茄科雷爾氏菌IMSA-LAMP檢測方法的建立

袁 婷，羅龍輝，張雪吟，劉吉平

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院/亞太地區(qū)蠶桑培訓(xùn)中心, 廣東 廣州 510642)

桑樹是一種藥食同源的多年生木本植物，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、畜牧養(yǎng)殖等各個行業(yè)中[1-3]。桑樹病害的發(fā)生一直制約著蠶桑產(chǎn)業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展，其中，桑樹青枯病作為一種毀滅性的細(xì)菌性檢疫病害，嚴(yán)重影響了桑樹的產(chǎn)量和質(zhì)量[4]。1969年廣東省順德市首次報道了桑樹青枯病的發(fā)生[5]，隨后傳播至廣東大部分的桑樹種植區(qū)。至今，桑青枯病仍在廣東、廣西等地的蠶桑主產(chǎn)區(qū)流行發(fā)生，并在全國范圍內(nèi)的桑園種植地多有發(fā)生報道[6-7]。桑樹青枯病的病原菌為茄科雷爾氏菌Ralstonia solanacearum，茄科雷爾氏菌的寄主范圍廣，能感染桑樹在內(nèi)的450余種植物的根或莖，根據(jù)其對不同寄主致病性差異的分類報道，侵染桑樹的茄科雷爾氏菌多為5號生理小種[8-9]。由于茄科雷爾氏菌種類多，存在不同的致病變種，且致病機(jī)理復(fù)雜又危害嚴(yán)重，被世界各國的檢疫部門列入植物生產(chǎn)和出口貿(mào)易的重點檢疫對象[10-12]。

建立高效快速的桑樹青枯病病原茄科雷爾氏菌檢測技術(shù)，不僅對桑樹苗木的流通和檢疫提供技術(shù)支持、為桑樹產(chǎn)業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展保駕護(hù)航，還對各種作物青枯病的防控有重要的參考價值。目前，有關(guān)青枯病的病原菌茄科雷爾氏菌的分子檢測技術(shù)主要有各種的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法[13-14]和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增 (Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)[15]。然而這2種檢測技術(shù)在實際應(yīng)用中均存在一定的局限性，如PCR法檢測時間相對較長，靈敏度低，在桑樹青枯病的檢測中效果不明顯[16]；而LAMP技術(shù)雖有檢測靈敏度高、反應(yīng)時間短等優(yōu)點，但環(huán)境的氣溶膠往往影響檢測結(jié)果的可靠性或引起假陽性[17-18]。等溫多自配引發(fā)擴(kuò)增 (Isothermal multiple self-matching-initiated amplification，IMSA)技術(shù)是2015年馬學(xué)軍團(tuán)隊發(fā)明的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)[19-20]，該技術(shù)主要針對靶基因設(shè)計6條引物，并能特異性地識別7個基因位點，與LAMP和熒光定量PCR相比具有更強(qiáng)的特異性及更高的靈敏度，在食品安全、動物健康養(yǎng)殖、人畜共患病病原的檢測應(yīng)用中證實是可靠的[21-24]，但有關(guān)IMSA檢測植物病原菌特別是桑樹青枯病病原的報道較少。

本研究擬以茄科雷爾氏菌果膠裂解酶基因(Pectate lyase gene)為靶標(biāo)，嘗試融合IMSA引物設(shè)計策略和LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的技術(shù)體系，建立一種快速高效的茄科雷爾氏菌IMSA-LAMP檢測技術(shù)，并對其反應(yīng)體系和實用性等進(jìn)行優(yōu)化，以期為桑樹細(xì)菌病檢測、桑樹青枯病檢疫和桑樹種苗的流通提供新的檢測技術(shù)和手段。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2020—2021年從廣東、廣西兩地的桑園采集了疑似桑青枯病癥狀的莖及根共24份，如表1所示。

表1 桑樹青枯病田間病樣Table 1 Field samples of mulberry bacterial wilt

桑青枯病病原菌茄科雷爾氏菌菌株YZqk1、YLqk1(GDMCC No.：1.1615)、XZqk2(GDMCC No.：1.1619)、XCqk4(GDMCC No.：1.1616)、LZqk5(GDMCC No.：1.1617)、YDqk6(GDMCC No.：1.1620)和其他桑源細(xì)菌菌株：陰溝腸桿菌XCYG-001(GDMCC No.：1.1600)、克雷伯氏菌 LCKL-001(GDMCC No.：1.1602)、菠蘿泛菌 LCFJ-001(GDMCC No.：1.1601)、銅綠假單胞菌 YD-001(GDMCC No.：60613)、丁香假單胞菌 ZJDX-003(GDMCC No.：61844)、多黏類芽孢桿菌 YD-002(GDMCC No.：61095)、短小桿菌 YDDX-001、芽孢桿菌YD-003，均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)亞太地區(qū)蠶桑培訓(xùn)中心實驗室分離鑒定，含GDMCC No.的菌種由廣東省菌種保藏中心保藏。

