4 株鏈霉菌的鑒定及抑菌活性研究

高玉婷，鄧 巍，張 發(fā)，李飛騰，3，楊曉燕，佘 容*

（1.大理大學東喜瑪拉雅研究院，云南大理 671003；2.大理大學農(nóng)學與生物科學學院，云南大理 671003；3.大理大學公共衛(wèi)生學院，云南大理 671000）

自1928 年弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素以來，人類就開啟了抗生素時代，并由此改變了現(xiàn)代醫(yī)學的進程，使得醫(yī)生可以治療足以致命的細菌感染，挽救了無數(shù)人的生命，使人類的平均壽命延長到了77 歲〔1-3〕。同時，抗生素在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中也發(fā)揮了極大的作用，如防治動植物病害、刺激植物生長〔4〕、作為獸類藥物使用等〔5-7〕，甚至有部分放線菌產(chǎn)生的抗生素還可作為農(nóng)業(yè)除草劑使用〔8〕。

由于抗生素在人類醫(yī)療、畜牧、農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)等方面的廣泛使用和耐藥基因可在細菌間橫向轉(zhuǎn)移的特點，使得許多細菌對現(xiàn)有抗生素產(chǎn)生了不同程度的耐藥性〔9〕，抗生素的治療效果顯著降低，耐藥菌株甚至超級細菌開始出現(xiàn)〔10〕?！?018 年CHINET中國細菌耐藥性監(jiān)測》中指出，中國臨床分離菌對常見抗菌藥物的耐藥率仍呈增長趨勢〔11〕。面對細菌耐藥這一世紀難題，人類已意識到問題的嚴重性，并加強了對抗生素使用的管理，盡量減少或避免使用抗生素〔12〕。另一方面，為解決已經(jīng)出現(xiàn)的耐藥問題，人類也在積極開發(fā)新的抗生素或抗生素的替代物〔13-14〕。

放線菌是自然界廣泛分布的一類高（G+C）含量、大多數(shù)呈革蘭氏陽性的單細胞原核微生物，多為腐生好氧、少數(shù)為寄生厭氧型〔15〕。它們能夠分解有機質(zhì)，在自然界的物質(zhì)循環(huán)中起重要作用；同時能夠產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，如抗生素、免疫調(diào)節(jié)劑、植物病原真菌抑制劑、酶制劑等〔16〕。截至目前，人類發(fā)現(xiàn)的幾千種抗生素中，70% 以上由放線菌產(chǎn)生〔17〕。而且越來越多的全基因組測序結(jié)果顯示，放線菌基因組內(nèi)包含極為豐富的天然產(chǎn)物生物合成基因簇資源，這預示放線菌仍然是人類抗生素研發(fā)的巨大寶庫〔18-20〕。本研究從實驗室土壤微生物監(jiān)測工作中發(fā)現(xiàn)了4 株對霉菌具有明顯抑菌能力的放線菌，故對其進行了分離、鑒定，并開展了抑菌活性研究，以確定其作為抗生素開發(fā)資源菌株的可能性。

1 材料

1.1 菌株

1.1.1 受試菌株 從被污染的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)、自然狀態(tài)下對霉菌有較強抑制能力的灰黃鏈霉菌（Streptomyces flavogriseus），經(jīng)分離純化后共得到4株菌（DL002、DL003、DL004、DL005），現(xiàn)保存于大理大學東喜瑪拉雅研究院種質(zhì)資源庫。

1.1.2 指示菌株 革蘭氏陰性菌：銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，BNCC337005）、大腸埃希菌（Escherichia coli ，BNCC133264）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris，BNCC340151）、胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora，BNCC138474）；革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，BNCC186335）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus，BNCC102589）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，BNCC109047）；真菌：黑曲霉（Aspergillus niger，BNCC186380）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani，BNCC189975）、白色假絲酵母（Candia albicans，BNCC336485）、新型隱球酵母（Crypto-coccus neoformans，BNCC225501），以上菌株均購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；另有編號為MM-1 的枝孢屬（Cladosporium）霉菌1 株（為本實驗室從發(fā)現(xiàn)放線菌菌株DL002 的原始平板上分離純化，經(jīng)形態(tài)和分子生物學鑒定為枝孢屬（Cladosporium）霉菌）。所有菌株均保存于大理大學東喜瑪拉雅研究院種質(zhì)資源庫。

1.2 培養(yǎng)基改良高氏1 號培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、玉米培養(yǎng)基、YM 培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、改良高氏1 號液體培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，均參照文獻〔21〕進行配制。

2 方法

2.1 受試菌株的分離純化用接種環(huán)挑取菌體，以3 區(qū)劃線法接種于改良高氏1 號培養(yǎng)基中，26 ℃培養(yǎng)4~7 d，連續(xù)劃線純化3 次，鏡檢確認獲得純培養(yǎng)物后甘油管藏法保種。

