屠宰過程中豬胴體表面及環(huán)境的細菌菌相分析

唐 林，郭柯宇，賴鯨慧，李建龍，李 琴，楊 勇，鄒立扣，劉書亮,3,*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院，四川 成都 611130；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品加工與安全研究所，四川 雅安 625014）

豬肉是我國主要的肉類食品之一，2019年全球豬肉消費量達到1.009億 t，其中我國豬肉消費量（4 486.6萬 t）約占全球豬肉消費量的49%，即使受到非洲豬瘟和新冠肺炎疫情的影響，我國豬肉消費量在全球范圍內(nèi)仍處于絕對領(lǐng)先的地位。然而，從生豬到餐桌供應(yīng)鏈的微生物安全卻存在風(fēng)險。生豬體表帶有大量塵埃、雜質(zhì)以及病菌等，刺殺放血、燙毛、開膛劈半、去內(nèi)臟等環(huán)節(jié)都容易造成豬肉中微生物增加，并且許多食源性致病菌主要存在于豬的呼吸道和胃腸道中，商業(yè)屠宰期間的燒灼過程并不能消除這些細菌，清洗反而會使這些細菌污染整個胴體。分割過程由于肉塊與外界的接觸面變大也容易造成嚴重的交叉污染。因此，調(diào)查屠宰分割過程中豬胴體表面的微生物污染情況，找出關(guān)鍵污染環(huán)節(jié)并加以控制，對減少豬胴體的交叉污染和提高企業(yè)經(jīng)濟效益非常重要。

肉類微生物的研究方法主要有傳統(tǒng)培養(yǎng)和分子生物學(xué)技術(shù)。傳統(tǒng)培養(yǎng)方法操作簡單、能較直觀地反映微生物數(shù)量，但由于選擇性生長、營養(yǎng)條件等限制，無法完整反映樣品的菌相組成。高通量測序（highthroughput sequencing，HTS）技術(shù)針對樣本中細菌16S rRNA、真菌18S rRNA或ITS特定區(qū)域進行擴增，克服了偏向培養(yǎng)和及時DNA克隆的限制，能夠同時分析多個樣品，也能夠深入描述樣本微生物群落組成和相對豐度，已廣泛應(yīng)用于微生物多樣性與群落結(jié)構(gòu)組成研究。盡管傳統(tǒng)培養(yǎng)方法顯示出一些缺點，但在分離、鑒定食品腐敗微生物時仍必不可少。Illikoud等通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法從變質(zhì)食品及屠宰場環(huán)境中分離出161 株熱死環(huán)絲菌并進行鑒定。Zhao Shengming等通過總活菌數(shù)、假單胞菌數(shù)、熱死環(huán)絲菌數(shù)和腸桿菌科數(shù)等確定豬肉變質(zhì)程度，以及不同保鮮劑對冷卻豬肉的保鮮效果。通常認為，活菌計數(shù)達到7～8（lg（CFU/g））會導(dǎo)致肉的微生物腐敗，但這僅具有參考價值，因為計數(shù)時包括潛在的保護性細菌，分析食品的腐敗還需要評估到屬、種水平。因此，在實際應(yīng)用中多采用傳統(tǒng)培養(yǎng)與HTS相結(jié)合的方法分析樣本菌相。Yang Chao等分別通過傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)和HTS技術(shù)研究經(jīng)防腐劑處理后在4 ℃貯存期間豬肉細菌數(shù)和優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)的變化。Li Xinfu等通過HTS監(jiān)測真空包裝臘肉在冷藏過程中的微生物組成和種群動態(tài)變化，并通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對特定腐敗微生物進行分離鑒定，明確了造成臘肉腐敗的主要微生物。Cauchie等對不同來源和貯存條件的288 份豬肉末樣品進行16S rRNA擴增子測序與耐冷菌、乳酸菌計數(shù)，發(fā)現(xiàn)組合方法在豬肉碎樣品的微生物動力學(xué)分析方面提供了互補結(jié)果。Peruzy等對豬肉糜中微生物群落的分析結(jié)果也表明，使用16S rDNA測序進行分離株鑒定以及16S rRNA擴增子測序分析整體群落可以提供互補結(jié)果。因此，HTS技術(shù)與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相結(jié)合，可以更詳細地解析肉類環(huán)境中微生物的群落組成及其復(fù)雜關(guān)系。

本實驗通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和HTS技術(shù)相結(jié)合分析生豬屠宰鏈不同環(huán)節(jié)豬胴體表面的微生物污染情況，測定屠宰車間刀具和分割車間各接觸面細菌菌落總數(shù)，確定屠宰分割過程中的關(guān)鍵污染環(huán)節(jié)，以期為減少屠宰分割過程中豬胴體的交叉污染和提高豬肉出庫時的微生物安全性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

