通過本文的研究，探明該菌株在作物根際的定植規(guī)律，深入挖掘該菌株的應(yīng)用潛力，為該菌株的產(chǎn)品開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

番茄Lycopersicon esculentum種子購買自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所；枯草芽孢桿菌SEM-9由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所蠶桑與南藥資源綜合利用研究室從蠶沙中分離、鑒定并保存；含有綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因和氯霉素抗性基因的重組質(zhì)粒pGFP22載體(質(zhì)粒大小為8 200 bp)的枯草芽孢桿菌購買自BioVector質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心。

HS液體培養(yǎng)基：蒸餾水 66.5 mL，10 ×最低鹽溶液 10.0 mL，200 g/L 葡萄糖 2.5 mL，1g/L，L- 色氨酸 5.0 mL，20 g/L 酪蛋白 1.0 mL，100 g/L 酵母提取物 5.0 mL，80 g/L 精氨酸 10.0 mL，4g/L組氨酸 10.0 mL，121 ℃，滅菌 20 min。其中，10×最低鹽溶液 (100 mL)：2 g (NH4)2SO4、14 g K2HPO4、6 g KH2PO4、1 g 檸檬酸鈉，加100 mL蒸餾水和高壓滅菌后添加0.1 mL 1 mol/L MgSO4。

LS 培養(yǎng)基：蒸餾水 80.0 mL，10 × 最低鹽溶液10.0 mL，200 g/L 葡萄糖 2.5 mL，1 g/LL-色氨酸 0.5 mL，20 g/L 酪蛋白 0.5 mL，20 g/L酵母提取物 5.0 mL，1 mol/L MgCl20.25 mL，1 mol/L CaCl20.05 mL，121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 pGFP22質(zhì)粒DNA提取

挑取含pGFP22載體的單菌落接種于含5 μg/mL氯霉素的液體LB培養(yǎng)基，于37 ℃條件下，220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。

按照質(zhì)粒提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 4.0)提取pGFP22質(zhì)粒。由于革蘭陽性菌細(xì)胞壁較厚，在加入Solution 1時(shí)需要添加終濃度50 g/L的溶菌酶，37 ℃條件下，搖床放置1 h，其他步驟不變；提取后制備8 g/L的瓊脂糖凝膠，電泳后進(jìn)行凝膠成像分析。

1.3 pGFP22質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

挑取SEM-9單菌落接種于20 mL HS液體培養(yǎng)基，180 r/min 37 ℃搖床過夜培養(yǎng)后接種500 μL菌液于50 mL LB培養(yǎng)基中， 180 r/min 37 ℃搖床培養(yǎng)，每隔1 h取5 mL菌液，分光光度計(jì)測(cè)定D600nm。

菌株繁殖到達(dá)平臺(tái)期時(shí)，間隔15 min取樣品，用φ為20%的甘油，分裝為每管1 mL， -80 ℃條件下保存。將制備的感受態(tài)樣品1 mL，加入20 mL LS培養(yǎng)基， 37 ℃條件下，100 r/min培養(yǎng)2 h后取1 mL培養(yǎng)液，加入10 mmol/L的EGTA 10 μL ，37 ℃、100 r/min搖床培養(yǎng)5 min后分裝為每管0.5 mL，加入 20 μL 質(zhì)粒 DNA，37 ℃、250 r/min 培養(yǎng) 90 min，取100 μL涂布于含有氯霉素的LA培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜。

1.4 陽性轉(zhuǎn)化子篩選與遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

利用相差熒光倒置顯微鏡觀察在氯霉素平板上生長(zhǎng)的單菌落，挑取綠色熒光的單菌落，加入到添加了氯霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃條件下，搖床12 h，按“1.2”的方法提取質(zhì)粒并進(jìn)行電泳檢測(cè)。將有綠色熒光蛋白表達(dá)并且質(zhì)粒檢測(cè)陽性的菌液用φ為20%的甘油在-80℃條件下保存。

