基于RNA-seq分析酒酒球菌SD-2a酸脅迫應(yīng)答機(jī)制

劉龍祥，彭 帥，趙紅玉，袁 林，李 華,3,4，王 華,3,4,*

（1.濱州學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，山東省黃河三角洲野生植物資源工程技術(shù)研究中心，山東 濱州 256600；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100；4.西北農(nóng)林科技大學(xué)合陽(yáng)葡萄示范站，陜西 渭南 715300）

蘋果酸乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，MLF）是葡萄酒釀造過(guò)程中的一個(gè)重要過(guò)程。MLF通常在乙醇發(fā)酵后開(kāi)始。MLF降低了總酸度，提高了葡萄酒的細(xì)菌穩(wěn)定性和感官性能。MLF作為釀酒過(guò)程中最困難的控制步驟，并不總是成功。葡萄酒的一些理化性質(zhì)，如高濃度乙醇或亞硫酸鹽和低pH值，可以抑制MLF過(guò)程。由于酒酒球菌（）對(duì)葡萄酒的惡劣環(huán)境條件具有良好的適應(yīng)能力，因此作為MLF的主要誘導(dǎo)菌株。

可以在如此惡劣的葡萄酒環(huán)境中生存，說(shuō)明體內(nèi)一定有一種或多種機(jī)制防御脅迫因素的潛在損害。最近研究提出了多種脅迫應(yīng)答機(jī)制，如細(xì)胞內(nèi)外pH值平衡、細(xì)胞膜組分和流動(dòng)性、氧化應(yīng)激反應(yīng)、DNA和蛋白質(zhì)損傷修復(fù)，但應(yīng)對(duì)酸脅迫的具體機(jī)制還不清楚。

RNA-seq是研究脅迫應(yīng)答反應(yīng)的常用方法，但只有兩項(xiàng)研究對(duì)進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組RNA-seq分析。一種檢測(cè)了3 株不同的菌株在MLF期間表型的遺傳變異，另一種聚焦于對(duì)短期酸脅迫的響應(yīng)。菌株間蛋白質(zhì)編碼基因的變異可達(dá)10%，因此利用合適的參考基因組進(jìn)行RNA-seq分析顯得尤為重要。Sternes等的研究將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)映射到PSU-1基因組，而本研究使用SD-2a基因組作為參考基因組，這是這項(xiàng)研究的特點(diǎn)之一。為了更全面、系統(tǒng)地研究的脅迫響應(yīng)機(jī)制，本研究結(jié)合生理數(shù)據(jù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

細(xì)菌脅迫應(yīng)答反應(yīng)的啟動(dòng)是一個(gè)連續(xù)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，不同階段可能會(huì)啟動(dòng)不同的應(yīng)對(duì)反應(yīng)，同一基因在不同階段可能表現(xiàn)出不同的行為。因此，在原研究的基礎(chǔ)上，延長(zhǎng)SD-2a酸脅迫處理時(shí)間，借助生理指標(biāo)進(jìn)一步探究其應(yīng)激反應(yīng)。本研究選擇SD-2a（CGMCC 0715）菌株作為研究對(duì)象，它與商業(yè)菌株（VinifloraOenos）相比具有更高的MLF能力，并且能夠在更惡劣的脅迫條件下生存。通過(guò)正常（pH 4.8）與酸脅迫（pH 3.0）處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與生物信息技術(shù)分析，篩選SD-2a酸脅迫應(yīng)答關(guān)鍵基因與關(guān)鍵通路，并通過(guò)理化指標(biāo)檢測(cè)（細(xì)胞膜完整性、細(xì)胞膜脂肪酸組成及含量、H-ATPase活性、細(xì)胞膜流動(dòng)性和胞內(nèi)pH值），驗(yàn)證并補(bǔ)充酸脅迫應(yīng)答機(jī)制，旨在為酸脅迫反應(yīng)機(jī)制的研究提供更多的數(shù)據(jù)支持，有助于深入系統(tǒng)地研究脅迫適應(yīng)性機(jī)制，為葡萄酒生產(chǎn)過(guò)程中MLF的穩(wěn)定、可控奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SD-2a分離自山東省煙臺(tái)市的葡萄酒，本實(shí)驗(yàn)保藏。