四川某豬屠宰加工廠生產(chǎn)鏈中豬胴體表面、刀具及環(huán)境接觸面的擦拭樣品。

平板計數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（violet red bole agar，VRBA）培養(yǎng)基 杭州微生物試劑有限公司；MRS、CFC選擇培養(yǎng)基、假單胞菌CFC選擇培養(yǎng)基添加劑、STAA培養(yǎng)基、STAA添加劑、煌綠乳糖膽鹽（brilliant green lactose bile，BGLB）肉湯 青島海博生物技術(shù)有限公司；Gengreen核酸染料、2×PCR MasterMix、DNA Marker DL15000 天根生化科技（北京）有限公司；細菌DNA提取試劑盒 美國Omega公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PowerPac Basic型凝膠電泳儀、Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；JX-25B手提式高壓滅菌鍋寧波久興醫(yī)療器械有限公司；DHG-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司；ST 16R冷凍離心機 美國賽默飛公司。

1.3 方法

1.3.1 刀具和接觸面取樣

分別于生豬屠宰分割前期、中期和后期進行刀具和接觸面取樣。屠宰車間刀具包括刺殺放血、去頭、開膛、劈半和修剪用刀具；分割車間接觸面包括傳送帶、案板、肉框、刀具和操作人員手部。傳送帶、案板、肉框等接觸面具體取樣方法如下：采用100 cm取樣器，隨機選取3個點，共擦拭300 cm，剪下棉頭放入含30 mL滅菌生理鹽水的無菌采樣袋中。刀具和操作人員手部采用25 cm取樣器，隨機選取4個點，共擦拭100 cm，剪下棉頭裝入含10 mL滅菌生理鹽水的無菌采樣袋中，作為原液于低溫狀態(tài)下送回實驗室計數(shù)。將細菌原液以10 倍遞增稀釋成合適梯度進行微生物總數(shù)測定，每個稀釋度做2個平行。重復(fù)取樣3 次。

1.3.2 豬胴體表面取樣

采用跟蹤取樣法，分別于刺殺放血（FX）、脫毛（TM）、開膛去臟（KT）、沖淋（CL）、冷卻排酸（LQ）和分割（FG）后進行取樣。除分割外，其余各環(huán)節(jié)隨機選取3個豬胴體，每個胴體選取頸部、肩部、胸口部、背部和腿部5個部位，每個部位擦拭100 cm，共擦拭1 500 cm，然后剪下棉拭子放入裝有150 mL無菌生理鹽水的無菌采樣袋中。分割后的采樣包含前腿肉、后腿肉、里脊肉、肋排和五花肉5個部位，每個樣品各部位隨機選取3 塊肉擦拭，擦拭方法與上述一致。將采集的樣品原液分成兩份，一份用于HTS，另一份梯度稀釋后用于微生物計數(shù)。

1.3.3 微生物計數(shù)

菌落總數(shù)測定參考GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》；大腸菌群測定參考GB 4789.3—2016《食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數(shù)》第二法，大腸菌群的平板計數(shù)法；乳酸菌數(shù)測定參考GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》；假單胞菌數(shù)測定參考SN/T 4044—2014《出口肉及肉制品中假單胞菌屬的計數(shù)方法》；熱死環(huán)絲菌數(shù)測定參考傅鵬等的方法。計數(shù)所用選擇性培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件如表1所示。

表1 不同種類微生物的培養(yǎng)方法和條件Table 1 Cultivation methods and conditions for different groups of bacteria

1.3.4 HTS分析

1.3.4.1 DNA提取及PCR擴增

參考夏小龍的方法進行樣品處理。取50 mL細菌原液2 000 r/min離心3 min，去除底部雜質(zhì)，上清液于12 000 r/min離心10 min得菌體沉淀。收集的菌體沉淀用磷酸鹽緩沖液洗滌3 次，離心，然后將沉淀分裝于3個2 mL無菌EP管中，-20 ℃保存。

采用細菌DNA提取試劑盒進行樣品DNA提取，提取的DNA通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格后委托上海美吉生物醫(yī)藥公司進行MiSeq平臺測序分析。

