短小芽孢桿菌KX-33做種衣劑對(duì)棉花枯萎病的田間防效

李 賽，高翔宇，蘇飛鴻，顧愛星

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052

棉花枯萎病是由尖孢鐮刀菌引起的一種真菌性土傳病害，病原為為尖孢鐮刀菌萎蔫?；驼婢?[Fusarium oxysporium Schl.f.sp.vasinfectum（Atk）Snyder&Hanson]，屬半知菌亞門鐮刀菌屬[1]，危害部位為棉花維管束。關(guān)于棉花枯萎病的致病機(jī)制的研究報(bào)道，主要集中在是因?yàn)椴≡蚣闹髦参锔胁『笏a(chǎn)生的毒素致病，還是菌絲體或其產(chǎn)物堵塞導(dǎo)管而導(dǎo)致病株枯萎；有些學(xué)者認(rèn)為,當(dāng)尖孢鐮刀菌從根毛侵入寄主植物后,擴(kuò)展到導(dǎo)管周圍,果膠酶等水解酶、分泌纖維素酶,用來降解寄主植物細(xì)胞壁,植物細(xì)胞壁被降解以后，細(xì)胞內(nèi)的果膠等物質(zhì)就會(huì)堵塞寄主植物的導(dǎo)管,寄主植物因吸水困難而萎蔫致死，即阻塞學(xué)說[2];有些學(xué)者認(rèn)為尖孢鐮刀菌侵入寄主植物之后,會(huì)分泌一些有毒物質(zhì),這些毒素在尖孢鐮刀菌致病過程中起著重要作用。目前發(fā)現(xiàn)的毒素有鐮刀菌酸、恩鐮孢毒素、脫氫鐮刀菌酸、串珠鐮刀菌素、白僵菌素、伏馬菌素、麥角固醇、卡毒素以及玉米赤烯酮等。這些有毒物質(zhì)能損傷寄主植物根系，也會(huì)影響種子萌發(fā)，呂金殿等證實(shí)了病原菌毒素蛋白是棉花致病的關(guān)鍵，即毒素學(xué)說[3]。由于枯萎病為土傳真菌病害，通過田間噴灑普通化學(xué)農(nóng)藥等解決棉花枯萎病危害效果不明顯，并加大了對(duì)環(huán)境的污染[4]。為了響應(yīng)國家的綠色防治的號(hào)召，培育抗病棉花新品種和生物防治是解決這一問題的有效途徑。

現(xiàn)階段的研究中已發(fā)現(xiàn)許多對(duì)棉花枯萎病菌有抑制作用的拮抗微生物[5][6]，經(jīng)過大量的試驗(yàn)驗(yàn)證，許多拮抗微生物被開發(fā)為生防產(chǎn)品逐步走向?qū)嶋H應(yīng)用[7]。周京龍[8]等發(fā)現(xiàn)蠟狀芽孢桿菌YUPP-10菌株能抑制尖鐮孢的生長、促進(jìn)棉花部分生物量指標(biāo)的增長并控制枯萎病的危害；賈熙超[9]等發(fā)現(xiàn)生防菌JNJX-2多粘類芽孢桿菌是通過抑制病原菌絲和孢子發(fā)揮作用的，抑菌物質(zhì)通過菌絲發(fā)生溶斷、原生質(zhì)溢出、孢子壁破碎等途徑使病原菌無法再侵染宿主植物；丁建朋[9]等研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌HFW217對(duì)棉花枯萎病的預(yù)防和治療作用顯著，溫室和田間對(duì)棉花枯萎病防治效果分別達(dá)到77.62%和73.18%；李玉洋[10]等從土壤中分離出的解淀粉芽孢桿菌SN06，其拮抗作用具有較好的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性與蛋白酶穩(wěn)定性，接種解淀粉芽孢桿菌SN06可顯著降低枯萎病的發(fā)病指數(shù),平均防效高達(dá)65.19%。

新發(fā)展階段，由于國家對(duì)環(huán)境污染和生態(tài)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的重視，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)也要遵循綠色、健康、高效的發(fā)展理念，生物型種衣劑以其對(duì)環(huán)境無殘留、無污染且安全性好等優(yōu)點(diǎn)成為棉花病蟲害防治的重要發(fā)展方向[11]。

