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    大果木姜子黃酮的提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

    2022-07-07 14:12:00陳代鳳覃亞雪梁珊珊孫慶文
    中國飼料 2022年13期
    關(guān)鍵詞:木姜子大果液料

    魏 晴, 陳代鳳, 覃亞雪, 梁珊珊, 孫慶文

    (1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,貴州貴陽 550025;2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)大果木姜子研究中心,貴州貴陽 550025;3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)植物多糖研究中心,貴州貴陽 550025)

    米槁(Cinnamomum migaoH.W.Li)為 樟 科 樟屬植物,多生長于我國西南地區(qū),以貴州為主。 其干燥成熟果實(shí)為大果木姜子, 是貴州十大苗藥之一(貴州省藥品監(jiān)督管理局,2003)。大果木姜子具有溫中散寒,理氣止痛的作用。通常人們把它當(dāng)作治療胸腹疼痛等疾病的藥物(王軍才等,2015)。近年來對大果木姜子的化學(xué)成分和藥理學(xué)方面研究比較深入(劉杰和郭江濤,2019;李建銀等,2003)。研究發(fā)現(xiàn), 大果木姜子中主要成分為黃酮類。 黃酮類化合物具有抗氧化活性, 對自由基的產(chǎn)生有抑制作用, 并且對ROS、RNS 和其他活性物質(zhì)具有清除活性 (Bartekova 等,2018;Xue 等,2017)。由于黃酮類化合物的特定化學(xué)結(jié)構(gòu)、 結(jié)構(gòu)內(nèi)的特定取代模式以及擁有能夠充當(dāng)供氫分子的酚氫,因此, 具有抗氧化活性 (Hana 等,2021;Vladimir等,2020;Monika 等,2020)。 基于此推測大果木姜子發(fā)揮抗氧化作用的部位可能為黃酮組分。

    超聲法具有提取速度快、溶劑用量少、提取率高、不影響物質(zhì)活性與化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),也是目前實(shí)驗(yàn)室階段使用非常廣泛的一種提取技術(shù)(王曉宏和宋燕,2019)。 響應(yīng)面法是一種基于三水平二階試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法, 比正交設(shè)計(jì)更簡化,比均勻設(shè)計(jì)更全面,可有效減少試驗(yàn)的次數(shù),精密度高,預(yù)測性能好(徐仕娟等,2021)。 目前, 鮮見有關(guān)大果木姜子黃酮提取工藝及抗氧化活性的研究報(bào)道。因此,本試驗(yàn)以大果木姜子黃酮為研究對象,以提取時間、液料比、超聲功率、乙醇濃度、 超聲溫度為考察因素, 以黃酮含量和對DPPH 清除率為考查指標(biāo), 優(yōu)化大果木姜子黃酮最佳提取工藝, 為大果木姜子黃酮類成分的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑 藥材產(chǎn)地為貴州省黔南州羅甸縣壩碰村, 經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院鑒定為米槁(Cinnamomum migaoH.W.Li)的果實(shí),大果木姜子。

    蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%),北京萬佳標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)中心;95%乙醇,分析純,南京化學(xué)試劑股份有限公司;DPPH,美國Sigma-Aldrich 公司;其他化學(xué)試劑均為分析純試劑。

    1.2 儀器與設(shè)備 UV7 紫外可見分光光度計(jì)(梅特勒-托利多國際貿(mào)易上海有限公司);HH-600型恒溫水?。ㄉ虾R豢苾x器有限公司);FB224 電子分析天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司);KQ-500DE 超聲波清洗儀 (昆山市超聲儀器有限公司)。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 原料預(yù)處理 將新鮮的大果木姜子置于陰涼處晾干,除去枝梗和雜質(zhì),粉碎,然后過40 目篩,即得大果木姜子粉末,備用。

    1.3.2 黃酮提取的單因素試驗(yàn)

    1.3.2.1 提取時間對各指標(biāo)的影響 分別稱取大果木姜子粉末5 g,按照液料比20:1(mL/g),超聲功率80 W,乙醇濃度70%,超聲溫度60 ℃,提取時間分別為25、30、35、40、45 min 進(jìn)行提取,考察不同提取時間對各指標(biāo)的影響。