取200 μL菌液加入到20 mL含有氯霉素的LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min搖床培養(yǎng) 72～96 h，按“1.2”的方法提取質(zhì)粒并進(jìn)行電泳檢測(cè)。取少量菌液稀釋后涂布于含5 mg/L氯霉素的LA培養(yǎng)基平板，37 ℃條件下培養(yǎng)1 d后，熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。

1.5 SEM-9-pGFP22陽性轉(zhuǎn)化子根際定植

將消毒過的番茄種子置于培養(yǎng)皿中浸種。育苗盆裝好無菌營養(yǎng)土待用。將陽性轉(zhuǎn)化子SEM-9-pGFP22菌液稀釋至106CFU/mL。每個(gè)育苗盆中加入菌液5 mL，點(diǎn)入1～2粒番茄種子，進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。無菌水作為對(duì)照。20 d后觀察菌株在土壤以及根系的定植。

根際土壤定植分析：將幼苗根系的土壤輕輕抖落，梯度稀釋、涂板，熒光顯微鏡下觀察菌落熒光情況。

根表定植分析：幼苗根系用流水輕輕沖洗后，按比例加入無菌水和沖洗過的根，放入事先裝有玻璃珠的試管中，渦旋、懸浮液梯度稀釋、平板培養(yǎng)，熒光顯微鏡觀察菌落熒光情況。

根內(nèi)定植分析：將根部土壤全部洗凈并消毒，在無菌條件下，將消毒過的根系壓片，熒光顯微鏡觀察是否有綠色熒光表達(dá)；將消毒過的根系用研缽磨碎后，梯度稀釋涂板，熒光顯微鏡觀察。

1.6 SEM-9菌株對(duì)根際土壤微生物多樣性的影響

試驗(yàn)土壤為廣東中山某地，該地連續(xù)種植黃瓜6年，土傳病害頻繁發(fā)生。瓜苗生長(zhǎng)約30 d時(shí)(觀察到葉面開始發(fā)黃)，每株瓜苗灌根處理100 mL(106CFU/L)SEM-9發(fā)酵液，分別以空白培養(yǎng)基(CK)和市售菌劑SJ(SJ)為空白對(duì)照和陽性對(duì)照，每組處理3壟，每壟為1個(gè)重復(fù)。處理14 d后，觀察瓜苗生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)每組的黃葉株數(shù)；并對(duì)每個(gè)處理根際土壤按S形取樣，送深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行16 S/ITS測(cè)序及微生物多樣性分析。組間多樣性指數(shù)的差異分析使用SPSS statistics 11.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 SEM-9生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

按照“1.3”的方法對(duì)野生型菌株SEM-9進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，每小時(shí)取3 mL培養(yǎng)基，使用分光光度計(jì)測(cè)量D600nm。得到如圖1所示的生長(zhǎng)曲線，曲線符合細(xì)菌生長(zhǎng)S型曲線。菌株在接種后生長(zhǎng)至2 h處于延滯期，2 h后開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，對(duì)數(shù)期為2～5 h；5 h時(shí)處于對(duì)數(shù)末期。因此，從5 h開始間隔15 min取樣，甘油保存，準(zhǔn)備pGFP22質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。

圖1 SEM-9菌株的生長(zhǎng)曲線Fig. 1 Growth curve of the strain SEM-9

2.2 pGFP22質(zhì)粒提取及轉(zhuǎn)化

用接種環(huán)挑取陽性單菌落接種至氯霉素質(zhì)量濃度為10 μg/mL的LB培養(yǎng)基，37 ℃條件下180 r/min培養(yǎng)過夜，然后進(jìn)行質(zhì)粒提取，提取質(zhì)粒后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示。然轉(zhuǎn)化，涂板到氯霉素質(zhì)量濃度為10 mg/L的LA培養(yǎng)基，倒置培養(yǎng)過夜后，用熒光顯微鏡觀察激發(fā)光為綠色的菌落確定為陽性轉(zhuǎn)化子(圖3A)。且平板菌落4 d后仍能觀測(cè)到綠色熒光(圖3B)，說明質(zhì)粒在菌體內(nèi)能夠穩(wěn)定遺傳。

