草菇鮮味肽的分離鑒定及呈味特性分析

蔣希希，裴 斐，趙立艷，馬 寧，方東路,3，仲 磊，胡秋輝,,*

（1.南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095；3.南京林業(yè)大學(xué)輕工與食品學(xué)院，江蘇 南京 210037）

在世界飲食文化中，鮮味是5種傳統(tǒng)味覺之一，也是理論界最后一種承認的味道。鮮味以其特殊的味覺感受而備受人們喜愛，并且由于鮮味與其他滋味有良好的協(xié)同性，因此成為評價美食的重要指標之一。人們發(fā)現(xiàn)在肽、有機酸、核苷酸、氨基酸等物質(zhì)中均有鮮味，在這些物質(zhì)中，鮮味肽具有良好生理活性和風(fēng)味活性，因此許多學(xué)者對其進行研究。最早在1969年Kirimura等發(fā)現(xiàn)擁有特定結(jié)構(gòu)的小分子肽可能具有比游離氨基酸更強的滋味。隨后，在各種食物中，陸續(xù)已經(jīng)有100多種鮮味肽被發(fā)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，鮮味肽對于食物中酸、甜、苦和咸等風(fēng)味特征具有增強作用。因此，它可以應(yīng)用于蔬菜、葡萄酒甚至乳制品的一些特殊風(fēng)味的改良。與一些傳統(tǒng)的鮮味物質(zhì)相比，鮮味肽在口腔內(nèi)保留時間更長的同時還緩解了喉嚨干澀的現(xiàn)象，擁有更好的發(fā)展前景。目前關(guān)于鮮味肽的呈味特性等仍存在一定爭議，因此需要探究新型鮮味肽闡明這些問題。

近年來，對食用菌原料鮮味物質(zhì)的研究較多。食用菌不僅味道鮮美，而且營養(yǎng)價值高，對于高血壓、心腦血管疾病等都有預(yù)防作用，深受廣大消費者喜愛。食用菌是低脂高蛋白食物，是制備美味鮮味肽的理想原料。李雪通過感官評價及色譜技術(shù)，分離出具有較強的鮮味特性的組分，并在該組分中采用高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜技術(shù)鑒定出一個新的鮮味肽，其氨基酸序列為Glu-Gly-Thr-Ala-Gly，該鮮味肽能夠引起雞湯的濃厚感；Tsai等對6種不同食用菌的非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行研究報道。Cho等采用香氣提取物稀釋分析法以及氣相色譜-嗅覺儀對松茸的特征活性化合物進行研究，研究表明，鮮味肽是引起食用菌鮮味的一種重要物質(zhì)。Kong Yan等通過電子舌與感官分析確定了低分子質(zhì)量組分（＜3 kDa）的鮮味最強，采用連續(xù)色譜技術(shù)從干香菇水解液中鑒定出5 條呈味肽，分別為Val-Phe、Cys-Met、Gly-Glu、Gly-Cys-Gly和Glu-Pro-Glu，這5 條肽對香菇的鮮味皆有重要貢獻；李曉明等采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜從白玉菇中鑒定得到6種鮮味肽，研究表明這6 條肽的分子質(zhì)量皆在1 000 Da以下；同時6種合成肽具有鮮味增強作用，并且增鮮能力突出，對于雞湯的咸味、鮮味和甜味都有增強作用。梁佳明等采用反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）技術(shù)從紅蔥牛肝菌中鑒定得到3 條鮮味肽，均具有強烈鮮味。

鮮味肽是食品中廣泛存在的呈味化合物，在海鮮類、肉類、魚類、發(fā)酵食品等中均發(fā)現(xiàn)了鮮味肽的存在，肉類、魚類等原材料與食用菌相比成本高。我國是食用菌產(chǎn)量大國，并且食用菌數(shù)量多且菌絲體和子實體均可直接利用提取鮮味肽。草菇屬于傘菌目、光柄菇科、小包腳菇屬，別名有苞腳菇，草菇菇體潔白，質(zhì)地細膩，吃起來具有濃濃的鮮香味，同時蛋白質(zhì)含量高，且蛋白質(zhì)中甜鮮類氨基酸占比較高，具備制備鮮味肽的潛力。目前，對草菇的研究主要集中抗氧化活性、采后的貯藏及保鮮、多糖的提取上，對草菇鮮味肽的分離鑒定還鮮有報道。本研究以草菇為原料，采用超濾、凝膠過濾色譜、RP-HPLC從草菇水提物中分離純化出鮮味肽，利用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）從中鑒定出鮮味肽的序列。并通過固相化學(xué)合成法反相合成的純肽對草菇鮮味肽的呈味特性加以分析，旨在為草菇鮮味調(diào)味品的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)，以提升草菇附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草菇 中國五河眾興菌業(yè)科技有限公司；合成肽南京金斯瑞生物科技有限公司；蔗糖、鹽、味精（均為食品級） 華潤蘇果亞東新城區(qū)店；檸檬酸（食品級）鄭州皇朝化工產(chǎn)品有限公司；咖啡因（食品級） 鄭州鴻祥化工有限公司；葡聚糖凝膠G-15柱填料 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