2.2 受試菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定 將獲得的各菌株的純培養(yǎng)物接種于改良高氏1 號培養(yǎng)基上，觀察菌落形態(tài)特征，并對其進行革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)特征，參照《放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類》進行形態(tài)鑒定。

2.2.2 分子生物學鑒定 通過16S rRNA 序列同源性比對和系統(tǒng)發(fā)育分析方法進行分子鑒定。具體方法如下：

（1）基因組DNA 提?。河肊zup 柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒提取基因組DNA。

（2）目的序列的PCR 擴增：以細菌16S rRNA基因通用引物27F/1492R 擴增16S rRNA 序列；PCR 擴增反應體系（50 μL）：PCR Buffer（10×）5 μL，MgCl2（25 mmol/μL）5 μL，dNTP（10 mmol）1.5 μL，Taq DNA 聚合酶0.6 μL，上游引物（10 μmol/μL）1.5 μL，下游引物（10 μmol/μL）1.5 μL，DNA 模板2 μL，無菌超純水33 μL；PCR 擴增反應條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性45 s，54 ℃復性1 min，72 ℃延伸2.5 min，共32 個循環(huán)，72 ℃補平延伸10 min。

（3）PCR 產(chǎn)物直接檢測及測序：采用瓊脂糖凝膠電泳法對PCR 擴增產(chǎn)物進行檢測，操作參照文獻〔22〕進行，PCR 產(chǎn)物委托生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

（4）DNA 序列同源性比對：將所測得的DNA 序列導入NCBI 網(wǎng)站中用Blast 工具進行同源性比對，下載親緣關(guān)系較近物種（同源性高于97%）的16S rRNA 序列用于系統(tǒng)發(fā)育分析以確定所屬物種。

（5）系統(tǒng)發(fā)育分析：選擇親緣關(guān)系較近的鏈霉菌屬物種（29 株）用于系統(tǒng)發(fā)育分析，部分16S rRNA 數(shù)據(jù)集包括1 377 個堿基，其中保守位點1 017 個，變化位點217 個，簡約信息位點87 個。將下載好的待分析序列文件導入Mafft version 7 軟件中生成16S rRNA 多序列比對矩陣，用Bioedit v7.2.3 工具分別對多序列比對矩陣進行手動調(diào)整以提高其準確度，用Jmodeltest v2.1.10 軟件對序列矩陣的最佳核酸替代模型進行選擇；在IQ-Tree v1.6.5軟件中用最大似然法（maximum likelihood method，ML）對系統(tǒng)發(fā)育樹進行構(gòu)建；最后用FigTree v1.3.1、Word 和Photoshop 軟件對上一步生成的系統(tǒng)發(fā)育樹進行后期加工和美化。

2.3 受試菌株抑菌活性測定

2.3.1 絲狀真菌指示菌株的抑菌活性測定 在綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板中同時接入受試菌株和立枯絲核菌（R.solani），接種位點相距2.5 cm；在馬丁培養(yǎng)基中同時接入受試菌株和黑曲霉（A.niger），接種位點相距2.5 cm，26 ℃培養(yǎng)，每天觀察菌株生長情況2 次，記錄實驗結(jié)果，實驗結(jié)果以3 次重復的平均值表示。

2.3.2 單細胞真菌指示菌株的抑菌活性測定 受試菌株種子液制備：勾取受試菌株菌體，接入改良高氏1 號液體培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min 搖床培養(yǎng)4 d，備用。

白色假絲酵母（C.albicans）種子液制備：勾取菌體接入改良馬丁液體培養(yǎng)基中，35 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)24 h 后，用無菌改良馬丁液體培養(yǎng)基稀釋至1.5 麥氏比濁度，備用。

新型隱球酵母（C.neoformans）種子液制備：使用YM 液體培養(yǎng)基，制備方法與白色假絲酵母種子液相同。

抑菌活性測定：將無菌濾紙片（φ=8 mm）浸泡至受試菌株種子液中培養(yǎng)24 h 后備用；吸取受試菌株稀釋液200 μL 至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板，涂布，再將浸有受試菌株種子液的濾紙片貼至其上，每個平板貼3 片，相距2.5 cm。28 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔8 h 觀察抑菌圈并測定其大小，實驗結(jié)果以3 次重復的平均值表示。

2.3.3 細菌指示菌株的抑菌活性測定 受試菌株種子液制備：按“2.3.2”項下方法制備。

細菌指示菌株種子液制備：使用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，制備方法與“2.3.2”項下白色假絲酵母種子液相同。

抑菌活性測定：按“2.3.2”項下方法測定。

3 結(jié)果

3.1 受試菌株鑒定結(jié)果形態(tài)鑒定結(jié)果：測試的4株放線菌菌株（DL002、DL003、DL004、DL005）均為革蘭氏陽性菌；在改良高氏1 號培養(yǎng)基中形成的菌落形態(tài)均不規(guī)則，表面干燥粗糙；生長12 周后逐漸變?yōu)榛疑?/p>