圖2 SEM-9菌株質(zhì)粒提取結(jié)果Fig. 2 Plasmid extraction results of SEM-9 strain

圖3 熒光顯微鏡篩選SEM-9-pGFP22Fig. 3 Screening of SEM-9-pGFP22 by fluorescence microscope

2.3 定植檢測(cè)

結(jié)果(圖2)說明轉(zhuǎn)化子中成功導(dǎo)入了質(zhì)粒pGFP22；連續(xù)培養(yǎng)3～4 d后，仍然能夠檢測(cè)到陽性轉(zhuǎn)化子中具有質(zhì)粒pGFP22。將20 μL提取質(zhì)粒與含500 μL感受態(tài)的SEM-9菌株細(xì)胞混合，進(jìn)行自

在菌液處理后的20 d內(nèi)按“1.5”的方法檢測(cè)SEM-9-pGFP22在番茄根際土壤、根表和根內(nèi)的定植情況，結(jié)果如圖4所示。根際土壤內(nèi)細(xì)菌區(qū)植檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有綠色熒光菌株存在，說明SEM-9-pGFP22菌株可以在根際土壤內(nèi)定植(圖4A)；根表面經(jīng)無菌水沖洗后，沖洗液無菌培養(yǎng)，同樣觀察到大量的綠色熒光菌株的存在，表明SEM-9-pGFP22菌株也可以在幼苗根表面生長(zhǎng)繁殖(圖4B)；但是在對(duì)根表面進(jìn)行消毒處理、研磨培養(yǎng)后未發(fā)現(xiàn)綠色熒光菌株的存在，且消毒處理后的根系熒光顯微鏡觀察也沒有發(fā)現(xiàn)綠色熒光，表明SEM-9-pGFP22菌株不會(huì)定植在番茄苗的根內(nèi)部(圖4D)。

圖4 SEM-9-pGFP22菌株的根際定植分析Fig. 4 Analysis of rhizosphere colonization of the recombinant strain SEM-9-pGFP22

2.4 SEM-9灌根處理對(duì)黃瓜葉片黃化率及土壤微生物多樣性的影響

在連作種植黃瓜的病害發(fā)作地，灌根法施加SEM-9菌懸液(菌液濃度106CFU/mL)，分別以施加等量市售菌肥和空白培養(yǎng)基為陽性對(duì)照和空白對(duì)照，生長(zhǎng)2周后觀察黃瓜的生長(zhǎng)情況及枯萎病發(fā)生情況。發(fā)現(xiàn)施加SEM-9菌懸液后，瓜苗生長(zhǎng)良好，苗壯葉綠，很少有株苗葉片黃化、枯萎現(xiàn)象發(fā)生(發(fā)病率12.5%)，顯著好于市售對(duì)照菌肥SJ(發(fā)病率22.5%)及空白對(duì)照組(發(fā)病率55.0%)(圖5)。

圖5 SEM-9菌液處理對(duì)黃瓜枯萎病害的防治效果Fig. 5 Control effect of the strain SEM-9 on CucumberFusarium wilt disease

對(duì)空白培養(yǎng)對(duì)照區(qū)、SEM-9處理區(qū)及菌肥SJ處理區(qū)的根際土壤按S形取樣法取樣，進(jìn)行16 S和ITS的測(cè)序，分析不同處理組根際土壤中細(xì)菌及真菌的微生物多樣性的變化，以Chao、Ace指數(shù)評(píng)價(jià)每個(gè)處理組的菌群豐度，以Shannon和Simpson指數(shù)評(píng)價(jià)處理組的菌群多樣性。處理區(qū)域的細(xì)菌微生物菌群豐度及多樣性分析結(jié)果見表1。顯著性分析發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，SEM-9菌液處理和SJ對(duì)照菌肥處理后，細(xì)菌各評(píng)價(jià)指數(shù)沒有顯著性變化，因此處理對(duì)根際土壤的細(xì)菌微生物菌群豐度及多樣性沒有顯著影響。通過ITS測(cè)序分析每個(gè)處理區(qū)域的真菌微生物菌群豐度及多樣性(表1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，SEM-9菌液處理后，Chao、Ace和 Shannon指數(shù)顯著增加 (P＜0.05)，而Simpson指數(shù)顯著降低(P＜0.05)，這說明SEM-9菌液處理顯著增加了根際土壤真菌微生物的菌群豐度及多樣性。