超濾膜分離裝置 美國Millipore公司；HL-2F恒流泵、BSZ-100自動部分收集器 上海嘉鵬科技有限公司；HD-3紫外檢測器 上海滬西分析儀器廠有限公司；FD-IC真空冷凍干燥機 西班牙TeLstar公司；1200系列高效液相色譜儀 美國Agilent公司；N-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司；SA402B電子舌 上海精天電子儀器有限公司；UPLC-Q-TOF-MS聯(lián)用儀美國Milford公司。

1.3 方法

1.3.1 草菇粗提液的制備

參照梁佳明等的方法并稍作修改，使用鼓風(fēng)干燥機將新鮮的草菇烘干至恒質(zhì)量，將草菇干品粉碎后過篩，篩網(wǎng)選擇80 目。將過篩后的草菇粉和蒸餾水按料液比1∶40（g/mL），于室溫25 ℃浸泡1 h，再100 ℃水浴90 min，4 ℃、8 000 r/min離心20 min，后取上清液備用。

1.3.2 草菇中鮮味肽的超濾膜分離

參照趙炫的方法并稍作修改。將草菇粗提液通過3 000 Da超濾膜，壓力0.5 MPa，上樣量2 L。收集分子質(zhì)量小于3 000 Da的組分，經(jīng)凍干后保存于-80 ℃?zhèn)溆么郎y。

1.3.3 凝膠色譜分離純化草菇中的肽

參照李曉明等的方法并稍作修改。采用葡聚糖凝膠柱Sephadex G-15對超濾組分進行分離純化，葡聚糖凝膠粉末在過量超純水中浸泡24 h進行溶脹，將溶脹充分的填料灌入到層析柱（直徑1.6 cm、長80 cm）中，流動相為超純水，紫外吸收波長為220 nm。為了使凝膠結(jié)合的更為牢固，將流動相以3 mL/min的流速對凝膠過濾層析柱沖刷5 h。然后將超濾后具有鮮味的組分用超純水配比成10 mg/mL溶液，讓其通過0.22 μm水相濾膜后以0.5 mL/min流速載入凝膠過濾層析柱上，收集出峰的組分。將對應(yīng)一個峰的所有組分混合，冷凍干燥后用于下一步電子舌與感官評估。

1.3.4 RP-HPLC分離純化草菇中的肽

該分離過程采用Gu Min等的方法并有所修改。將凝膠色譜分離純化出的鮮味最佳組分用流動相配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL溶液，并通過0.22 μm濾膜過濾。選擇Zorbax 300SB-C色譜柱（PrepHT，21.2 mm×250 mm），采用梯度洗脫，上樣體積250 μL，流動相A相為含有0.05%三氟乙酸的超純水，B相為含有0.05%三氟乙酸的乙腈，波長選擇220 nm，具體流動相條件參考表1。將對應(yīng)一個峰的所有組分混合，冷凍干燥后用于下一步的電子舌與感官評估。

表1 半制備高效液相色譜條件Table 1 Semi-preparative high performance liquid chromatography conditions

1.3.5 UPLC-Q-TOF-MS分離鑒定草菇中的肽

參照Xu Xiaodong等的方法并稍作修改，采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對RP-HPLC分離純化出的鮮味最佳組分進行結(jié)構(gòu)鑒定。采用BEH C色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；進樣量10 μL；流速0.3 mL/min；洗脫液A為0.1%乙腈溶液，洗脫液B為0.1%甲酸溶液；柱溫45 ℃；梯度洗脫條件：0～2 min，0% A、100% B；2～3 min，20% A、80% B；3～10 min，100% A、0% B。