分子生物學鑒定結(jié)果：成功獲得4 株待測菌株16S rRNA 部分序列，上傳至GenBank 數(shù)據(jù)庫（序列號 分 別 為 DL002：MZ216706；DL003：MZ216707；DL004：MZ216708；DL005：MZ216709），4 株待測菌與黃灰鏈霉菌相似度都達到99%，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示這4 株菌與灰黃鏈霉菌聚為1 支（自舉檢測支持度為88%），確定其為該種屬菌株。見圖1。

圖1 鏈霉菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹

3.2 受試菌株抑菌活性篩查結(jié)果

3.2.1 對真菌的抑菌活性 受試菌株DL002 對新型隱球酵母有抑菌活性，對白色假絲酵母無抑菌活性，而受試菌株DL003、DL004、DL005 對新型隱球酵母和白色假絲酵母均無抑菌活性。見表1。

表1 受試菌株對單細胞真菌的抑菌效果（抑菌圈直徑/菌落直徑）

4 株受試菌株對黑曲霉、立枯絲核菌及枝孢屬霉菌MM-1 均有明顯的抑制作用，且都能抑制黑曲霉產(chǎn)孢。見表2、圖2。

圖2 菌株對黑曲霉產(chǎn)孢的抑制效果（A）和立枯絲核菌的抑菌效果（B）圖

表2 受試菌株對絲狀真菌的抑菌效果

測試的4 株菌株與枝孢屬霉菌MM-1 在玉米培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d 后均開始出現(xiàn)抑制MM-1 生長的現(xiàn)象，培養(yǎng)至14 d，DL002 對MM-1 的抑制現(xiàn)象最為明顯。見圖3。

圖3 DL002 對枝孢屬霉菌MM-1 的抑菌效果圖

3.2.2 對細菌的抑菌活性 4 株受試菌株對枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌以及銅綠假單胞菌的生長均有抑制作用；菌株DL002 對普通變形桿菌及枯草芽孢桿菌抑制效果最好，抑菌圈直徑達35 mm。4 株菌株對金黃色葡萄球菌均無抑制效果。見表3、圖4。

表3 受試菌株對細菌的抑菌效果（抑菌圈直徑/菌落直徑）

圖4 菌株對部分細菌的抑制效果圖

4 討論

本研究分離得到的4 株放線菌菌株DL002、DL003、DL004、DL005 均為黃灰鏈霉菌。經(jīng)抑菌活性檢測確認，4 株菌對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及真菌均具有廣泛的抗菌活性，對黑曲霉的產(chǎn)孢均有抑制作用。其中，菌株DL002 對黑曲霉的產(chǎn)孢抑制作用最強。部分黑曲霉會侵染農(nóng)作物及水果〔23-25〕，病害嚴重時會導致農(nóng)作物顯著減產(chǎn)，甚至絕收〔26〕。同時，菌株DL002 對普通變形桿菌的抑制作用非常顯著，普通變形桿菌在夏秋季節(jié)引起食物中毒的能力僅次于沙門氏菌（salmonella）〔27〕，因此，DL002 號菌株可以作為開發(fā)新型抑菌藥物的優(yōu)選菌株。

鏈霉菌是目前放線菌中產(chǎn)生抗生素等活性物質(zhì)種類最多的菌種，至今各國研究者仍在不斷地從鏈霉菌屬中篩選新的天然生物活性物質(zhì)〔28〕。研究表明，大多數(shù)的鏈霉菌都具有酶活性、抗菌活性及廣譜抗菌性〔29〕，對細菌性病原菌金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌和黑曲霉均能表現(xiàn)出明顯的抑制效果〔30-31〕。但本實驗中分離得到的4 株黃灰鏈霉菌均對金黃色葡萄球菌無抑制活性，且4 株菌株對同一種病原菌的抑制活性存在較大差異，說明同種不同株的黃灰鏈霉菌菌株之間抗菌性能差異較大。這可能是菌株生境不同導致，也可能是在相同環(huán)境中不同菌株間生理性狀不同而產(chǎn)生的基因或代謝水平上的表達差異所致〔32-33〕?；诖?，對于黃灰鏈霉菌的研究一方面需加大對不同生境來源菌株的抑菌活性物質(zhì)篩選，另一方面也可借助全基因組測序研究，全面分析黃灰鏈霉菌潛在的抗生素相關(guān)基因，以充分挖掘黃灰鏈霉菌的抗生素開發(fā)潛能。

致謝：感謝大理大學東喜瑪拉雅研究院楊旭教授、肖文研究員在本研究過程中提供的指導和幫助。感謝大理大學三江并流區(qū)域生物多樣性保護與利用云南省創(chuàng)新團隊、中國三江并流區(qū)域生物多樣性協(xié)同創(chuàng)新中心、大理大學云嶺滇金絲猴野外科學觀測研究站對本研究的支持。