4-羥乙基哌嗪乙磺酸、三氯乙酸、纈氨霉素、尼日利亞菌素、鄰苯二醛、-巰基乙醇、硼酸、偏磷酸和四氫呋喃等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；H-ATPase assay kit上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；ATP Assay Kit、BCECF AM 上海碧云天生物技術(shù)公司；細(xì)菌RNA提取試劑盒（D6950） 美國(guó)Omega BioTek公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Premix寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QuantStudio 6 Flex熒光定量PCR儀 美國(guó)Life Technologies公司；LS55熒光分光光度計(jì) 美國(guó)PE公司；Infinite M200pro全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司；MS-5977E氣相色譜儀 美國(guó)Agilent Technologies公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)條件

將細(xì)胞置于pH 4.8的果糖-蘋果酸番茄種子（fructosmalate acid tomato broth，F(xiàn)MATB）培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)，在指數(shù)期（OD≈1）結(jié)束時(shí)收獲，在無(wú)菌燒瓶中混合后分成6 等份，分別接種于pH 3.0和pH 4.8（對(duì)照）的FMATB培養(yǎng)基中，所有實(shí)驗(yàn)都在28 ℃獨(dú)立培養(yǎng)進(jìn)行3 次。樣品分別在酸脅迫處理前（0 h）和酸脅迫或?qū)φ仗幚? h后采樣。對(duì)照處理是將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到pH 4.8的培養(yǎng)基中，去除離心和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

1.3.2 RNA提取和測(cè)序

RNA提取、cDNA文庫(kù)構(gòu)建、RNA測(cè)序和數(shù)據(jù)分析均按照Liu Longxiang等的方案進(jìn)行。序列文庫(kù)由北京博奧生物有限公司建立并測(cè)序。

1.3.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

使用SD-2a基因組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的組裝。使用FastQC（Version 0.11.5）對(duì)測(cè)序質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，然后使用NGSQC（v0.4）對(duì)低質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾。使用HISAT2對(duì)每個(gè)樣本的clean reads進(jìn)行比對(duì)。

根據(jù)Liu Longxiang等進(jìn)行樣本間基因表達(dá)分析和獨(dú)立統(tǒng)計(jì)假設(shè)檢驗(yàn)，得到表達(dá)的差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）、值和值（校正后的值）。以值或值進(jìn)行顯著性分析。|logFC|≥1（2 倍差異）、＜0.05是區(qū)分差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG）的參數(shù)。

DEG的功能注釋使用NCBI、Uniprot、ENSEMBL、基因本體論（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行。最后，利用默認(rèn)參數(shù)，通過(guò)GO和KEGG函數(shù)分析對(duì)所有DEG的主要GO和KEGG類別進(jìn)行注釋。

1.3.4 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗(yàn)證

采用real-time PCR對(duì)RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。在前人研究基礎(chǔ)上選擇基因進(jìn)行real-time PCR（表1）。real-time PCR采用與RNA-seq相同的RNA樣本，采用Primer Premier軟件（5.0版）對(duì)引物進(jìn)行篩選分析。根據(jù)、、、和的幾何均值對(duì)real-time PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。real-time PCR和數(shù)據(jù)分析按照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。

表1real-time PCR實(shí)驗(yàn)使用引物及基因描述Table 1 Gene descriptions of primer sequences used for validation of RNA-seq results by real-time PCR

1.3.5 細(xì)胞膜完整性檢測(cè)

采用熒光染料碘化丙啶測(cè)定酸脅迫處理對(duì)細(xì)胞膜完整性的影響。收集酸脅迫處理后0、1 h和3 h的菌體細(xì)胞8 000 r/min離心3 min，去上清液，使用磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.0）洗滌2 次，最后調(diào)整至OD為5，添加碘化丙啶染料（終質(zhì)量濃度為50 μg/mL）。細(xì)胞在37 ℃孵育30 min，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定，樣品以488 nm發(fā)光、630 nm熒光發(fā)射檢測(cè)。每個(gè)樣本收集20 000個(gè)細(xì)胞，使用CELLQuest程序進(jìn)行處理。