1.3.6 定向合成目標肽

由UPLC-Q-TOF-MS鑒定得出的目標多肽由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，采用多肽固相合成并對其進行脫鹽處理，獲得純度大于98%的4 條多肽。

1.3.7 感官評價

1.3.7.1 凝膠過濾色譜分離各組分的感官分析及滋味稀釋分析

參照Zhang Jianan等的方法并稍作修改，選取10個感官評價員（5 男5 女），對草菇分離組分的鮮味進行評價打分。在正式感官評價之前，對10個評價員進行為期4 周的鮮味評價的培訓(xùn)。評分采用10 點制，0～2，可有可無；2～4，弱；4～6，中等；6～8，強；8～10，非常強。

將各組分溶液以體積比1∶1的比例逐步稀釋，采用三角試驗評估每一個稀釋水平，直至評價人員無法從1 份肽溶液及2 份超純水溶液中識別出肽溶液為止，記錄此時溶液的稀釋水平即為滋味稀釋值。

1.3.7.2 RP-HPLC各組分及合成肽的感官分析

參照1.3.7.1節(jié)感官評價方法。

1.3.7.3 合成肽的鮮味閾值及增鮮閾值測定

將起始質(zhì)量濃度為1 mg/mL的合成肽溶液逐級稀釋，采用三角試驗法，直到評價人員無法品嘗出溶液中的鮮味，合成肽的鮮味閾值即為倒數(shù)第2個合成肽溶液的質(zhì)量濃度值；在0.5 mg/mL味精溶液中添加草菇合成肽，等比例提高溶液中合成肽的質(zhì)量濃度，直至可以明顯品嘗到溶液中的鮮味增加，合成肽的增鮮閾值即為此時溶液的質(zhì)量濃度值。

1.3.8 電子舌檢測

1.3.8.1 合成肽的劑量-反應(yīng)實驗

以0.5 mg/mL的味精溶液為母液，配制不同質(zhì)量濃度的合成肽溶液，分別為0、5、10、15、20、25 mg/mL，對其進行感官與電子舌分析，合成肽的劑量-感官反應(yīng)分析參照1.3.7節(jié)方法，合成肽的劑量-電子舌評價實驗參照邴芳玲等的方法并稍作修改，利用電子舌中的傳感器陣列對樣品進行檢測，此傳感傳感器陣列包括SCS、AHS、CTS、NMS、ANS 5 根傳感器，分別代表苦味、酸味、咸味、鮮味和甜味。每個樣品的采集時間為120 s，在蒸餾水中的清洗時間為10 s。每個樣品做3個平行，重復(fù)檢測6 次，取穩(wěn)定后的3 次實驗數(shù)據(jù)。

1.3.8.2 呈味效應(yīng)解析的電子舌分析

使用氨基酸配制成與合成肽等質(zhì)量比的5 mg/mL溶液，將其與合成肽溶液進行電子舌對比分析，電子舌分析方法參照1.3.8.1節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾和凝膠色譜分離純化草菇中的肽

圖1 A-I組分的Sephadex G-15凝膠層析分離圖Fig. 1 Separation of the water extract of straw mushroom by gel chromatography on Sephadex G-15

實驗材料為經(jīng)超濾制得的分子質(zhì)量小于3 000 Da的草菇鮮味組分（記為A-I）。如圖1所示，超濾組分A-I經(jīng)凝膠過濾色譜分離后，在保留時間60～260 min內(nèi)，共獲得F1、F2、F3和F4。分別收集各組分，冷凍干燥后進行電子舌分析及感官分析。

圖2 凝膠過濾色譜分離組分的電子舌雷達圖（A）和滋味稀釋因子分析圖（B）Fig. 2 Radar chart of electronic tongue responses (A) and results of taste dilution analysis of four fractions (B)