    1.3.2.2 超聲功率對各指標(biāo)的影響 分別稱取大果木姜子粉末5 g,按照液料比20:1(mL/g),提取時間30 min,乙醇濃度70%,超聲溫度60 ℃,超聲功率分別為20、40、60、80、100 W 進(jìn)行提取,考察不同超聲功率對各指標(biāo)的影響。

    1.3.2.3 液料比對各指標(biāo)的影響 分別稱取大果木姜子粉末5 g,按照提取時間30 min,超聲功率80 W,乙醇濃度70%,超聲溫度60 ℃,液料比分別 為10:1、20:1、30:1、40:1、50:1(mL/g)進(jìn) 行 提取,考察不同液料比對各指標(biāo)的影響。

    1.3.2.4 乙醇濃度對各指標(biāo)的影響 分別稱取大果木姜子粉末5 g,按照液料比20:1(mL/g),提取時間30 min,超聲功率80 W,超聲溫度60 ℃,乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%進(jìn)行提取,考察不同乙醇濃度對各指標(biāo)的影響。

    1.3.2.5 超聲溫度對各指標(biāo)的影響 分別稱取大果木姜子粉末5 g,按照液料比20:1(mL/g),提取時間30 min,超聲功率80 W,乙醇濃度70%,超聲溫度分別為40、50、60、70、80 ℃進(jìn)行提取,考察不同超聲溫度對各指標(biāo)的影響。

    1.3.3 多評價指標(biāo)檢測方法

    1.3.3.1 黃酮含量測定 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:參考徐仕娟等(2021)的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程為:y=2.2766x-0.0057,R2=0.9997。樣品中黃酮含量的測定: 樣品中黃酮含量的測定也參考徐仕娟等(2021)的方法,黃酮含量計(jì)算公式如下:

    式中:C 為樣品中黃酮濃度,mg/mL;D 為樣品溶液稀釋倍數(shù);V表示供試品溶液體積,mL;m為樣品的質(zhì)量,g。

    1.3.3.2 抗氧化活性的測定 分別精密吸取各設(shè)定條件下提取的大果木姜子黃酮提取液0.2 mL置于10 mL 容量瓶中, 用95%乙醇定容搖勻搖勻。 再分別吸取各樣品2 mL 并加入2 mL DPPH,暗室放置30 min 后在517 nm 下測定吸光度(Ai), 再分別吸取各樣品2 mL 加入2 mL 95%乙醇,搖勻后測定吸光度(Aj)。此外,吸取2 mL 95%乙醇和2 mL DPPH 于試管中, 快速測定吸光度(A0)。每個樣品測定3 次,取平均值計(jì)算各設(shè)定條件下提取的大果木姜子黃酮對DPPH 的清除率( 張 鵬 等,2021;Hana 等,2021;Bartekova 等,2018)。

    DPPH 自由基清除率%=[1-(Ai-Aj)/A0]×100。

    1.3.4 總評歸一-響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取工藝參數(shù) 對提取效果進(jìn)行評價僅僅使用黃酮含量作為評價的指標(biāo)不足以代表效果的優(yōu)劣,故選用Hassan 的方法對黃酮含量和清除率2 個指標(biāo)進(jìn)行歸一化處理(呂明月等,2021;牛曉靜等,2019),2 個指標(biāo)都是取值越大越好, 計(jì)算公式為di=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin),Ymin 為 指 標(biāo) 中 最 小 值,Ymax 為指標(biāo)中最大值。 總評歸一值OD=(d1+d2+d3+…dk)/k(k 為指標(biāo)數(shù))。

    根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果, 選取對試驗(yàn)影響較大的因素即提取時間、液料比、超聲功率,以黃酮含量和清除率為評價指標(biāo), 并選用OD 值作為響應(yīng)值進(jìn)行綜合評分, 采用三因素三水平響應(yīng)面法對試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì),設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