1.3.6 細(xì)胞膜脂肪酸和H-ATPase測(cè)定

按照1.3.1節(jié)的方法培養(yǎng)細(xì)胞。在酸脅迫處理前（0 h）和酸脅迫或?qū)φ仗幚? h后采樣。

采用O’Fallon等直接脂肪酸甲酯合成法提取并處理細(xì)胞脂肪酸。使用DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），采用氣相色譜測(cè)定脂肪酸甲酯組成。

色譜條件：初始溫度175 ℃，保溫1 min，隨后以5 ℃/min速率提高到240 ℃，然后保溫10 min。氮?dú)庾鳛檩d氣，流速為1 mL/min，分流比為50∶1。脂肪酸甲酯通過(guò)檢索NIST 14ms數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定。

H-ATPase活性根據(jù)H-ATPase檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7 細(xì)胞膜流動(dòng)性和胞內(nèi)pH值測(cè)定

按照1.3.1節(jié)的方法培養(yǎng)細(xì)胞。在酸脅迫處理前（0 h）和酸脅迫或?qū)φ仗幚? h后采樣。將待測(cè)細(xì)胞調(diào)整到OD為0.6，用0.25%甲醛在37 ℃固定30 min，然后用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4，0.25%甲醛）沖洗2 次。

采用分子間芘激振（0.1 μmol/L）法測(cè)定膜脂肪酸鏈的橫向擴(kuò)散，37 ℃標(biāo)記40 min，37 ℃條件下用LS55型熒光光譜儀測(cè)定。激發(fā)波長(zhǎng)為335 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為373 nm（對(duì)于單體）和470 nm（對(duì)于激態(tài)分子）（分別為5 nm和5 nm狹縫）。用準(zhǔn)分子與單體的比值（）表示橫向擴(kuò)散。

膜內(nèi)部脂酰鏈旋轉(zhuǎn)擴(kuò)散用1,6-二苯基-1,3,5-己三烯（1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene，DPH）處理后的熒光各向異性表示。菌體細(xì)胞使用5 μmol/L DPH溶液37 ℃孵育1 h后，在37 ℃下用熒光分光計(jì)進(jìn)行測(cè)定，激發(fā)波長(zhǎng)為360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為430 nm（狹縫寬度5 nm）。熒光偏振度（）和各向異性（）的計(jì)算參照Wu Chongde等方法。

細(xì)胞內(nèi)pH值（pH）使用BCECF AM試劑測(cè)定，采用Breeuwer等的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，繪制表格，使用SPSS statistic 20對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用OriginPro 8.5、TBtools v1.068進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA-seq數(shù)據(jù)驗(yàn)證

為研究酸脅迫處理影響最大的基因或者代謝通路，本研究將對(duì)照組（pH 4.8_0 h和pH 4.8_3 h）與酸脅迫處理組（pH 3.0_3 h）進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序原始數(shù)據(jù)提交至NCBI Sequence Read Archive（SRA）數(shù)據(jù)庫(kù)（登錄號(hào)SAMN08102829）。

對(duì)11個(gè)基因進(jìn)行real-time PCR以驗(yàn)證RNA-seq數(shù)據(jù)。在不同的比較組中，11個(gè)基因的real-time PCR數(shù)據(jù)與RNA-seq數(shù)據(jù)存在顯著相關(guān)性（圖1），說(shuō)明RNA-seq數(shù)據(jù)是可信的。

圖1 篩選基因的RNA-seq與real-time PCR數(shù)據(jù)對(duì)比Fig. 1 Comparison of RNA-seq and real-time PCR results for selected genes

2.2 酸脅迫對(duì)O. oeni應(yīng)答影響的整體分析

為消除離心等處理對(duì)樣品的影響，分別以pH 4.8_0 h和pH 4.8_3 h為參比條件，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析。共發(fā)現(xiàn)881個(gè)DEG。DEG數(shù)目遠(yuǎn)高于Margalef-Catala等測(cè)序數(shù)據(jù)，但低于Liu Longxiang等用酸處理SD-2a 1 h后的DEG數(shù)目。