如圖2A所示，電子舌分析表明這4種組分的味道特征相似，鮮味、咸味和甜味相對較強，苦味和酸味相對較弱。與其他組分相比，將A-I組分與凝膠色譜分離組分進行滋味稀釋分析。結(jié)果如圖2B所示，A-I組分的滋味稀釋因子為92，而凝膠色譜分離組分中，F(xiàn)1組分的滋味稀釋分析值為34，是層析組分中最高的，說明F1對整體的鮮味影響最大。在分離純化鮮味肽的過程中，超濾只是一個壓力驅(qū)動的膜分離過程，在這種過程中很難分離出分子質(zhì)量精確的多肽，所以進一步采用凝膠分離進行純化，以獲得更精確的組分。凝膠色譜分離是利用分子篩原理，利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，分子質(zhì)量越大的組分在填料中滲透路徑越短，則在色譜柱中的保留時間越短，從而達到分離的目的，本研究選用的G-15葡聚糖凝膠可有效分離小于1 500 Da的小分子肽，凝膠色譜過濾結(jié)果顯示F1保留時間最短且對波長220 nm處響應(yīng)值最高，F(xiàn)1組分可能是由分子質(zhì)量為1 000 Da左右的小分子肽構(gòu)成。通過圖1與圖2B比較發(fā)現(xiàn)，低分子質(zhì)量組分F1與草菇水提物的味覺特性具有很好的相關(guān)性，并且表現(xiàn)出很強烈的鮮味，是草菇中關(guān)鍵的味覺物質(zhì)。這些結(jié)果與前期研究高度一致，即低分子質(zhì)量的組分構(gòu)成食品中的主要味覺活性化合物，并且具有更強的鮮味，因此，F(xiàn)1組分極有可能含有目標鮮味肽。選取F1做下一步RP-HPLC分離純化。

2.2 RP-HPLC分離純化草菇中的肽

圖3 F1組分的RP-HPLC分離圖Fig. 3 Semi-preparative high performance liquid chromatographic separation of F1

如圖3所示，F(xiàn)1組分經(jīng)RP-HPLC分離后共得到4個組分，分別為F1-a、F1-b、F1-c和F1-d，相應(yīng)的出峰時間為3.563、4.021、4.430、5.825 min，RP-HPLC根據(jù)分子的疏水性強弱進而將物質(zhì)洗脫分離，出峰時間越短，則親水性越強，F(xiàn)1-a的出峰時間最短，說明其親水性較強，而親性強弱與氨基酸性質(zhì)有關(guān)，多數(shù)的甜鮮味氨基酸如絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、蘇氨酸（Thr）以及天冬氨酸（Asp）等為親水性氨基酸，多數(shù)的苦味氨基酸如苯丙氨酸（Phe）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）以及異亮氨酸（Ile）等為疏水性氨基酸，因此，F(xiàn)1-a可能含有較多的甜鮮味的親水性氨基酸。分別收集各組分，冷凍干燥后進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

圖4 RP-HPLC分離各組分的感官雷達圖（A）及其電子舌PCA（B）Fig. 4 Radar map of taste profiles of RP-HPLC fractions (A) and principal component analysis of electronic tongue responses (B)

如圖4A所示，經(jīng)RP-HPLC分離的4組分鮮味特征強烈，在所有口味中占主導(dǎo)作用，苦味和咸味相對較弱。4組分中F1-a鮮味效果最佳，其次為F1-d，而F1-b和F1-c的鮮味值較低，呈鮮效果較差。如圖4B所示，所有樣品在PCA圖上無重疊，表明電子舌可以有效區(qū)分RP-HPLC分離組分的滋味。與F1-b、F1-c和F1-d相比，經(jīng)過純化的F1-a滋味更接近于味精和F1組分，說明F1-a組分在草菇水解液中的鮮味最強，更接近于草菇的原始滋味，即草菇鮮味肽，結(jié)合圖3表明F1-a可能含有較多的甜鮮味的親水性氨基酸，因此選擇F1-a組分進行質(zhì)譜分析進一步解析鮮味肽結(jié)構(gòu)。