    表1 試驗(yàn)因素水平及編碼

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.1.1 不同提取時間對大果木姜子黃酮含量和抗氧化活性的影響 由表2 可知, 在固定其他條件下,提取時間在25 ~35 min,隨著提取時間增長,黃酮含量增高, 清除率也越高。 提取時間為35 min 時各指標(biāo)達(dá)到最高值。 40 min 及以后各指標(biāo)含量略有下降。 這可能是因?yàn)殡S著提取時間的延長,使得組織細(xì)胞破碎程度增加,細(xì)胞中其他可溶性雜質(zhì)溶出,導(dǎo)致黃酮含量降低,故抗氧化活性也降低。

    表2 不同提取時間對大果木姜子黃酮含量和抗氧化活性的影響

    2.1.2 不同超聲功率對大果木姜子黃酮含量和抗氧化活性的影響 由表3 可知, 在固定其他條件下,超聲功率在20 ~60 W,隨著超聲功率增加,黃酮含量增高,清除率也越高。 超聲功率為60 W時各指標(biāo)達(dá)到最高值。 當(dāng)超聲功率大于60 W 后各指標(biāo)含量略有下降。 可能是由于超聲功率過大導(dǎo)致黃酮結(jié)構(gòu)被破壞, 同時隨著功率增加體系溫度也會升高, 使得部分熱不穩(wěn)定的黃酮類化合物被分解,導(dǎo)致黃酮含量降低,抗氧化活性降低。

    表3 不同超聲功率對大果木姜子黃酮含量和抗氧化活性的影響

    2.1.3 不同液料比對大果木姜子黃酮含量和抗氧化活性的影響 由表4 可知,在固定其他條件下,液料比在10:1 ~40:1(mL/g),隨著液料比增長,黃酮含量增高, 清除率也越高。 液料比為40:1(mL/g)時各指標(biāo)達(dá)到最高值。 超過40:1(mL/g)后各指標(biāo)含量略有下降。 這可能是因?yàn)楫?dāng)液料比為40:1 時,溶液中黃酮類物質(zhì)已基本溶出,繼續(xù)增大溶劑量會造成其他可溶性雜質(zhì)成分的溶出,干擾黃酮含量的測定。

    表4 不同液料比對大果木姜子黃酮含量和清除率的影響

    2.1.4 不同乙醇濃度對大果木姜子黃酮含量和抗氧化活性的影響 由表5 可知,固定其他條件下,乙醇濃度在50% ~70%, 隨著乙醇濃度增加,黃酮含量增高,清除率也越高。 乙醇濃度為70%時各指標(biāo)達(dá)到最高值。當(dāng)乙醇濃度增多,各指標(biāo)含量顯著下降。 這是由于高濃度的乙醇會增加溶液的溶解度,使其他可溶性雜質(zhì)被提取出來,故黃酮含量降低,抗氧化活性降低。

    表5 不同乙醇濃度對大果木姜子黃酮含量和抗氧化活性的影響

    2.1.5 不同提取溫度對大果木姜子黃酮含量和抗氧化活性的影響 由表6 可知, 在固定其他條件下,溫度在40 ~60 ℃,隨著提取溫度升高,黃酮含量增加,DPPH 清除率也越高。 提取溫度為60 ℃時各指標(biāo)達(dá)到最高值,超過60 ℃后各指標(biāo)含量顯著下降。原因可能隨著提取溫度的升高,使得部分黃酮類化合物結(jié)構(gòu)改變,苯環(huán)被破壞,最終導(dǎo)致黃酮含量降低,抗氧化活性降低。

    表6 不同提取溫度對大果木姜子黃酮含量和清除率的影響

    2.2 總評歸一-響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取工藝參數(shù)結(jié)果

    2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取對試驗(yàn)影響較大的因素即提取時間、液料比、超聲功率三個因素,以抗氧化活性、黃酮含量為評價指標(biāo),并選用OD 值作為響應(yīng)值進(jìn)行綜合評分,采用三因素三水平Box-Behnken 響應(yīng)面法對試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì),試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表7。

    表7 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

    2.2.2 建立響應(yīng)面模型擬合及方差分析 采用Design-Expert 8.0.6.1 軟件,以提取時間、液料比、超聲功率為考察因素, 以黃酮含量和抗氧化活性為評價指標(biāo),OD 值評分為響應(yīng)值對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸方程擬合得到回歸方程為:OD 值=0.98+0.046A-0.014B-0.30C +0.044AB-5.984E-003AC+0.019BC-0.28A2-0.33B2-0.34C2(A、B、C 分別代表提取時間、超聲功率、液料比),并對響應(yīng)面模型進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn),其結(jié)果見表8。