各比較組DEG數(shù)目如圖2、3所示。其中，比較組VS1和VS2分別有644個(gè)和609個(gè)DEG，而比較組VS3有288個(gè)DEG，比較組VS3中的DEG主要是因?yàn)榕囵B(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生的差異表達(dá)，而不是因?yàn)樗崦{迫處理。這是選擇pH 4.8_0 h作為對(duì)照樣本的局限性。因此，本研究主要采用pH 4.8_3 h的樣品數(shù)據(jù)作為對(duì)照。

圖2 3個(gè)比較組共有和特有基因?qū)Ρ萔enn圖Fig. 2 Venn diagrams showing unique and shared genes among three groups

圖3 3個(gè)比較組上調(diào)基因與下調(diào)基因統(tǒng)計(jì)圖Fig. 3 Up-regulated and down-regulated genes among three groups

圖4 不同處理O. oeniSD-2a中部分DEG聚類熱圖Fig. 4 Heat map obtained from hierarchical clustering analysis of partial differentially expressed genes in O. oeni SD-2a grown under different conditions

酸性脅迫處理后DEG表達(dá)模式相關(guān)性熱圖如圖4所示。平行樣本的表達(dá)圖譜聚在同一個(gè)分支上，表明平行樣本之間具有較高的相關(guān)性，說(shuō)明影響DEG表達(dá)模式的關(guān)鍵因素是酸脅迫處理。

2.3 DEG分類和功能分析

由表2可知，GO富集的DEG主要屬于生物過(guò)程的范疇。所有組的大多數(shù)DEG（VS1、VS2和VS3）被發(fā)現(xiàn)參與代謝過(guò)程（GO：0008152）、催化活性（GO：0003824）、細(xì)胞過(guò)程（GO：0009987）、單一生物過(guò)程（GO：0044699）和結(jié)合（GO：0005488），這與Liu Longxiang等報(bào)道的DEG相似。KEGG富集結(jié)果顯示，氨基酸代謝、碳水化合物代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯途徑對(duì)酸脅迫更為敏感，而轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝、萜類和多酮類代謝、其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成、轉(zhuǎn)錄和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑變化較?。ū?）。

表2 GO數(shù)據(jù)庫(kù)富集DEG總數(shù)Table 2 Total number of differentially expressed genes enriched in GO database

表3 KEGG富集到不同代謝通路的DEG總數(shù)Table 3 Total number of differentially expressed genes enriched in KEGG pathway

2.4 O. oeni SD-2a酸脅迫應(yīng)答機(jī)制分析

2.4.1 阻隔H

細(xì)胞膜是抵御脅迫的重要手段，本研究測(cè)定了細(xì)胞膜完整性、脂肪酸成分和流動(dòng)性等脅迫應(yīng)答指標(biāo)。如圖5所示，對(duì)照組（1 h和3 h）細(xì)胞膜完整性分別為96.77%和95.88%，處于較高水平，隨時(shí)間延長(zhǎng)略有下降。處理組（1 h和3 h）細(xì)胞膜完整性分別為85.44%和83.55%，與對(duì)照組的趨勢(shì)一致。與對(duì)照組相比，處理組細(xì)胞膜完整性有所下降，但仍保持在較高水平，這保證了實(shí)驗(yàn)中有足夠的活細(xì)胞響應(yīng)酸脅迫處理，保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有指導(dǎo)意義。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)分析O. oeniSD-2a在酸脅迫和對(duì)照條件下的細(xì)胞膜完整性變化Fig. 5 Flow cytometry analysis of change in membrane integrity of O. oeni SD-2a under acid stress and control conditions