1.3.4.2 測序數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析

將測序得到的Raw Date經(jīng)過Fastp（V0.19.6）和Flash（V1.2.11）進行質(zhì)控、拼接和過濾，采用Uparse軟件（V7.0.1090）按照97%相似性對非重復(fù)序列（不含單序列）進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，得到OTU的代表序列以SILVA（Release138 http://www.arb-silva.de）數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，通過RDP Classifier（V 2.2，置信度閾值為0.7）進行分類學(xué)分析。通過Qiime平臺（http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html）進行多樣性分析，包括Chao1、ACE、Shannon、Simpson指數(shù)和覆蓋率，并利用R語言工具繪制樣品稀釋曲線、群落柱形圖和群落熱圖，統(tǒng)計不同樣品在門和屬水平上的組成差異。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016和Origin 2019b軟件進行數(shù)據(jù)處理及繪圖，采用SPSS 21.0軟件進行差異顯著性分析（＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的微生物數(shù)量

2.1.1 刀具及各接觸面污染的微生物情況

圖1 屠宰分割車間刀具及接觸面細菌菌落總數(shù)Fig. 1 Total number of bacterial colonies on the knives and contact surfaces in slaughter and segmentation workshops

由圖1可知，屠宰車間各環(huán)節(jié)劈半刀具菌落總數(shù)較低（平均為4.49（lg（CFU/cm）），修剪刀具菌落總數(shù)較高（平均為5.21（lg（CFU/cm））），這可能是由于劈半刀具與豬胴體表面接觸較少，且未與內(nèi)臟接觸，而修剪刀具主要修剪頸部淋巴等，頸部處于倒掛胴體的最下端從而導(dǎo)致污染嚴重。與屠宰前、后期相比，屠宰中期各環(huán)節(jié)刀具的污染均最為嚴重，且差異不顯著（＞0.05），其次是屠宰后期。這是因為屠宰中期結(jié)束后會對刀具進行清水沖洗，說明定期清洗刀具能有效清除殘留的血跡和組織，減少刀具表面的微生物附著。

分割車間各接觸面的污染整體高于屠宰車間刀具，這與劉壽春等的研究結(jié)果一致。傳送帶和肉框的污染較嚴重，菌落總數(shù)平均值分別達6.34（lg（CFU/cm））和6.25（lg（CFU/cm）），這是因為潮濕的設(shè)備表面沾染了肉塊碎屑和液體從而導(dǎo)致有氧菌大量增殖。其次是操作人員手部、案板和刀具，菌落總數(shù)平均值分別為6.08、5.94、5.93（lg（CFU/cm）），處于較高水平。NY/T 632—2002《冷卻豬肉》規(guī)定冷卻胴體應(yīng)在良好操作規(guī)范和良好衛(wèi)生條件下分割，刀具、箱框和工作人員手部應(yīng)每隔1 h消毒1 次，可能與該企業(yè)未嚴格執(zhí)行有關(guān)。同時，加工設(shè)備中的微生物也常在分割和低溫貯藏的肉中發(fā)現(xiàn)，它們是導(dǎo)致肉類變質(zhì)的主要因素，這說明加工環(huán)境及接觸設(shè)備的潔凈程度直接影響冷卻豬肉的初始微生物水平。為最大限度地減少設(shè)備對屠體的微生物污染，監(jiān)管機構(gòu)要求屠宰場提供80 ℃以上熱水以凈化刀具和其他器皿，但部分企業(yè)并未嚴格執(zhí)行；并且應(yīng)該注意的是，熱水浸泡時間的長短以及水中浮渣和沉淀量均對去污效果非常重要。已有研究表明，要消滅沙門氏菌需在82 ℃水中浸泡10～20 s。此外，許多肉類加工廠的傳送帶由鉸鏈塑料段構(gòu)成，常規(guī)清潔往往無法清除其中所有的肉屑，細菌不可避免地在其中生長，從而造成嚴重的交叉污染。

2.1.2 豬胴體表面污染微生物情況

圖2 屠宰分割過程中豬胴體表面微生物污染情況Fig. 2 Microbial contamination on the surface of pig carcasses during slaughter and segmentation