    由表8 可知,該模型P<0.0001,說明此模型差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 矯正系數(shù)R2Adj=0.9948,預(yù)測復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9977,預(yù)測相關(guān)系數(shù)R2(Pred)=0.9714,與預(yù)測復(fù)相關(guān)系數(shù)接近,說明偏差在合理范圍內(nèi),實(shí)際值和預(yù)測值擬合度比較好。失擬項(xiàng)F=3.752E-003,P=0.0904>0.05 不顯著, 說明選擇的模型對該試驗(yàn)的擬合度較好。 變異系數(shù)CV 為4.88%,說明該模型相關(guān)性好,可用該擬合回歸方程對不同條件下大果木姜子黃酮的OD 值進(jìn)行分析。液料比對大果木姜子黃酮OD 值影響較大,其次為提取時間。由表8 可知,A、C、AB、A2、B2、C2的P<0.05,以上因素對黃酮OD 值影響顯著,其他因素對黃酮OD 值影響不顯著。 由F 值可知,3 個因素對大果木姜子OD 值影響程度的大小順序?yàn)椋阂毫媳龋咎崛r間>超聲功率。

    表8 基于多指標(biāo)總評歸一評分的回歸模型方差分析及顯著性檢驗(yàn)

    2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析 采用Design-Expert 8.0.6.1 軟件做超聲提取工藝參數(shù)的Box-Behnken響應(yīng)面3D 圖及等高線分析圖,見圖1,通過其擬合圖形分析提取時間、超聲功率、液料比對OD 值的影響。 由圖可知,等高線越密集,中間形狀呈橢圓形或圓形, 響應(yīng)曲面越陡峭說明該因素變化對響應(yīng)值影響大,且兩因素之間的交互作用大,反之表明兩因素之間的交互作用對響應(yīng)值的影響較小。 結(jié)合表8 的P值和圖1 可知A、C、AB、A2、B2、C2因素對OD 值均具有顯著性(P<0.05),A 和C對響應(yīng)面弧面影響較大。 通過求解回歸模型方程得到最佳超聲提取工藝參數(shù)為: 提取時間34.93 min,超聲功率59.37 W,液料比39.67:1(mL/g),此條件下OD 值為0.9847。

    圖1 超聲提取工藝參數(shù)的Box-Behnken 響應(yīng)面3D 圖及等高線分析圖

    2.2.4 工藝驗(yàn)證 為檢驗(yàn)試驗(yàn)方法的可靠性,將對優(yōu)化后的工藝參數(shù)進(jìn)行3 次平行試驗(yàn), 同時考慮到優(yōu)化實(shí)際操作的可行性, 最終將試驗(yàn)參數(shù)定為:提取時間35 min,超聲功率60 W,液料比40:1(mL/g), 得到的OD 均值為0.9910, 與預(yù)測值0.9847 相比偏差為0.09%, 說明本試驗(yàn)所建模型預(yù)測性較好且穩(wěn)定。 故基于總評歸一-響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取工藝參數(shù)的方法可行且穩(wěn)定。

    3 結(jié)論

    為了更好提取出大果木姜子中黃酮, 僅通過黃酮含量來評價,不足以代表提取工藝的優(yōu)劣,因此采用多指標(biāo)來評價能夠更加客觀綜合的反映藥材的最優(yōu)提取工藝。 本試驗(yàn)以黃酮含量、 黃酮對DPPH 清除率為評價指標(biāo),超聲功率、提取時間和液料比為考察因素, 采用總評歸一-響應(yīng)面法對超聲提取工藝的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化, 得到最佳提取工藝參數(shù)為:提取時間35 min,超聲功率60 W,液料比40:1(mL/g),得到的OD 值為0.9910,黃酮含量為2.48%, 該條件下對DPPH 自由基清除活性為93.18%。本研究為大果木姜子黃酮進(jìn)一步研究開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

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