表1 SEM-9處理后根際土壤微生物多樣性分析1)Table 1 Analysis of microbial diversity in rhizosphere soil after treated with the strain SEM-9

黃瓜枯萎病的病原菌為尖孢鐮刀菌黃瓜?；蚚13]，為明確SEM-9處理后，根際土壤中尖孢鐮刀菌相對(duì)豐度的變化，對(duì)根際土壤中鐮刀菌和尖孢鐮刀菌的相對(duì)豐度進(jìn)行了對(duì)比分析(表2)。由表2可知，在種和屬的水平上，SEM-9處理后鐮刀菌屬和尖孢鐮刀菌的相對(duì)豐度都較對(duì)照顯著降低(P＜0.05)，而對(duì)照菌肥SJ處理后，在屬的水平上鐮刀菌屬相對(duì)豐度較對(duì)照顯著降低(P＜0.05)，在種的水平上尖孢鐮刀菌的相對(duì)豐度略高于對(duì)照但無顯著差異。結(jié)果表明，SEM-9菌株處理后，抑制了黃瓜枯萎病原菌尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)繁殖，降低了其在根際土壤的相對(duì)豐度。

表2 SEM-9處理后根際土壤中鐮刀菌在種屬水平上的相對(duì)豐度變化1)Table 2 Analysis of relative abundance of Fusarium in rhizosphere soil at species and genus level after treated by the suspension of the strain SEM-9

3 討論與結(jié)論

3.1 枯草芽孢桿菌SEM-9菌株的GFP標(biāo)記

綠色熒光蛋白被廣泛用于研究菌株在根和根際的定植[14-15]。但是芽孢桿菌易生成芽孢，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化難度較大。在前期質(zhì)粒轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中我們采取了多種感受態(tài)制備方法，包括適用于自然轉(zhuǎn)化的Spizizen法及適用于電擊轉(zhuǎn)化的EM(Electroporation medium)法。電擊轉(zhuǎn)化技術(shù)難度大，尤其是枯草芽孢桿菌感受態(tài)及電擊參數(shù)的選擇影響較大，SEM-9菌株的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化未能成功，因此最終選擇了適應(yīng)于該菌株的化學(xué)感受態(tài)制備法。Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌自然轉(zhuǎn)化時(shí)，感受態(tài)高峰出現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且一定濃度的鎂離子和鈣離子可以提高自然轉(zhuǎn)化效率。本研究結(jié)果可以看出，枯草芽孢桿菌SEM-9在營養(yǎng)豐富的HS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，5 h迅速達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將此時(shí)培養(yǎng)液接種到營養(yǎng)貧瘠的LS培養(yǎng)基后，由于營養(yǎng)限制，可能導(dǎo)致枯草芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列生理變化，細(xì)胞通透性增加，利于外源DNA的進(jìn)入[17]。

3.2 枯草芽孢桿菌SEM-9菌株的根際定植定性分析

微生物菌劑及肥料在耕地中的應(yīng)用，非常重要的一環(huán)在于菌株能否在根際土壤中定植。外源菌株施用到田間，與土著根際微生物和寄主植物根系組成了一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)。菌株在根際土壤中成功定植并建立種群，必然與其他根際微生物之間產(chǎn)生了空間、能源的競(jìng)爭(zhēng)，這是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，受到多種因素的調(diào)控與制約[18]。在前期的研究中我們發(fā)現(xiàn)SEM-9菌株的基因組內(nèi)含有枯草芽孢桿菌生物膜合成的主要調(diào)控基因，包括epsA-O 操縱子基因、yqx-M (tapA)-sipW-tasA 及生物膜形成的主要調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Spo0A及 DegU/S途徑的基因[12]。為更好地明確該菌株在根際的定植情況，本研究選擇適用于枯草芽孢桿菌的pGFP22質(zhì)粒，通過自然轉(zhuǎn)化法獲得可以穩(wěn)定表達(dá)GFP的SEM-9- pGFP22重組菌株。利用熒光顯微鏡觀察了根際土壤、根表面及根系內(nèi)部結(jié)構(gòu)的菌株定植情況，發(fā)現(xiàn)在根際土壤及根表面存在大量表達(dá)綠色熒光蛋白的菌株，而在消毒后的根系上未能觀察到綠色熒光信號(hào)，說明SEM-9菌株可以成功地在根際土壤和根表面生長(zhǎng)繁殖，但是不會(huì)定植到根系內(nèi)細(xì)胞和組織中。