本實(shí)驗(yàn)將已在室內(nèi)進(jìn)行防治效果初步鑒定的生防菌短小芽孢桿菌KX-33為主要成分制作種衣劑，研究其在田間的實(shí)際防治效果，為新型微生物種衣劑的制作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試棉種

選用抗病品種：10719；耐病品種：10857；感病品種：10900。

1.1.2 供試種衣劑

羧甲基纖維素鈉（滬試）。

1.1.3 供試微生物與藥劑

拮抗微生物；由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院棉花病害研究室篩選出具有對(duì)棉花枯萎病較好拮抗作用的的短小芽孢桿菌KX-33。

病原菌：棉花枯萎病病原菌。

藥劑：0.3%四霉素水劑(遼寧微科生物工程股份有限公司)，200億/g枯草芽孢桿菌微生物菌劑（山東慧可豐生物有限公司），8%寧南霉素水劑（淹溶生物股份有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 拮抗菌菌液制備

挑取純化的拮抗菌KX-33單菌落，接種至裝有100mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液的250mL三角瓶中，進(jìn)行搖菌處理使拮抗菌快速繁殖，將孢子懸液濃度調(diào)至1×108CFU/mL備用。

1.2.2 種衣劑的制作

設(shè)置菌液與成膜劑用量比例為100∶1，種衣劑成分包括KX-33菌液、成膜劑、LB液體培養(yǎng)基，含KX-33種衣劑現(xiàn)配現(xiàn)用，種衣劑與種子比例為1∶100[12]。

選用有效成分含量為200億/g枯草芽孢桿菌微生物菌劑與成膜劑按照100∶1混合，制成50mL液體種衣劑，現(xiàn)配現(xiàn)用。成分為成膜劑、去離子水。選用有效成分含量為0.3%四霉素水劑和8%寧南霉素水劑，配制成1g/mL藥液，與成膜劑按照100∶1混合，制成50mL液體種衣劑，現(xiàn)配現(xiàn)用[13]。

將各配好種衣劑分別與棉花種子拌種包衣，晾干備用。

1.2.3 田間病原菌接種

利用菌包培養(yǎng)物法進(jìn)行田間致病菌的接種操作：將病原菌活化培養(yǎng)后，挑取菌餅進(jìn)行180 r/min、30℃搖菌培養(yǎng)7d，將菌液裝入菌包中于以進(jìn)行消毒殺菌的陰涼倉庫內(nèi)靜置培養(yǎng)，待菌包長滿菌絲于7月15日棉花現(xiàn)蕾期剖開撒入距棉株根部10cm下的土壤中埋藏，及時(shí)澆水以保證菌種活性[14]。

1.2.4 田間防效試驗(yàn)

選取健康飽滿的棉種進(jìn)行脫絨處理，滅菌清洗后晾干[14]。試驗(yàn)設(shè)置五組處理：KX-33、枯草芽孢桿菌、寧南霉素與四霉素處理以及無菌水對(duì)照，每組處理三次隨機(jī)重復(fù)。每次重復(fù)為2.5×2m小區(qū)，穴間距為10cm，每穴兩粒，出苗后進(jìn)行定苗間苗操作。田間進(jìn)行常規(guī)管理，病原菌接種后，自接種后20d開始，每隔15d進(jìn)行一次病情記錄，至9月20進(jìn)行剖稈數(shù)據(jù)收集，統(tǒng)計(jì)總?cè)~數(shù)及發(fā)病葉數(shù)。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下[15]：

表1 病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

表2 田間病情考察分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

病情指數(shù)=∑（該級(jí)植株數(shù)×病害等級(jí)）/（調(diào)查植株數(shù)×最嚴(yán)重等級(jí)）×100；

防治效果（%）=[（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)]×100[15]。

1.2.5 農(nóng)藝性狀調(diào)查

在8月份末，對(duì)棉花的農(nóng)藝性狀展開調(diào)查，測(cè)量各項(xiàng)生長性狀，并記錄數(shù)據(jù)：株高、始節(jié)高、果枝數(shù)、有效果枝數(shù)、鈴數(shù)、有效鈴數(shù)；并在田間對(duì)每次處理選取連續(xù)的10株棉花，室內(nèi)記錄棉花的平均籽棉重、平均皮棉重。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel和SPSS20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間防效分析