1.2 供試菌株培養(yǎng)

30 ℃條件下，將茄科雷爾氏菌菌株置于TTC瓊脂培養(yǎng)基[25]培養(yǎng)5 d，將非茄科雷爾氏菌菌株接種于LB瓊脂培養(yǎng)基[25]培養(yǎng)2 d。

1.3 細(xì)菌、疑似桑樹青枯病病樣及健康桑樹DNA提取

供試細(xì)菌根據(jù)Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司，以下簡稱為“生工”]說明書提取總DNA。供試病樣及健康桑樹樣本根據(jù)Ezup柱式植物總DNA抽提試劑盒(生工)說明書提取總DNA。DNA提取后，利用超微量分光光度計(NDlife)進(jìn)行濃度測定，用TE緩沖液稀釋到10 ng/μL左右，-20 ℃保存?zhèn)溆?，作為后續(xù)檢測的模板。

1.4 IMSA-LAMP引物設(shè)計與合成

IMSA-LAMP引物設(shè)計，如圖1A所示，在IMSA-LAMP檢測中使用了6種引物，包括2種莖引物(SteF和SteR)和2對嵌套雜交引物(2個外引物DsF和DsR和2個內(nèi)引物FIT和RIT)；引物特異性識別靶基因的7個不同區(qū)域，從5′端標(biāo)記為F3、F2、F1、T、R1c、R2c和 R3c；DsF 和 DsR 引物由F3和R3以及F1c和R1c序列組成，F(xiàn)IT和RIT引物由F2和R2以及Tc和T序列組成，SteF和SteR引物分別是R1c和F1c序列[26]。IMSA-LAMP擴(kuò)增原理如圖1B所示，為便于說明，DNA合成從DsF開始，F(xiàn)IT被設(shè)置為起始過程(DNA合成以類似方式在DsR和RIT中進(jìn)行)；帶箭頭的水平直線代表底物延長方向，帶箭頭的斜線代表與目標(biāo)位點退火的引物，帶箭頭的弧線表示2個區(qū)域的自動匹配。在該步驟中，生成了4種不同長度的基本自匹配結(jié)構(gòu)(SMS-1～SMS-4)[26]。根據(jù)NCBI報道的茄科雷爾氏菌果膠裂解酶基因(WP_197360060.1)序列，利用引物在線設(shè)計軟件(http://primerexplorer.jp/elamp 5.0.0/index.html)設(shè)計之后，根據(jù)引物可能存在的二聚體和相近的退火溫度，調(diào)整并設(shè)計出6套IMSALAMP檢測的引物組。所有引物均由擎科生物有限公司合成，引物均用HPLC法純化，引物序列見表2。

圖1 IMSA-LAMP引物設(shè)計(A)及擴(kuò)增(B)示意圖[26]Fig. 1 Schematic diagram of primer design (A) and amplification (B) for IMSA-LAMP [26]

表2 用于擴(kuò)增茄科雷爾氏菌果膠裂解酶基因的引物序列Table 2 Primer sequences used for amplifying pectate lyase genes of Ralstonia solanacearum

1.5 IMSA-LAMP反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

以提取的供試細(xì)菌、疑似桑樹青枯病病樣及健康桑樹樣本DNA為模板，對茄科雷爾氏菌果膠裂解酶基因片段進(jìn)行熒光定量PCR特異性擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：2× LAMP Master Mix 12.5 μL(生工)，DNA Polymerase 0.5 μL(生工)，Sterilized ddH2O 8.0 μL(生工)，5×103mmol SYTOTM9 核酸染料 1 μL(Thermo Fisher Scientific)，引物 Mix 1.0 μL(外引物、莖引物、內(nèi)引物體積比為 1∶4∶8)，DNA 模板 2.0 μL，共 25.0 μL。反應(yīng)程序：63 ℃ 1 min，80 ℃ 1 min；將63 ℃ 1 min作為1個循環(huán)，設(shè)計45個循環(huán)。