由圖2可知，不同屠宰階段胴體表面的微生物數(shù)量存在差異，但整體變化趨勢大致相同：脫毛、開膛、沖淋以及預(yù)冷后胴體表面的各類微生物數(shù)量逐漸減少，分割后有所上升，這與趙慧等的研究結(jié)果一致。Mann等的研究也得出類似結(jié)論，即細菌污染主要發(fā)生在豬屠宰的脫毛和胴體分割過程。2073/2005/EC《食品微生物標準》中規(guī)定豬胴體菌落總數(shù)的滿意水平為4.0（lg（CFU/cm）），可接受水平為5.0（lg（CFU/cm）），基于此發(fā)現(xiàn)，本研究中菌落總數(shù)在開膛、沖淋和預(yù)冷后達到可接受水平，分別為4.83、4.21（lg（CFU/cm））和3.90（lg（CFU/cm））；但分割環(huán)節(jié)加重了胴體的污染，菌落總數(shù)達到5.76（lg（CFU/cm）），超出可接受水平，這是由于分割過程肉塊與工人手部、刀具、傳送帶和肉框等接觸，屠宰機械和分割設(shè)備表面的微生物對肉塊造成了污染；還可能是因為分割車間溫度（10～12 ℃）高于冷卻排酸間溫度（0～4 ℃）使得嗜冷微生物繁殖所致。此外，胴體表面的乳酸菌數(shù)量始終較高，平均數(shù)量為3.97（lg（CFU/cm）），其次是假單胞菌、大腸菌群和熱死環(huán)絲菌，平均數(shù)量分別為2.42、2.18（lg（CFU/cm））和2.04（lg（CFU/cm））。

2.2 基于HTS分析豬胴體表面細菌菌群多樣性

2.2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

對原始數(shù)據(jù)進行拼接、質(zhì)控和過濾，最終得到881 458個有效序列，平均長度為427 bp，產(chǎn)生93～624個OTU。如圖3所示，當(dāng)樣品測定序列數(shù)超過28 000時所有樣品的稀釋曲線均趨于平坦，說明已包含大部分多樣性信息，測序深度足夠。

圖3 屠宰分割過程中豬胴體表面微生物的Sobs稀釋曲線Fig. 3 Sobs rarefaction curves for the microbes on pig carcass surface during slaughter and segmentation

2.2.2多樣性指數(shù)分析

如表2所示，放血和脫毛環(huán)節(jié)的Chao1、ACE和Shannon指數(shù)明顯高于其他環(huán)節(jié)，屠宰分割過程中群落多樣性依次為放血＞脫毛＞分割＞開膛＞沖淋＞冷卻，冷卻環(huán)節(jié)胴體表面的微生物多樣性最低，分割后微生物多樣性增加，說明分割環(huán)節(jié)是生豬屠宰過程中的關(guān)鍵污染環(huán)節(jié)，這與通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法得到的結(jié)論一致。

表2 豬屠宰各環(huán)節(jié)樣品的α多樣性指數(shù)Table 2 α-Diversity index of samples from each stage of pig slaughter

2.2.3 不同分類學(xué)水平上物種組成分析

如圖4所示，變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）和厚壁菌門（Firmicutes）是屠宰分割過程中豬胴體表面豐度最高的3個門，平均相對豐度分別為83.53%、6.09%和5.96%。變形菌門相對豐度在冷卻環(huán)節(jié)最高（98.67%），說明冷卻環(huán)節(jié)細菌在門水平相對單一，分割后細菌門顯著增加。放血和脫毛環(huán)節(jié)變形菌門的相對豐度差異不大，但脫毛環(huán)節(jié)門水平上的物種多樣性較高，可能是因為脫毛過程中胴體表面的細菌雜質(zhì)黏附到全胴體。

圖4 豬胴體表面細菌門水平相對豐度變化Fig. 4 Changes in the relative abundance of bacterial phyla on the surface of pig carcass

由圖5可知，屠宰分割過程中豬胴體表面相對豐度排名前5的菌屬主要為不動桿菌屬（）、氣單胞菌屬（）、金黃桿菌屬（）、羅斯氏菌屬（）和巨型球菌屬（）。不動桿菌屬和氣單胞菌屬是生豬肉中主要的優(yōu)勢菌屬，這與大多數(shù)研究一致。雖然優(yōu)勢菌屬基本相同，但相對豐度差異較大。不動桿菌屬平均相對豐度為49.98%，冷卻后不動桿菌屬相對豐度最高，達到79.71%，其他菌屬僅為2.94%，說明冷卻過程能一定程度降低豬胴體表面菌群多樣性。分割后不動桿菌屬相對豐度僅為48.50%，其他各菌屬相對豐度顯著增加，說明分割是導(dǎo)致豬胴體微生物污染加劇的重要環(huán)節(jié)。氣單胞菌屬各環(huán)節(jié)的平均相對豐度為25.29%，但在放血環(huán)節(jié)只為1.96%，其他菌屬相對豐度高達17.58%，說明豬胴體攜帶的原始微生物種類豐富。

圖5 豬胴體表面細菌屬水平相對豐度變化Fig. 5 Changes in the relative abundance of bacterial genera on the surface of pig carcass