由表4可知，三種不同抗病品種在個(gè)處理下病情指數(shù)均顯著低于對(duì)照。其中抗病品種10719在枯草芽孢桿菌處理下病情指數(shù)均為最低，最低為6.58；耐病品種10857在枯草芽孢桿菌處理下病情指數(shù)最低，為6.87。三種品種在枯草芽孢桿菌處理下均為最低，KX-33處理下各品種的病情指數(shù)與防效均與枯草芽孢桿菌相近。

表3 8月5日病情防效

表4 8月20日病情防效

由4張病情指數(shù)表中可知，四種處理的最高防效依次為58.72%、56.49%、62.48%和60.83%。防效從8月5日隨時(shí)間逐漸下降至9月20日收獲期前各個(gè)處理的防效分別下降至44.42%、42.92%、47.28%、46.10%，總體防效水平為枯草芽孢桿菌處理＞KX-33處理＞寧南霉素處理＞四霉素處理。就品種水平而言抗病品種10719對(duì)微生物種衣劑的敏感程度較高，防效表現(xiàn)明顯優(yōu)于其他兩種棉花品種。實(shí)驗(yàn)證明KX-33種衣劑處理的防效表現(xiàn)良好，對(duì)棉花枯萎病有較強(qiáng)的抑制作用。

表5 9月5日病情防效

表6 9月20日病情防效

2.2 農(nóng)藝性狀分析

四組藥劑對(duì)棉株的農(nóng)藝性狀具有不同程度的促生效果，對(duì)各項(xiàng)農(nóng)藝性狀的增益效果有所差異。株高方面，KX-33處理下的株高較對(duì)照組增長尤為明顯，增幅為7.81%，最高為66.73 cm；始節(jié)高方面，枯草芽孢桿菌處理下較對(duì)照組增長尤為明顯，增幅為16.16%，最高始節(jié)高為18.23cm；果枝數(shù)、鈴數(shù)方面四種處理均略高于對(duì)照組且四種處理之間的差異不明顯；產(chǎn)量方面，KX-33處理的皮棉與籽棉產(chǎn)量相較于其他處理增產(chǎn)效果顯著，相較于對(duì)照組增產(chǎn)幅度為19.14%和13.38%。KX-33棉株的促生效果的增益顯著，對(duì)株高、始節(jié)高、皮棉和籽棉產(chǎn)量等方面均有影響。

表7 藥劑對(duì)棉花農(nóng)藝性狀的影響（10719）

表8 藥劑對(duì)棉花農(nóng)藝性狀的影響（10765）

表9 藥劑對(duì)棉花農(nóng)藝性狀的影響（10900）

3 討論

現(xiàn)階段在田間的實(shí)際生產(chǎn)中，由于價(jià)格、購買途徑和使用方法等原因，微生物菌劑的市場(chǎng)占比依舊較少，仍以化學(xué)藥劑為主。

在田間防效實(shí)驗(yàn)中，含短小芽孢桿菌KX-33的種衣劑包衣的三個(gè)品種，均對(duì)棉花枯萎病表現(xiàn)出良好的防治效果，總體防效表現(xiàn)中品種10719的防效表現(xiàn)較優(yōu)，防效率最高為60.83%，柳自清[13]等的盆栽防效實(shí)驗(yàn)中的盆栽防效試驗(yàn)中接種棉花枯萎病第45d時(shí)，1×108CFU/mL濃度微生物種衣劑處理下對(duì)兩個(gè)品種棉花的防效均最好，分別為65.35%和63.77%，略高于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果；賈熙超[16]通過盆栽實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株JNJX-2對(duì)棉花枯萎病有一定的防治作用，防效為54.77%，低于本試驗(yàn)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)中的防效數(shù)據(jù)略低于柳自清室內(nèi)防效試驗(yàn)，分析原因可能是田間的發(fā)病效果更加嚴(yán)重。

后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可以將拮抗菌與藥劑或者微生物菌劑混合進(jìn)行協(xié)同防治效果的研究，繼續(xù)優(yōu)化種衣劑配方，為微生物種衣劑的開發(fā)提供參考依據(jù)。