熱處理中八角莽草酸對鴨腿色澤的影響

吳彬彬，傅采琪，胥 偉，郭丹郡,*，賀文杰，易 陽，王宏勛

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品加工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北省農(nóng)產(chǎn)品加工與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430023）

肉及肉制品的色澤變化受很多因素影響，例如肉的來源、肉品的加工、運(yùn)輸和貯存條件，但其根本影響因素是肉中肌紅蛋白的變化。肌紅蛋白有3種存在形式：脫氧肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白（oxymyoglobin，OMb）、高鐵肌紅蛋白（metmyoglobin，MMb），而這3種肌紅蛋白比例的變化會改變?nèi)獾某噬?。大部分肉制品在食用前都需要?jīng)過高溫加工，熱處理會改變?nèi)獾鞍椎慕Y(jié)構(gòu)與理化特性，進(jìn)而對肉品質(zhì)產(chǎn)生影響。肌紅蛋白作為主要的肌漿蛋白，在熱處理過程中發(fā)生變性，引起肉色嚴(yán)重劣變的同時(shí)還會影響其對消化酶的敏感性，降低肉的營養(yǎng)價(jià)值，最終對熟肉產(chǎn)品的保藏與銷售產(chǎn)生不良影響。

鹵制品在我國歷史悠久，因其風(fēng)味獨(dú)特、加工品種繁多，占有廣闊市場。鹵鴨是中國鹵肉制品的代表，八角作為主要鹵制香辛料，具有抑菌、抗氧化等功效。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，香辛料主效成分對鹵肉重要品質(zhì)——色澤有一定程度影響。Armida、Carolina及Akarpat等發(fā)現(xiàn)香辛料主效成分能通過抑制OMb自動氧化生成MMb，進(jìn)而改善肉制品色澤。邢淑婕等將茶多酚添加至雞腿肉中，發(fā)現(xiàn)貯藏過程中茶多酚通過抑制雞肉中丙二醛生成以及增強(qiáng)總抗氧化能力，降低肌紅蛋白氧化程度，改善鹵雞腿色澤。而關(guān)于熱處理過程中八角莽草酸對鴨腿色澤影響的研究鮮見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)探究八角提取液對鴨腿色澤的影響，并初步探討熱處理過程中八角主效成分莽草酸與肌紅蛋白在不同質(zhì)量比下對鹵鴨腿色澤的影響機(jī)制，以期為熱處理過程中香辛料對肉品質(zhì)影響機(jī)制等相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凍鴨腿 正大蛋業(yè)有限公司；牛血清蛋白（純度≥98%） 德國BioFroxx有限公司；乙醇、乙酸乙酯、Tris、甘氨酸、考馬斯亮藍(lán)、氯化鎂、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、氯化鈉、氯化鉀、乙二酸四乙酸二鈉、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonylfluoride，PMSF）、-巰基乙醇（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

F-7000型熒光分光光度計(jì)、N-500近紅外光譜儀日本日立公司；Evolation 300型紫外-可見分光光度計(jì)美國Thermo Fisher Scientific公司；TGL16M冷凍離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；FA2004B分析天平 奧豪斯儀器公司；TG16WS超速離心機(jī) 湖南長沙平凡儀器儀表有限公司；HH-2恒溫水浴鍋 金壇區(qū)白塔新寶儀器廠；UVS-1旋渦振蕩器 常州國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鴨腿肌紅蛋白制備

參考馬蘭等的方法并略有改進(jìn)。取5 g肉樣，切碎，加入50 mL緩沖液（3.5 mmol/L MgCl、4 mmol/L EDTA、70 mmol/L Tris，pH 7.4），1 000 r/min勻漿30 s后，4 ℃、5 000 r/min離心15 min，過濾上清液，即得肌紅蛋白粗提液。

1.3.2 莽草酸的制備與測定

參考程琦等的方法并略有改進(jìn)。稱取50 g經(jīng)干燥粉碎的八角粉末于1 000 mL燒杯中，加入600 mL體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液（食用級），60 ℃超聲提取2 h后，取出靜置10 min，減壓過濾，50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮定容至500 mL容量瓶中，得香辛料提取液，再經(jīng)凍干得到莽草酸提取物。