1.6 IMSA-LAMP引物特異性

為了驗證“1.4”篩選的引物檢測桑樹青枯病病菌的特異性，以桑源茄科雷爾氏菌及非茄科雷爾氏菌菌株進(jìn)行IMSA-LAMP引物特異性試驗，以健康桑樹DNA作為陰性對照、無菌水為空白對照、茄科雷爾氏菌DNA為陽性對照，反應(yīng)條件同“1.5”。

1.7 IMSA-LAMP不同引物濃度比例優(yōu)化

為保證茄科雷爾氏菌DNA能在IMSALAMP體系中達(dá)到最佳擴(kuò)增效果，在上述“1.5”反應(yīng)擴(kuò)增體系基礎(chǔ)上，對引物比例進(jìn)行篩選。以10 ng/μL的茄科雷爾氏菌YZqk1 DNA為模板，以“1.6”最佳引物組為擴(kuò)增引物，設(shè)置4組不同的引物濃度比例，即外引物(100 μmol/L)、莖引物(100 μmol/L)、內(nèi)引物 (100 μmol/L)體積比依次為1∶4∶8、1∶2∶4、1∶1∶2、1∶8∶4，見表3。使用熒光定量PCR儀進(jìn)行IMSA-LAMP擴(kuò)增，根據(jù)起始擴(kuò)增時間及熒光強(qiáng)度等選擇最佳引物濃度比例。

表3 外、莖、內(nèi)引物體積配比Table 3 Volume ratio of outer, stem and inner primers μL

1.8 IMSA-LAMP反應(yīng)溫度優(yōu)化

以10 ng/μL的茄科雷爾氏菌YZqk1 DNA為模板，在 61.5、62.0、62.5、63.0、63.5、64.0、64.5和65.0 ℃ 8個反應(yīng)溫度下，通過熒光定量PCR儀進(jìn)行IMSA-LAMP擴(kuò)增，反應(yīng)體系見“1.5”。通過比較不同反應(yīng)溫度的熒光擴(kuò)增曲線，獲得最佳反應(yīng)溫度。

1.9 IMSA-LAMP檢測法與PCR法的靈敏度對比

將茄科雷爾氏菌YZqk1純培養(yǎng)后置于25 mL LB肉湯中擴(kuò)增培養(yǎng)，于28 ℃條件下培養(yǎng)48 h，用稀釋涂布計數(shù)方法將菌液濃度稀釋成1×106CFU/mL，取1 mL于離心機(jī)中12 000 r/min離心4 min，取沉淀，根據(jù)Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取總DNA。利用超微量分光光度計進(jìn)行濃度測定，按10倍稀釋法用TE緩沖液將DNA梯度稀釋7次，具體計算公式：稀釋后DNA濃度=稀釋前DNA濃度÷10稀釋次數(shù)，將每個梯度作為模板進(jìn)行IMSA-LAMP檢測，反應(yīng)體系見“1.5”。選擇優(yōu)化后的引物、引物濃度比例及反應(yīng)溫度，根據(jù)熒光擴(kuò)增曲線判定檢測結(jié)果；同時，采用Primer Premier 5.0軟件對茄科雷爾氏菌果膠裂解酶基因設(shè)計1對PCR檢測引物：PL-F(AGCTTGCTCGCTTTGAGCTGCTGCAAGACC)/PL-R(TGATCGCCCGAACAACCATTTCCAGA CGCC)，擬擴(kuò)增的目的片段長度為135 bp，并利用該引物對模板進(jìn)行PCR檢測，反應(yīng)體系為2× Taq PCR Master Mix 12.5 μL(生工)，10 μmol/L 引物 PLF、PL-R 各 1 μL，DNA 模板 2 μL，Sterilized ddH2O補(bǔ)足至25 μL；擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性 30 s、55 ℃ 退火 30 s、72 ℃ 延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 最終延伸 8 min，于4 ℃ 保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物取5 μL經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.10 IMSA-LAMP檢測方法的驗證

將廣東、廣西地區(qū)收集的24份疑似桑樹青枯病病樣(表1)提取DNA后，進(jìn)行IMSA-LAMP檢測，并取1份健康桑樹樣本為陰性對照、茄科雷爾氏菌YZqk1 DNA為陽性對照。反應(yīng)體系見“1.5”，其中引物、引物濃度比例及反應(yīng)溫度均選擇優(yōu)化后的結(jié)果，并通過熒光擴(kuò)增曲線進(jìn)行判讀；同時利用“1.9”的PCR反應(yīng)體系和參數(shù)進(jìn)行同步平行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 IMSA-LAMP引物篩選