改變細(xì)胞膜的組成和流動(dòng)性是應(yīng)對(duì)外界因素脅迫的重要響應(yīng)方式，其中細(xì)胞膜脂肪酸在調(diào)整細(xì)胞膜流動(dòng)性方面起重要作用。脂肪酸的生物合成途徑的關(guān)鍵酶是乙酰輔酶a羧化酶，在酸脅迫與對(duì)照條件下表達(dá)量無(wú)顯著差異，且脂肪酸生物合成途徑中沒(méi)有富集到DEG，說(shuō)明酸脅迫處理并為改變脂肪酸的生物合成。環(huán)丙烷脂肪酸是調(diào)節(jié)細(xì)胞膜流動(dòng)性的關(guān)鍵物質(zhì)之一，環(huán)丙烷脂肪酸合成酶（cyclopropane fatty acid synthase gene，CFA）可以催化單不飽和脂肪酸生成環(huán)丙烷脂肪酸，在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的表達(dá)量也未發(fā)生顯著變化。此前有一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期酸和乙醇培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)增加，但另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，乙醇脅迫處理1 h后表達(dá)水平下降。這表明短時(shí)間脅迫處理并不會(huì)改變環(huán)丙烷脂肪酸含量，在長(zhǎng)時(shí)間的脅迫處理后，環(huán)丙烷脂肪酸開(kāi)始加速積累。

SD-2a在酸脅迫下芘差向異構(gòu)系數(shù)（）如表4所示。與0 h相比，在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組處理均降低，但對(duì)照組下降水平顯著高于實(shí)驗(yàn)組，與細(xì)胞膜側(cè)向擴(kuò)散速率呈正比，因此說(shuō)明酸脅迫條件下細(xì)胞膜側(cè)向擴(kuò)散速率較高。細(xì)胞膜軸向擴(kuò)散速率的變化通過(guò)測(cè)定細(xì)胞膜內(nèi)脂肪酸?；湹霓D(zhuǎn)動(dòng)擴(kuò)散表示。SD-2a在酸脅迫條件下表現(xiàn)出較高的熒光各向異性（），熒光各向異性與細(xì)胞膜軸向擴(kuò)散速率呈反比，即酸脅迫條件下細(xì)胞膜軸向擴(kuò)散速率較低。因此，在酸脅迫下，SD-2a保持了較高的側(cè)向擴(kuò)散速率和較低的軸向擴(kuò)散速率，較高的側(cè)向擴(kuò)散速率可以使細(xì)胞保持較高的膜流動(dòng)性，較低的軸向擴(kuò)散速率可以保證細(xì)胞內(nèi)部有穩(wěn)定的離子環(huán)境。

表4 酸脅迫條件下O. oeniSD-2a的生理生化數(shù)據(jù)Table 4 Physiological and biochemical data of O. oeni SD-2a subjected to acid stress

為研究酸脅迫對(duì)細(xì)胞生理影響，對(duì)細(xì)胞膜脂肪酸組分及含量進(jìn)行了測(cè)定（表5）。與對(duì)照組（pH 4.8_3 h）相比，總不飽和脂肪酸和總環(huán)狀脂肪酸的含量減少，細(xì)胞膜總飽和脂肪酸的含量增加，而不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸比值降低。飽和脂肪酸/飽和脂肪酸比值作為細(xì)胞膜流動(dòng)性的一個(gè)指標(biāo)，目前還沒(méi)有研究測(cè)試細(xì)胞膜流動(dòng)性與脂肪酸組成之間的直接關(guān)系。此外，環(huán)狀脂肪酸的合成沒(méi)有增加，這與基因表達(dá)水平的數(shù)據(jù)一致。

SD-2a的膜脂肪酸組成變化Table 5 Membrane fatty acid composition of O. oeni SD-2a subjected to acid stress表5 酸脅迫條件下O. oeni

本研究涉及肽聚糖合成途徑的基因幾乎全部被抑制，酸脅迫誘導(dǎo)了-丙氨酸--丙氨酸二肽酶（orf00171）催化肽聚糖的水解作用。這說(shuō)明酸脅迫抑制了能量消耗過(guò)程和細(xì)胞壁的生物合成。

這些結(jié)果表明，酸脅迫處理后，環(huán)丙烷脂肪酸、胞外聚合物和構(gòu)成細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的肽聚糖的合成下調(diào)或保持不變。由此推斷，SD-2a的抗酸脅迫能力不是通過(guò)改變脂肪酸組成和細(xì)胞壁實(shí)現(xiàn)的。