2.2.4 屠宰分割過程中不同環(huán)節(jié)豬胴體表面細菌雙聚類熱圖分析

根據(jù)屬水平物種的注釋結(jié)果，對分組樣品豐度進行均值計算，選擇總豐度排名前30的物種繪制屠宰分割過程中不同環(huán)節(jié)細菌的雙聚類熱圖，其可以通過顏色變化與相似程度直觀反映不同樣品間群落組成的相似性和差異性。由圖6可知，放血和脫毛環(huán)節(jié)豐度較高的菌屬在開膛、沖淋、冷卻和分割環(huán)節(jié)明顯變少，從樣本菌群結(jié)構(gòu)的聚類樹可以看出，開膛和沖淋環(huán)節(jié)豬胴體表面菌落結(jié)構(gòu)相似度較高，與放血、脫毛、分割和冷卻環(huán)節(jié)均存在較大差異。開膛和末端沖淋后菌群相似度較高，且與放血和脫毛后的菌群差異顯著，說明開膛前的沖淋環(huán)節(jié)能夠有效減少前期胴體表面的微生物附著，并在后續(xù)的開膛環(huán)節(jié)得到較好保持。沖淋、冷卻和分割后的菌群組成存在差異是因為冷卻能進一步減少胴體表面微生物，而分割會加大胴體表面的微生物污染。

圖6 不同環(huán)節(jié)豬胴體表面屬水平分布熱圖Fig. 6 Heatmap of genus-level distribution of bacterial community on pig carcass surface in different links

此外，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測到的優(yōu)勢菌屬與測序結(jié)果存在差異。Dourou等發(fā)現(xiàn)，腐敗菌研究中常規(guī)的培養(yǎng)基計數(shù)并不總是對應(yīng)于HTS分析得出的微生物群落，特別是假單胞菌、不動桿菌、光細菌和弧菌科。這是由于發(fā)光菌具有耐冷性、營養(yǎng)挑剔，需要NaCl才能生長，通常（非）選擇性培養(yǎng)基檢測腐敗菌會阻礙其生長，而HTS可檢出培養(yǎng)基不能計數(shù)的細菌科和屬（即不動桿菌和弧菌科（如發(fā)光菌））。同樣地，Peruzy等通過16S rRNA擴增子測序?qū)θ饷又形⑸锶郝溥M行鑒定，并與傳統(tǒng)分離方法進行比較，發(fā)現(xiàn)除肉中常見的優(yōu)勢菌群，這兩種方法在同一樣本中檢測到的細菌種類不盡相同，這可能是因為大多數(shù)微生物不可培養(yǎng)或受培養(yǎng)溫度和時間的限制，并且每種培養(yǎng)基都具有選擇性。因此，傳統(tǒng)培養(yǎng)只能一定程度反映微生物數(shù)量以及分離鑒定特定的微生物，將傳統(tǒng)培養(yǎng)方法與HTS技術(shù)結(jié)合表征豬肉的復(fù)雜微生物區(qū)系十分必要。

3 結(jié) 論

基于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和HTS技術(shù)相結(jié)合分析不同屠宰環(huán)節(jié)豬胴體表面的細菌菌相組成，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法與HTS得出的結(jié)論較為符合且相互補充，通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法可以明確不同環(huán)節(jié)豬胴體表面各類微生物的污染情況，HTS則可以更深入解析豬胴體表面的細菌種屬組成及相對豐度變化情況，因此，將傳統(tǒng)培養(yǎng)方法與HTS技術(shù)相結(jié)合表征屠宰過程中豬胴體復(fù)雜的微生物環(huán)境非常必要。兩種方法均表明脫毛和分割環(huán)節(jié)會加重胴體的微生物污染，脫毛環(huán)節(jié)的污染可以在后續(xù)沖淋和冷卻環(huán)節(jié)中減輕，冷卻后豬胴體表面的菌落總數(shù)達到可接受水平，但分割過程中造成的污染會直接影響豬肉出庫時的微生物安全性，因此，分割環(huán)節(jié)為屠宰過程中的關(guān)鍵控制環(huán)節(jié)，對提高出庫時豬肉的微生物安全性和控制分割過程的污染尤為重要。除嚴控分割車間的低溫、對分割車間定期消毒、在操作臺旁設(shè)置熱水槽，提高工人勤洗手、刀具的意識外，還應(yīng)在分割結(jié)束后徹底清洗設(shè)備并保持干燥，開發(fā)更安全高效的消毒劑以最大程度的抑制細菌生長。另外，本研究只針對屠宰過程豬胴體的細菌菌相組成進行分析，在潮濕的屠宰分割環(huán)境中真菌也容易污染豬肉導(dǎo)致腐敗變質(zhì)，因此屠宰過程中豬胴體表面的真菌污染情況和菌群結(jié)構(gòu)也有必要進一步探索。