將本研究設(shè)計的6組引物(表2)進(jìn)行IMSALAMP檢測，檢測結(jié)果如圖2所示。引物組1～6均出現(xiàn)了擴(kuò)增曲線，引物組6于反應(yīng)20 min時最先出現(xiàn)上升趨勢，35 min后反應(yīng)進(jìn)入平緩期；而其他引物組均在反應(yīng)25 min后才出現(xiàn)擴(kuò)增。因此，選擇引物組6作為IMSA-LAMP法最佳引物組；最佳引物組6的6條引物結(jié)合位置及7個特異識別位點，如圖3所示。

圖2 IMSA-LAMP 6組引物對茄科雷爾氏菌的檢測結(jié)果Fig. 2 Detection results of Ralstonia solanacearum under six primer groups of IMSA-LAMP

圖3 IMSA-LAMP引物組6的6條檢測引物的位置及7個特異識別位點Fig. 3 Locations of six primers of primer group 6 and their seven specific recognition sites in IMSA-LAMP

2.2 IMSA-LAMP引物特異性試驗

利用IMSA-LAMP對6株茄科雷爾氏菌及8株非茄科雷爾氏菌DNA進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖4所示。6株茄科雷爾氏菌(YZqk1、YLqk1、XZqk2、XCqk4、LZqk5、YDqk6)均在 45 min內(nèi)出現(xiàn)了“S”擴(kuò)增曲線(圖4：曲線1～6)。其他8株非茄科雷爾氏菌、無菌水及健康桑樹DNA均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線 (圖4：曲線 7～17)。表明，IMSA-LAMP檢測方法篩選的引物能有效地檢測茄科雷爾氏菌。

圖4 茄科雷爾氏菌IMSA-LAMP特異性檢測結(jié)果Fig. 4 Specific detection results of IMSA-LAMP forRalstonia solanacearum

2.3 IMSA-LAMP 引物濃度比例優(yōu)化

設(shè)置外、莖、內(nèi)引物濃度比例為 1∶4∶8、1∶2∶4、1∶1∶2、1∶8∶4，以 10 ng/μL 的茄科雷爾氏菌 YZqk1 DNA為模板進(jìn)行IMSA-LAMP擴(kuò)增，擴(kuò)增溫度為63 ℃，反應(yīng)時間為45 min，結(jié)果如圖5所示。4種不同引物濃度比例均出現(xiàn)了“S”曲線，當(dāng)外、莖、內(nèi)引物濃度比例為1∶4∶8時，起始擴(kuò)增時間最短，為12 min，25 min到達(dá)擴(kuò)增的平緩期；當(dāng)外、莖、內(nèi)引物濃度比例為1∶8∶4時，起始擴(kuò)增時間為14 min，30 min達(dá)平緩期；當(dāng)外、莖、內(nèi)引物濃度比例為1∶2∶4 時，起始擴(kuò)增時間為 23 min，35 min 達(dá)到平緩期；當(dāng)外、莖、內(nèi)引物濃度比例為1∶1∶2時，起始擴(kuò)增時間為25 min，45 min內(nèi)未出現(xiàn)平緩期。最終可確定最佳外、莖、內(nèi)引物比例為1∶4∶8。

圖5 不同外、莖、內(nèi)引物濃度比例下茄科雷爾氏菌IMSA-LAMP檢測結(jié)果Fig. 5 IMSA-LAMP detection results of Ralstonia solanacearum under different concentration ratios of outer, stem and inner primers

2.4 IMSA-LAMP反應(yīng)溫度優(yōu)化

根據(jù)最佳引物比例進(jìn)行IMSA-LAMP反應(yīng)溫度篩選，設(shè)置溫度梯度為 61.5、62.0、62.5、63.0、63.5、64.0、64.5及 65.0 ℃，結(jié)果如圖6所示。在61.5～65.0 ℃時，均有擴(kuò)增曲線。在64.5 ℃時，起始擴(kuò)增時間最短，為13 min，于24 min到達(dá)擴(kuò)增的平緩期；在65.0 ℃時，在14 min曲線開始擴(kuò)增，于25 min達(dá)到擴(kuò)增平緩期；在61.5～64.0 ℃時，均在反應(yīng)15 min后開始擴(kuò)增，于30 min后達(dá)到擴(kuò)增平緩期。故選擇64.5 ℃作為最佳反應(yīng)溫度。