2.4.2 外排H

緩解酸脅迫的一個(gè)重要策略是將有害化合物（H）外排的系統(tǒng)，其中三磷酸腺苷結(jié)合盒（ATP binding cassette transporter，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)體發(fā)揮了重要作用。在轉(zhuǎn)錄組中與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)的121個(gè)基因中，48個(gè)基因發(fā)生差異表達(dá)。

細(xì)菌可以通過(guò)H-ATPase排出H維持細(xì)胞內(nèi)外pH值穩(wěn)定。如表6所示，編碼FF-ATPase的基因orf00563、orf00568、orf00569、orf00570在酸脅迫處理后上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明FF-ATPase在耐酸應(yīng)答中活性增加。為了證實(shí)這一點(diǎn)，測(cè)定酸脅迫處理后SD-2a的H-ATPase活性（表4）。酸脅迫處理1 h后，H-ATPase活性比對(duì)照組低6.7%。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活性有一定程度的提高，酸脅迫處理3 h后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的H-ATPase活性無(wú)顯著差異。隨著酸脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，H-ATPase的活性逐漸增強(qiáng)，從而使細(xì)胞內(nèi)pH值穩(wěn)定在較高水平，維持細(xì)胞的正常功能。H-ATPase在SD-2a的酸脅迫反應(yīng)中發(fā)揮了不可或缺的作用。

表6 在酸脅迫條件下O. oeniSD-2a部分DEGTable 6 Some genes in O. oeni SD-2a that were significantly differentially expressed under acid condition

2.4.3 中和H

另一種抵抗酸脅迫的方法是細(xì)胞質(zhì)堿化。目前，細(xì)菌中提出的產(chǎn)堿機(jī)制有氨基酸脫羧、氨基酸脫氨酶、精氨酸脫氨酶系統(tǒng)、胍丁胺脫亞胺酶系統(tǒng)、MLF、脲酶和谷胱甘肽依賴還原系統(tǒng)。但由于缺少編碼相應(yīng)酶的基因，如脲酶、谷氨酸脫羧酶、賴氨酸、谷氨酸、胍丁胺脫亞胺酶、胍丁胺脫亞胺酶系統(tǒng)等，在中未發(fā)現(xiàn)相關(guān)機(jī)制。

2.4.3.1 氨基酸合成和代謝

在釀酒過(guò)程中，氨基酸是許多風(fēng)味成分的重要前體，如高級(jí)醇類、酯類和芳香硫醇。此外，在惡劣環(huán)境下，氨基酸在細(xì)胞生長(zhǎng)和存活中起著重要作用。值得注意的是，酸脅迫處理3 h后，一些氨基酸的生物合成顯著增加。特別是，乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase，ALS）是支鏈氨基酸生物合成過(guò)程中的第1個(gè)限速酶，其表達(dá)量增加3.8 倍。精氨酸生物合成的限速酶，精氨酸琥珀酸合成酶，也顯示出表達(dá)增加2.9 倍。有報(bào)道稱，精氨酸可以誘導(dǎo)脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，如和，精氨酸也能刺激一些菌株在低pH值下的繁殖。只有少數(shù)氨基酸合成相關(guān)酶表達(dá)下降。在葡萄酒的MLF環(huán)境中，氨基酸的正常生物合成可以通過(guò)消耗游離H改善葡萄酒的品質(zhì)，降低細(xì)胞內(nèi)H的濃度。

乳酸菌中氨基酸的代謝主要包括轉(zhuǎn)氨作用、脫羧作用、脫氨基作用和脫硫作用。高濃度的生物胺會(huì)影響葡萄酒的口感與安全性。生物胺的合成需要氨基酸的脫羧作用，而精氨酸是許多葡萄和葡萄酒品種中含量最豐富的氨基酸。因此，對(duì)精氨酸的代謝可能導(dǎo)致葡萄酒質(zhì)量下降。研究表明，的精氨酸代謝是通過(guò)精氨酸脫亞胺酶途徑進(jìn)行的。該途徑的3種酶（精氨酸脫亞胺酶、鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨甲?；负桶被姿峒っ福┚憩F(xiàn)出與對(duì)照組相似的表達(dá)水平，保證了葡萄酒的安全生產(chǎn)與消費(fèi)。此外，這一代謝途徑是一個(gè)產(chǎn)生ATP的反應(yīng)，因此可以刺激的生長(zhǎng)。