3.3 枯草芽孢桿菌SEM-9菌株對(duì)根際土壤微生物多樣性的影響

土傳病害是指生活在土壤中的病原體，如真菌、細(xì)菌、線蟲和病毒，從作物根部或莖部侵害作物而引起的病害。在耕作過程中，輪作、施肥、管理等措施不合理，會(huì)降低土壤微生物多樣性，破壞土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致土傳病害爆發(fā)。本文以廣東中山地區(qū)一處黃瓜連作導(dǎo)致土傳病害頻繁的土地為試驗(yàn)區(qū)，在瓜苗成長(zhǎng)期施加SEM-9菌液，處理區(qū)瓜苗生長(zhǎng)良好，苗壯葉綠，株苗葉片黃化、枯萎發(fā)生率顯著低于對(duì)照組；且通過微生物多樣性分析發(fā)現(xiàn)SEM-9菌株處理后，根際土壤的細(xì)菌微生物多樣性均值雖略有增加但無顯著變化，而真菌類微生物多樣性顯著增加。土壤中的細(xì)菌、真菌是土壤的重要組成部分，對(duì)土壤物質(zhì)代謝及循環(huán)具有重要作用，對(duì)維持土壤系統(tǒng)穩(wěn)定性和受損土壤系統(tǒng)的恢復(fù)有重要作用，與土壤系統(tǒng)健康緊密相關(guān)[19-21]。提高土壤微生物群落多樣性和功能，是控制土傳病害發(fā)生的一條有效途徑。

在本研究中SEM-9菌液處理后14 d的根際土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)較對(duì)照組平均值略有增加，但并沒有顯著性改變，推測(cè)原因可能在于細(xì)菌種類繁多，多樣性指數(shù)改變不明顯，也可能由于試驗(yàn)僅僅分析了SEM-9處理后14 d的樣品，而對(duì)更短時(shí)間或者更長(zhǎng)時(shí)間的樣品沒有進(jìn)行檢測(cè)，具體原因還有待于后期進(jìn)一步的研究。根際土壤細(xì)菌微生物多樣性因生防菌株處理時(shí)間而不同也有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，例如鄭婷婷[22]研究了生防菌株GHt-q6對(duì)黃瓜根系土壤微生態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)生防菌株GHt-q6處理后，在黃瓜生長(zhǎng)前期群落多樣性變化不明顯，生長(zhǎng)后期細(xì)菌群落的多樣性增加。黃瓜枯萎病是一種重要的土傳病害，主要病原菌為尖孢鐮刀菌。SEM-9菌株對(duì)多種鐮刀菌都有顯著的拮抗效果，包括尖孢鐮刀菌。因此，我們對(duì)根際土中尖孢鐮刀菌和鐮刀菌屬的相對(duì)豐度進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)SEM-9菌液處理后根際土壤中的尖孢鐮刀菌和鐮刀菌屬的相對(duì)豐度較對(duì)照顯著降低，因此，我們推測(cè)經(jīng)SEM-9處理后，根際土壤中土傳病菌尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)繁殖被顯著抑制，從而促進(jìn)了其他土著微生物的生長(zhǎng)，提高了真菌類微生物的種群多樣性，改良了土壤的真菌微生物群落結(jié)構(gòu)，因此降低了黃瓜土傳病害的發(fā)生。

3.4 結(jié)論

本研究成功建立了枯草芽孢桿菌SEM-9菌株的GFP標(biāo)記方法，明確了該菌株的根際定植規(guī)律及其對(duì)黃瓜土傳病害的防治效果，為后期開發(fā)替代型微生物肥料奠定了基礎(chǔ)。