2.3 UPLC-Q-TOF-MS分離鑒定草菇中的肽

收集F1-a組分，通過UPLC-Q-TOF-MS鑒定其中的肽序列。如圖5顯示，在/376.07、728.48、745.45、408.32處質(zhì)譜豐度較強，對這些質(zhì)譜峰進行碰撞誘導(dǎo)裂解，并進一步對照Peaks Studio系統(tǒng)對肽序列進行自動數(shù)據(jù)檢索，有4 條肽鏈得到了碎片分布均勻的二級質(zhì)譜圖和解譜序列可信度較高的評分（Peaks軟件中推薦序列的分值大于60），最終得到分子質(zhì)量分別為750.27、726.44、744.42、816.28 Da的肽序列，這4 條呈味多肽的肽序列為Asp-Asp-Cys-Pro-Asp-Lys（DDCPDK）、Leu-Val-Asp-Lys-Pro-Arg（LVDKPR）、Gln-Ala-Asp-Lys-Arg-Lys（QADKRK）、Asp-Thr-Phe-Asn-Asp-Lys（DTFNDK）。這4 條多肽均含有豐富的親水性氨基酸，這與RP-HPLC分離后推測的結(jié)果一致。同時，有研究表明高比例甜鮮氨基酸的組成是多肽具有鮮味的關(guān)鍵因素，在本研究中，從草菇中鑒定得到的4種多肽中甜鮮氨基酸占比較高，其占比超過一半，表明F1-a組分中的多肽可能具有鮮味。另外，Rhyu等研究結(jié)果表明鮮味肽的分子質(zhì)量一般均集中在1 000 Da以下，而本研究中所有肽的分子質(zhì)量均集中在700～900 Da之間，這與前人研究結(jié)果一致且與推測結(jié)果一致，這表明草菇多肽可能具有良好的呈鮮效果。對其進行后續(xù)的合成并驗證其鮮味特性。

圖5 多肽的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜圖Fig. 5 Mass spectra and MS/MS spectra of identified peptides

2.4 草菇鮮味肽的呈味特性分析

2.4.1 鮮味肽的感官特性分析

將從草菇中鑒定出的4種鮮味肽定向合成后進行感官評價與電子舌分析，如圖6A所示，合成后的4 條肽段滋味輪廓基本一致，5種滋味中鮮味和咸味較為突出，具有一定的甜味，苦味最弱。如圖6B所示，4種合成肽的鮮味特征突出，其中DDCPDK的鮮味強度最高，其次為DTFNDK，鮮味相對較弱的為LVDKPR。鮮味肽的滋味豐富，往往不止一種味道，其中所有的合成肽均表現(xiàn)出了一定的酸味，這是因為肽鏈中的羧基解離強度大于氨基，溶液顯酸性。

圖6 合成肽的感官滋味輪廓圖（A）和電子舌滋味輪廓圖（B）Fig. 6 Sensory taste profiles (A) and E-tongue taste profiles (B) of synthetic peptides

將從草菇中鑒定出的4種鮮味肽進行定向合成，對其鮮味閾值及增鮮閾值進行確定。由表2可知，4種合成肽的鮮味閾值存在顯著差異（＜0.05），DDCPDK的鮮味閾值最低，為0.10 mg/mL，說明其鮮味強度最高，QADKRK的鮮味閾值最高，為0.42 mg/mL，說明其鮮味強度最低。同時4種肽表現(xiàn)出不同的增鮮能力，增鮮閾值差異顯著（＜0.05），其中DDCPDK的增鮮閾值最低，在0.02 mg/mL時對0.5 mg/mL味精溶液就能起到明顯的增鮮作用，其他3 條鮮味肽的增鮮閾值在0.03～0.18 mg/mL之間，說明這3 條鮮味肽比DDCPDK需要更高濃度達到相同增鮮效果，因此DDCPDK的鮮味增強能力最強。

大量研究表明鮮味肽的鮮味與其氨基酸組成及肽鏈的構(gòu)象有關(guān)。從氨基酸組成看，多肽DDCPDK呈現(xiàn)最低的鮮味閾值（0.1 mmol/L），可能與組成上有4個鮮味氨基酸片段（Asp-Asp、Asp）有關(guān)。多肽QADKRK呈現(xiàn)最高的鮮味閾值（0.42 mmol/L）且?guī)в锌辔叮浣M成上含有堿性氨基酸（Lys、Arg），而多肽中堿性氨基酸的存在會促進苦味的感知，這可能是多肽QADKRK帶有一定苦味的原因。另外，Shibashi等研究結(jié)果表明，苯丙氨酸（F）屬于苦味氨基酸，并且具有增強多肽苦味的能力，這可能是多肽DTFNDK也呈有一定苦味的原因。Liu Ziyuan等對從紅鰭東方鲀中分離鑒定的7 條鮮味肽序列進行分析，發(fā)現(xiàn)末端含有精氨酸（R）的肽序列呈現(xiàn)苦味且閾值較高，多肽LVDKPR末端也含有精氨酸，這可能也會使多肽苦味增加，從而抑制多肽的鮮味值。