莽草酸檢測色譜條件：Agilient-ZOBAX C色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；檢測波長210 nm；流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL；流動相A為乙腈，流動相B為體積分?jǐn)?shù)0.5%磷酸溶液。

根據(jù)莽草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測定八角中莽草酸含量，莽草酸線性方程為=13 144.16-0.68，=0.999 9。本研究選取的八角莽草酸含量為0.114 1 mg/g。

1.3.3 色差測定

參照楊寧寧等和賀文杰的方法并略有改變。將八角提取液按液料比1∶25（mL/g）加入鴨腿中，鴨腿鹵制過程中每10 min進(jìn)行取樣，并采用已校準(zhǔn)的色差計(jì)測定鴨腿亮度值（*）、紅度值（*）和黃度值（*），*和*/*能客觀展示鹵鴨腿的顏色變化以及整體品質(zhì)。每個(gè)樣品表面隨機(jī)測定6個(gè)點(diǎn)后取平均值。

1.3.4 MMb及OMb相對含量測定

參考Liu Fang等的方法并略有改動。據(jù)八角提取液添加時(shí)間點(diǎn)、添加量以及該時(shí)間點(diǎn)對應(yīng)肌紅蛋白含量，制備莽草酸與肌紅蛋白質(zhì)量比分別為1∶10 000、1∶5 000、1∶2 500、1∶1 250的混合溶液，90 ℃水浴30 min，每水浴10 min分別取2 mL混合溶液以及空白組樣液，并測定其在525、545、565、572 nm波長處吸光度。以不添加莽草酸的肌紅蛋白溶液為空白組樣液。OMb及MMb相對含量分別按式（1）、（2）計(jì)算：

式中：、、分別為/、/、/。

1.3.5 分子熒光光譜測定

參考Turgut等的方法并略有改動。根據(jù)八角提取液添加時(shí)間點(diǎn)、提取液與鴨肉比例以及該時(shí)間點(diǎn)對應(yīng)肌紅蛋白含量，制備莽草酸與肌紅蛋白質(zhì)量比分別為1∶10 000、1∶5 000、1∶2 500、1∶1 250的混合溶液，90 ℃水浴30 min，每水浴10 min分別取2 mL混合溶液以及空白組樣液進(jìn)行熒光掃描，以不添加莽草酸的肌紅蛋白溶液為空白組樣液。熒光掃描條件：固定激發(fā)波長296 nm，發(fā)射波長270～350 nm，激發(fā)、發(fā)射狹縫寬度均為2.5 nm，掃描速率12 000 nm/min。

1.3.6 熱重分析

參考Kocher等的方法并略有改動。制備莽草酸與肌紅蛋白質(zhì)量比分別為1∶10 000、1∶5 000、1∶2 500、1∶1 250的混合溶液，90 ℃水浴15 min，分別對各組樣液進(jìn)行熱重分析，升溫范圍20～120 ℃，升溫速率10 ℃/min。

1.3.7 粒徑測定

參考盧巖等的方法并略有修改。將莽草酸與肌紅蛋白質(zhì)量分別按照1∶10 000、1∶5 000、1∶2 500、1∶1 250的比例混合，取混合樣液1.5 mL，10 000 r/min離心10 min，粒徑儀測定溫度25℃。

1.3.8 傅里葉變換紅外光譜分析

參考Nguyen等的方法并略有改動。制備莽草酸與肌紅蛋白質(zhì)量比分別為1∶10 000、1∶5 000、1∶2 500、1∶1 250的混合溶液，90 ℃水浴30 min，每水浴10 min取2 mL混合溶液進(jìn)行紅外光譜分析，以不添加莽草酸的肌紅蛋白溶液為空白組樣液。紅外光譜測定參數(shù)：掃描范圍500～4 500 cm，信號采集模式為衰減全反射模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱處理中八角提取液對鹵鴨腿色澤的影響