2.4.3.2 蘋果酸和檸檬酸代謝

圖6 O. oeni蘋果酸和檸檬酸主要代謝通路Fig. 6 Main pathways of malate and citrate metabolism in O. oeni

蘋果酸和檸檬酸的代謝是維持pH值穩(wěn)態(tài)的重要途徑。蘋果酸的代謝主要通過(guò)MLF完成。-蘋果酸通過(guò)蘋果酸滲透酶（malate permease，MleP）的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，然后在蘋果酸乳酸酶（malolactic enzyme，MleA）的催化下脫羧形成-乳酸。MleA的催化需要NAD和Mn作為輔助因子。在本研究中，基因表達(dá)下調(diào)（藍(lán)色），蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，）基因表達(dá)上調(diào)（紅色）（圖6）。這一現(xiàn)象表明在酸性條件下，更多的-蘋果酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，而不是-乳酸。

檸檬酸代謝始于檸檬酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，由假定的檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（MaeP和YaeP）完成。檸檬酸被檸檬酸裂解酶（citrate lyase，CitE）裂解形成草酰乙酸鹽和醋酸鹽。檸檬酸代謝誘導(dǎo)香氣揮發(fā)物的產(chǎn)生，如雙乙酰和乙氨酸（圖6）。雙乙酰形成途徑中的酶的活性不受酸條件的抑制，確保了在葡萄酒的MLF過(guò)程中風(fēng)味化合物不受影響。

蘋果酸和檸檬酸的代謝消耗質(zhì)子，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)pH值升高，同時(shí)產(chǎn)生pH值梯度和膜電位。部分ATP是由特定的ATPase利用跨膜質(zhì)子動(dòng)力（proton-motive force，PMF）合成的。蘋果酸鹽和檸檬酸鹽的代謝使細(xì)胞獲得所需的能量，以維持生長(zhǎng)和pH值穩(wěn)態(tài)。

2.4.4 DNA和蛋白質(zhì)損傷修復(fù)

細(xì)菌在酸性環(huán)境中生存的一個(gè)主要問(wèn)題是低pH值對(duì)蛋白質(zhì)和DNA的潛在損害。生物體通常有能力修復(fù)DNA和蛋白質(zhì)受損的有害影響，也是如此。

MMR基因在中很少被提及，其他中也未發(fā)現(xiàn)MMR基因和。這被認(rèn)為是一種產(chǎn)生高水平多態(tài)性和提高環(huán)境適應(yīng)性的機(jī)制。本研究在SD-2a的轉(zhuǎn)錄本中發(fā)現(xiàn)了20個(gè)與DNA修復(fù)相關(guān)的基因（表6），包括之前中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的。但18個(gè)基因的表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化，其中2個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)。大部分DNA修復(fù)基因正常表達(dá)可降低低pH值下的自發(fā)突變率，保證其遺傳穩(wěn)定性。

除了MMR基因，特異性蛋白質(zhì)的合成是應(yīng)對(duì)應(yīng)激的重要途徑。最值得注意的是伴侶蛋白在酸脅迫下的活化。例如，、、、、和在3 h酸休克后SD-2a中表達(dá)增加。許多應(yīng)激相關(guān)蛋白表現(xiàn)出差異表達(dá)。其中，作為最具特征的應(yīng)激蛋白是高表達(dá)的。比Liu Longxiang等報(bào)道在酸脅迫處理1 h后該基因的倍數(shù)變化要高得多。這說(shuō)明在酸脅迫的早期反應(yīng)和長(zhǎng)期適應(yīng)過(guò)程中都發(fā)揮了作用。