表2 合成肽的鮮味閾值及增鮮閾值Table 2 Umami thresholds and umami-enhancing thresholds of synthetic peptides

2.4.2 鮮味肽的呈味效應(yīng)解析

圖7A、7B整體趨勢相同，這是由于電子舌可以對液體樣品的“指紋”信息進行分析，從而對樣品進行定性或定量分析。邴芳玲等使用電子舌結(jié)合感官評價對食用菌的鮮味強度進行評價，驗證了電子舌分析和感官評價具有一致性。圖7A與7B均直觀反映了鮮味模型中合成肽的釋放和消失對模型鮮味的影響。草菇中4種肽的增鮮曲線均呈先升高后降低的趨勢，所有合成肽的鮮味峰值質(zhì)量濃度均為20 mg/mL，當在鮮味峰值濃度時，4種肽的鮮味增強能力差異顯著（＜0.05），其中DDCPDK的鮮味增強能力突出，相比之下DTFNDK的增鮮能力較弱。

圖7 合成肽在味精溶液中的劑量-感官曲線（A）以及劑量-電子舌曲線（B）Fig. 7 Umami-enhancing effect of synthetic peptides at different concentrations on monosodium glutamate solution as determined by sensory evaluation (A) and electronic nose (B)

如圖8所示，4 條合成肽與其等質(zhì)量配比的氨基酸混合液的呈味特性均存在明顯差異。如圖8A所示，DDCPDK是以鮮味為主，而混合液則是以甜味為主，其甜味是由天冬氨酸引起；如圖8C所示，QADKRK本身以鮮味為主，而混合液以甜味為主，其甜味是由丙氨酸引起；如圖8D所示，DTFNDK本身以鮮味為主，而混合液以甜味為主，其甜味是由蘇氨酸引起的。DDCPDK、QADKRK以及DTFNDK這3 條合成肽溶液的甜味與鮮味均顯著高于其混合液，表明甜味氨基酸（天冬氨酸、丙氨酸、蘇氨酸）在與其他氨基酸通過肽鍵結(jié)合后會改變其呈味特性。如圖8B所示，LVDKPR是以鮮味為主，而混合液以苦味為主，其苦味是由亮氨酸引起的，合成肽LVDKPR溶液的苦味與鮮味顯著高于混合液，表明呈強苦味的亮氨酸在與其他氨基酸通過肽鍵結(jié)合后會改變其呈味特性。因此，研究結(jié)果表明這4 條草菇鮮味肽的呈味特性其實并非由單個氨基酸滋味簡單疊加而成，而是氨基酸通過肽鍵形成特定的結(jié)構(gòu)引起，這與Zhuang Mingzhu等的研究結(jié)果相似。同時發(fā)現(xiàn)當草菇鮮味肽添加量超過20 mg/mL后，鮮味肽的酸味會使溶液的酸味強度升高，同時會對溶液鮮味的產(chǎn)生抑制，這表明鮮味肽的添加量是有一定的限制，最佳添加量為20 mg/mL。

圖8 合成肽與等質(zhì)量配比的氨基酸混合液的感官評價分析對比圖Fig. 8 Comparison of taste intensity of synthetic peptides and amino acid mixture at 1:1 mass ratio

3 結(jié) 論

依次采用超濾、凝膠過濾色譜和RP-HPLC從草菇水提物中分離純化出多肽組分F1-a，并基于電子舌分析與感官評價證明其具有較強的鮮味。利用UPLC-Q-TOF-MS進一步鑒定出F1-a組分主要含有DDCPDK、LVDKPR、QADKRK和DTFNDK這4 條短肽。本研究發(fā)現(xiàn)鮮味肽的呈味特性是氨基酸通過肽鍵形成特定的結(jié)構(gòu)引起；從草菇中分離鑒定出的4種短肽既是鮮味肽也是鮮味增強肽，鮮味閾值在0.10～0.42 mg/mL之間，增鮮閾值在0.02～0.18 mg/mL之間，其中短肽DDCPDK對味精溶液的增鮮效果最佳，且最佳添加量為20 mg/mL。研究結(jié)果為草菇鮮味調(diào)味品的開發(fā)提供一定理論依據(jù)，以提升草菇附加值。