圖1 添加八角提取液對鹵鴨腿色澤的影響Fig. 1 Effect of anise extract on color of braised duck thigh

肉制品色澤是判斷其感官品質(zhì)的最直觀指標(biāo)，*和*/*共同反映鹵制品的色澤情況。由圖1可知，隨著鹵制時(shí)間延長，添加八角提取液的鹵鴨腿*、*均呈不同程度下降趨勢，說明高溫使鴨腿成熟度增大，導(dǎo)致鴨腿紅度及白度降低。*則隨著鹵制時(shí)間延長呈上升趨勢，說明在高溫條件下，八角主效成分逐漸遷移至鴨肉中，鴨腿黃度會逐漸增大。當(dāng)鹵制40 min時(shí)，添加八角提取液的鹵鴨腿*為5.00、*/*為0.34，均高于未添加提取液組（*為3.50、*/*為0.23），說明相較于空白組，八角提取液能一定程度抑制高溫對肉制品中呈色物質(zhì)（肌紅蛋白）的氧化劣變，進(jìn)而維持鹵鴨腿紅度。

2.2 莽草酸與肌紅蛋白結(jié)合機(jī)制

圖2 肌紅蛋白與莽草酸結(jié)合的Benesi-Hildebrand圖Fig. 2 Benesi-Hildebrand plot for the combination of myoglobin and star aniseed shikimic acid

熱處理過程中莽草酸與肌紅蛋白結(jié)合機(jī)制是兩者質(zhì)量比的選擇依據(jù)。由圖2可知，熱處理過程中，莽草酸與肌紅蛋白質(zhì)量比為1∶10 000、1∶5 000、1∶2 500、1∶1 250的混合溶液的1/（莽草酸質(zhì)量濃度）與相對應(yīng)的Δ/Δ均滿足Benesi-Hildebrand方程Δ/Δ=1+1/。上述結(jié)果說明熱處理過程中，肌紅蛋白與莽草酸能發(fā)生反應(yīng)，且在該質(zhì)量比條件下滿足動態(tài)結(jié)合機(jī)制。因此，本實(shí)驗(yàn)選取莽草酸與肌紅纖維蛋白質(zhì)量比為1∶10 000、1∶5 000、1∶2 500、1∶1 250，進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 莽草酸對鹵鴨腿中OMb及MMb相對含量的影響

由圖3可知，與初始值相比，熱處理10、20、30 min時(shí)空白組OMb相對含量分別減少了0.31%、0.79%、11.26%，同時(shí)MMb相對含量分別增加了7.34%、3.34%、34.51%，說明高溫條件下，OMb中亞鐵離子會被逐漸氧化形成鐵離子，進(jìn)而轉(zhuǎn)變成MMb，這也是肉制品色澤發(fā)生劣變的原因。然而，相同熱處理時(shí)間下，隨著莽草酸與肌紅蛋白質(zhì)量比增加，OMb相對含量呈先下降后上升趨勢，MMb相對含量呈先上升后下降趨勢。因此，莽草酸可能通過抑制OMb中鐵卟啉環(huán)中亞鐵離子氧化為鐵離子進(jìn)而抑制MMb生成，最終改善鹵鴨腿色澤。但是莽草酸含量過高可能會影響肌紅蛋白中的鍵合作用，進(jìn)而使鐵卟啉環(huán)中亞鐵離子暴露在外部極性環(huán)境中。這與Van Ba等發(fā)現(xiàn)溫度對肌紅蛋白狀態(tài)影響的結(jié)果相似。

圖3 熱處理時(shí)莽草酸對OMb（A）和MMb（B）相對含量的影響Fig. 3 Effect of shikimic acid on relative contents of OMb (A) and MMb (B) during heat treatment

2.4 莽草酸對肌紅蛋白熱變性的影響

表1 莽草酸對肌紅蛋白變性溫度和熱吸收的影響Table 1 Effect of shikimic acid from star aniseed on the denaturation temperature and heat absorption capacity of myoglobin

由表1可知，隨著莽草酸與肌紅蛋白比例增大，肌紅蛋白的變性溫度、初始變性溫度呈先下降后上升趨勢，熱吸收量呈先上升后下降趨勢。當(dāng)莽草酸與肌紅蛋白質(zhì)量比為1∶10 000時(shí)，肌紅蛋白變性溫度及初始變性溫度最高（92.35、117.68 ℃）、熱吸收量最低（628.42 g/J）。說明莽草酸可能通過降低肌紅蛋白熱吸收量以及抑制鐵卟啉環(huán)斷裂進(jìn)而避免亞鐵離子進(jìn)入極性環(huán)境中與活性氧結(jié)合形成鐵離子，但莽草酸含量過高可能會導(dǎo)致蛋白中化學(xué)鍵受到破壞，進(jìn)而更容易發(fā)生斷裂。