2.4.5 能量產(chǎn)生與消耗

部分ATP是由特定的ATPase利用跨膜PMF合成的?？缒MF是由質(zhì)子消耗和流出產(chǎn)生，這是最終合成ATP的主要驅(qū)動(dòng)力。此外，在本研究中，酸脅迫處理后ATPase的4個(gè)亞基（、、和）表達(dá)上調(diào)，這一結(jié)果與Liu Longxiang等的報(bào)道一致，該報(bào)道表明酸脅迫1 h后這4個(gè)亞基表達(dá)水平增加。但最近研究表明，PMF的建立主要是為了提高內(nèi)部pH值，而不是為了產(chǎn)生能量。

糖酵解和三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)是細(xì)胞最重要的能量產(chǎn)生方式。但在糖酵解途徑和TCA循環(huán)中富集的關(guān)鍵基因未表現(xiàn)出差異表達(dá)。這說(shuō)明SD-2a在短期酸脅迫下不能以這種方式獲得能量。SD-2a抵御酸脅迫的能量來(lái)源可能是PMF積累，也可能是生長(zhǎng)初期積累的ATP。

SD-2a作為兼性厭氧細(xì)菌，在酸脅迫下氨基酸代謝是SD-2a產(chǎn)生ATP的重要途徑。此外，氨基酸代謝在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH值、產(chǎn)生還原力、增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)環(huán)境脅迫的抵抗力等方面發(fā)揮著重要作用。纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、甘氨酸等氨基酸生物合成途徑基因表達(dá)量顯著升高。此外，天冬氨酸、絲氨酸、甘氨酸、谷胱甘肽、精氨酸、胱氨酸和谷氨酸代謝也被酸脅迫激活。氨基酸生物合成和代謝的激活不僅提供能量，中和H，而且為脂肪、碳水化合物和蛋白質(zhì)的合成提供骨架。因此，細(xì)胞內(nèi)氨基酸的積累可以有效提高細(xì)胞在酸脅迫下的存活率。

為了研究酸脅迫后細(xì)胞內(nèi)能量的變化，測(cè)定了細(xì)胞內(nèi)ATP。如表4所示，在酸脅迫處理前，細(xì)胞內(nèi)ATP維持在較高水平。酸脅迫1 h后，ATP含量下降，這可能是SD-2a短暫的適應(yīng)反應(yīng)。隨著適應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)ATP明顯增加。SD-2a酸脅迫處理3 h后，實(shí)驗(yàn)組ATP含量達(dá)到對(duì)照組水平。說(shuō)明SD-2a能從酸性環(huán)境中獲得足夠的能量進(jìn)行正常生理活動(dòng)，有利于其在酸性條件下的生存。

綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)差異表達(dá)的基因和通路，繪制了酒酒球菌SD-2a酸脅迫應(yīng)答反應(yīng)機(jī)制示意圖（圖7）。

圖7 O. oeni SD-2a酸脅迫應(yīng)答機(jī)制示意圖Fig. 7 Schematic diagram for acid stress response mechanism in O. oeni SD-2a

3 結(jié) 論

已鑒定的DEG參與了許多過(guò)程，包括與氨基酸代謝、碳水化合物代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯相關(guān)的基因。本研究共新發(fā)現(xiàn)了40個(gè)DEG。中DEG的鑒定為進(jìn)一步的脅迫處理提供了轉(zhuǎn)錄組分析的基礎(chǔ)。

在酸脅迫條件下，為了合成更多ATP并將H泵出細(xì)胞，SD-2a的ATPase活性顯著增加，適宜的pH值可維持適宜的酶促反應(yīng)環(huán)境。通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜中總不飽和脂肪酸和總環(huán)脂肪酸的含量，可以降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性，作為抵御酸脅迫的第一道屏障。細(xì)胞內(nèi)TCA循環(huán)或ATPase產(chǎn)生的能量顯著增加，離子轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基酸代謝、DNA修復(fù)基因和伴侶蛋白的合成等有利于抗酸脅迫的能量消耗反應(yīng)顯著增加。而一些不相關(guān)的能量消耗反應(yīng)被抑制。此外，參與群體感應(yīng)、半胱氨酸和胱硫氨酸循環(huán)、雙組分系統(tǒng)和乙?；^(guò)程的一些基因在本研究中也有差異表達(dá)，這表明它們可能也參與了SD-2a的酸脅迫反應(yīng)。