圖6 不同反應(yīng)溫度茄科雷爾氏菌IMSA-LAMP檢測結(jié)果Fig. 6 Detection results of IMSA-LAMP for Ralstonia solanacearum at different reaction temperatures

2.5 IMSA-LAMP法的靈敏度

茄科雷爾氏菌YZqk1純培養(yǎng)后，取1 mL 1×106CFU/mL的菌懸液，根據(jù)Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取總DNA，并利用超微量分光光度計進(jìn)行濃度測定，其DNA質(zhì)量濃度為2 ng/μL，10倍濃度梯度稀釋7次，DNA質(zhì)量濃度為 2 ng/μL～200 ag/μL，對應(yīng)菌為 1×106～1×10-2CFU/mL，將每個梯度作為模板進(jìn)行IMSALAMP檢測，并利用PCR進(jìn)行平行檢測作為對照。IMSA-LAMP檢測結(jié)果如圖7所示，茄科雷爾氏菌YZqk1 DNA 質(zhì)量濃度為 2 ng/μL～200 fg/μL(對應(yīng)菌為 1×106～1×102CFU/mL)，均出現(xiàn)了擴(kuò)增曲線；而DNA 質(zhì)量濃度在 20 fg/μL～200 ag/μL(對應(yīng)菌為1×10～1×10-2CFU/mL)未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。因此，IMSA-LAMP對茄科雷爾氏菌最低DNA檢測質(zhì)量濃度為200 fg/μL，對應(yīng)菌為1×102CFU/mL。另外，PCR檢測到的桑樹茄科雷爾氏菌YZqk1最低DNA質(zhì)量濃度為 20 pg/μL，對應(yīng)菌為 1×104CFU/mL(圖8)。IMSA-LAMP檢測桑樹茄科雷爾氏菌具有良好的靈敏度，是PCR的100倍。

圖7 IMSA-LAMP對茄科雷爾氏菌靈敏度的檢測結(jié)果Fig. 7 Sensitivity test results of IMSA-LAMP for Ralstonia solanacearum

圖8 PCR對茄科雷爾氏菌靈敏度檢測結(jié)果Fig. 8 Sensitivity test results of PCR for Ralstonia solanacearum

2.6 IMSA-LAMP法對生產(chǎn)樣本的檢測

將收集的24份疑似桑樹青枯病病樣提取DNA后，利用IMSA-LAMP法與PCR法進(jìn)行試驗，評估2種檢驗方法的檢測結(jié)果。IMSALAMP檢測結(jié)果如圖9所示，收集的疑似桑樹青枯菌病樣中，有21份樣本出現(xiàn)了“S”擴(kuò)增曲線(曲線2～22)，廣西壯族自治區(qū)環(huán)江市及忻城市3份疑似桑樹青枯病病樣未出現(xiàn)擴(kuò)增現(xiàn)象(曲線23～25)，檢出率為87.5%。同步進(jìn)行的PCR法，其中9份樣品為陽性，15份樣品為陰性(圖10)，檢出率為37.5%，9份PCR檢測陽性的樣本在IMSALAMP法檢測結(jié)果中也為陽性，說明2種方法有一定的重復(fù)性，但I(xiàn)MSA-LAMP法的檢出率明顯高于PCR。

圖9 IMSA-LAMP對不同地區(qū)疑似桑樹青枯病病樣的檢測結(jié)果Fig. 9 Detection results of suspected mulberry bacterial wilt samples from different districts by IMSALAMP

圖10 PCR對不同地區(qū)疑似桑樹青枯病病樣的檢測結(jié)果Fig. 10 Detection results of suspected mulberry bacterial wilt samples from different districts by PCR