2.5 莽草酸對肌紅蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響

圖4 熱處理時(shí)莽草酸對肌紅蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響Fig. 4 Effect of shikimic acid on endogenous fluorescence intensity of myoglobin during heat treatment

分子熒光光譜法監(jiān)測熱處理過程中肌紅蛋白內(nèi)部色氨酸、酪氨酸降解情況以及鐵卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)變化，這些變化均是肌紅蛋白熱變性重要特征。肌紅蛋白中主要熒光物質(zhì)為色氨酸和酪氨酸殘基以及血紅素鐵卟啉的Soret帶，選取296 nm作為固定激發(fā)波長，在此波長下可認(rèn)為肌紅蛋白中內(nèi)源熒光來自色氨酸殘基以及血紅素鐵卟啉環(huán)。如圖4所示，當(dāng)熱處理30 min時(shí)，相較于空白組，肌紅蛋白在發(fā)射波長296 nm處的熒光強(qiáng)度均明顯增大。這說明莽草酸通過與肌紅蛋白鐵卟啉環(huán)以及色氨酸充分結(jié)合，避免鐵卟啉環(huán)、色氨酸遭到活性自由基破壞，從而防止鴨腿色澤劣變。

2.6 熱處理過程中莽草酸對肌紅蛋白粒徑的影響

圖5 熱處理時(shí)莽草酸對肌紅蛋白粒徑的影響Fig. 5 Effect of shikimic acid on myoglobin particle size during heat treatment

肌紅蛋白粒徑可以較直觀反映鹵制過程中肌紅蛋白交聯(lián)程度進(jìn)而解釋高溫條件下香辛料提取物對肌紅蛋白熱變性影響。由圖5可知，當(dāng)莽草與肌紅蛋白質(zhì)量比為1∶5 000、熱處理30 min時(shí)，肌紅蛋白粒徑由空白組的756 nm減小為183 nm，說明莽草酸可明顯抑制蛋白質(zhì)聚集進(jìn)而增加蛋白質(zhì)粒度分布從而維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，并最終使鹵鴨腿色澤達(dá)到較佳水平。這與Ince-Coskun等發(fā)現(xiàn)鹽離子以及高溫對乳清蛋白粒徑影響的結(jié)果相符。

2.7 莽草酸對肌紅蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

表2 莽草酸對肌紅蛋白二級結(jié)構(gòu)相對含量的影響Table 2 Effect of shikimic acid on the secondary structure of myoglobin%

由表2可知，熱處理30 min時(shí)，相較于空白組，莽草酸與肌紅蛋白質(zhì)量比為1∶10 000的肌紅蛋白-螺旋相對含量增加了14.55%，無規(guī)卷曲相對含量最低（31.62%），遠(yuǎn)低于空白組（46.61%）。由此可知，莽草酸能一定程度阻止熱處理中蛋白質(zhì)-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)?折疊，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)?轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，從而維持蛋白整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。因此，此時(shí)鹵鴨腿色澤達(dá)到最佳。此結(jié)果與Chen Cheng等利用近紅外光譜分析所得熱處理中肌紅蛋白二級結(jié)構(gòu)變化情況相似。

3 結(jié) 論

研究八角提取液對鹵鴨腿色澤的影響，并集中于莽草酸對肌紅蛋白結(jié)構(gòu)的影響以及相關(guān)機(jī)理進(jìn)行探究，結(jié)果表明，八角提取液能較好地抑制高溫對鴨肉中呈色物質(zhì)（肌紅蛋白）的氧化劣變，進(jìn)而維持鹵鴨腿的紅度。八角主效成分莽草酸能有效抑制OMb轉(zhuǎn)變?yōu)镸Mb，當(dāng)莽草酸與肌紅蛋白質(zhì)量比為1∶10 000、熱處理30 min時(shí)，莽草酸可降低肌紅蛋白熱吸收量，并與色氨酸結(jié)合進(jìn)而防止蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)降解，進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)莽草酸可明顯抑制蛋白質(zhì)聚集進(jìn)而增強(qiáng)蛋白質(zhì)粒度分布，并較好地保持蛋白二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，從而維持肌紅蛋白整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，最終有效改善鴨腿色澤。此結(jié)果可在為熱處理中香辛料對肉制品品質(zhì)影響機(jī)制等相關(guān)研究提供參考。