3 討論與結(jié)論

桑樹青枯病作為一種毀滅性的細(xì)菌性病害，被國家列為重點檢疫對象[27]。建立一種桑樹茄科雷爾氏菌快速有效的檢測方法，對預(yù)防桑樹青枯病的發(fā)生和擴(kuò)散具有重要的意義。桑樹青枯病病原檢測方法分為傳統(tǒng)分離技術(shù)及分子檢測技術(shù)。傳統(tǒng)分離技術(shù)主要是通過病樣組織分離病原菌的方式分離出桑樹茄科雷爾氏菌，但操作繁瑣，分離時間長，結(jié)果受人為影響大；隨著分子檢測技術(shù)的快速發(fā)展，核酸檢測技術(shù)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療診斷、動植物安全生產(chǎn)、食品安全及動植物檢疫等檢測中，大大提高檢測效率[28-30]。其中，LAMP是常見的核酸檢測技術(shù)，本研究前期將LAMP技術(shù)應(yīng)用于蠶、桑病害的檢測研究，能有效檢測出蠶桑病毒、細(xì)菌及真菌等病原物[31-33]。而IMSA技術(shù)的優(yōu)點在于引物結(jié)合位點多，相較于LAMP技術(shù)擁有更高的靈敏度及特異性。Chen等[34]應(yīng)用IMSA法對牛奶樣品中金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus進(jìn)行檢測，靈敏度比LAMP方法高10倍；Liu等[35]對人畜共患病病原腸毒素大腸埃希菌(EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC)進(jìn)行了IMSA的檢測應(yīng)用研究，相比于熒光定量PCR、LAMP、交叉引物等溫擴(kuò)增技術(shù)具有更高的靈敏度。同樣地，本研究將LAMP反應(yīng)體系與IMSA引物設(shè)計原理相結(jié)合應(yīng)用于桑樹青枯病的茄科雷爾氏菌檢測，試驗結(jié)果顯示，IMSALAMP檢測技術(shù)明顯優(yōu)于PCR的檢測結(jié)果，本方法節(jié)約時間，且結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

果膠酶是一類分解果膠物質(zhì)的酶的總稱，在細(xì)菌生長和繁殖代謝過程中都能合成，而果膠裂解酶基因在青枯菌侵染植物過程中發(fā)揮了重要作用[36-37]。本研究在以NCBI登錄的茄科雷爾氏菌基因組分析的基礎(chǔ)上，以茄科雷爾氏菌果膠裂解酶基因(WP_197360060.1)序列為靶基因序列，進(jìn)行了引物設(shè)計與篩選，經(jīng)試驗結(jié)果比較確定引物組6為最終的檢測引物組。通過對茄科雷爾氏菌及桑源其他細(xì)菌的進(jìn)行IMSA-LAMP檢測，發(fā)現(xiàn)僅有茄科雷爾氏菌DNA樣本出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，表明本研究建立的IMSA-LAMP檢測技術(shù)特異性明顯。對反應(yīng)溫度及引物比例進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明外、莖、內(nèi)引物濃度比例為1∶4∶8，恒溫64.5 ℃的熒光定量PCR儀在45 min內(nèi)可完成檢測，該方法比常規(guī)PCR方法快60 min以上，反應(yīng)結(jié)果可通過熒光擴(kuò)增曲線出現(xiàn)的先后進(jìn)行快速判定，本研究建立的IMSA-LAMP法檢測茄科雷爾氏菌DNA最低質(zhì)量濃度達(dá)200 fg/μL，對應(yīng)的菌為1×102CFU/mL，比Okiro等[38]與李信申等[39]報道的青枯病LAMP檢測方法的靈敏度高10倍左右，是常規(guī)PCR檢測法靈敏度的100倍，同樣的結(jié)果在Gou等[40]使用IMSA檢測豬圓環(huán)病毒PCV3的應(yīng)用中得到佐證。

在對采自田間的24份疑似桑樹青枯病樣本檢測中，IMSA-LAMP檢測出21份樣本，3份樣本未檢測出桑茄科雷爾氏菌；同時利用PCR法對24份病樣進(jìn)行平行檢測，PCR僅檢測出9份，這9份樣本也同時印證了IMSA-LAMP的檢測結(jié)果。對于其他IMSA-LAMP檢測出而PCR未能檢測出的陽性樣本，我們分析有2種原因，一是說明IMSALAMP檢測方法更加靈敏，這個推測已經(jīng)在本研究純茄科雷爾氏菌模板檢測中得到驗證；二是說明導(dǎo)致桑樹青枯和枯萎癥狀的病原菌種類很多，本研究課題組已經(jīng)相繼在桑樹枯萎的病樣中分離出陰溝腸桿菌[25,41]、菠蘿泛菌[42]及克雷伯氏菌[43]。而陰溝腸桿菌、菠蘿泛菌及克雷伯氏菌作為機(jī)會性植物致病病原菌，在生產(chǎn)中導(dǎo)致植物枯萎的機(jī)理仍有待深入研究。綜上，本研究建立的茄科雷爾氏菌的IMSA-LAMP檢測方法準(zhǔn)確可靠，可用于大批量桑樹青枯病的快速分子診斷，為桑樹細(xì)菌病檢測和防疫提供了新技術(shù)支持。

致謝：試驗過程中得到華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院碩士研究生孟芳、王亞琴等的幫助，LAMP檢測試劑得到廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司張璜博士與林夢蝶實驗員的大力支持。