液質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定人血中他克莫司及肌酐的濃度

孫國(guó)祥 饒志 魏玉輝

蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

他克莫司（Tacrolimus，F(xiàn)K506）是一種從霉菌養(yǎng)物中分離的新型免疫抑制劑，其免疫抑制活性為環(huán)孢素A 的50～100 倍，目前已在肝臟、腎臟、心臟、胰腺等器官移植中得以廣泛應(yīng)用［1］。雖然他克莫司已成為器官移植術(shù)后及自身免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病治療的一線(xiàn)用藥，但由于在其應(yīng)用中存在治療窗窄，患者個(gè)體差異較大，且不良反應(yīng)（如腎毒性、神經(jīng)毒性、糖耐量下降、肝功能異常、高血壓等）發(fā)生率較高等問(wèn)題，在臨床患者應(yīng)用其治療時(shí)需進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)。此外，在他克莫司的諸多不良反應(yīng)中，腎毒性對(duì)患者機(jī)體的損害尤為突出，因此在他克莫司的臨床應(yīng)用過(guò)程中，還須監(jiān)測(cè)血肌酐濃度，以對(duì)患者腎功能做出評(píng)估。目前關(guān)于LC-MS/MS 法應(yīng)用于他克莫司全血濃度的測(cè)定方法已有大量研究［2-4］，但應(yīng)用LC-MS/MS 同時(shí)進(jìn)行人血中他克莫司及肌酐的定量測(cè)定方法尚未見(jiàn)報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)擬建立一種快速、靈敏、專(zhuān)屬性強(qiáng)的LC-MS/MS 同時(shí)測(cè)定人全血中他克莫司及肌酐濃度的方法，并將其應(yīng)用于臨床血藥濃度測(cè)定中。

1 材料

1.1 儀器 安捷倫1260 型高效液相色譜儀，安捷倫6460 型串聯(lián)質(zhì)譜質(zhì)譜儀；高速離心機(jī)（深圳國(guó)華儀器廠）；SHZ-Ⅲ型循環(huán)真空水泵（上海亞榮生化儀器廠），LT-224S 電子天平（北京賽多利斯）；XW-80A 漩渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）。

1.2 試劑 他克莫司標(biāo)準(zhǔn)品（浙江省食品藥品檢驗(yàn)所，純度：97.7%，批號(hào)：20120314）；子囊霉素對(duì)照品（湖北威德利化學(xué)科技有限公司，純度97.5%，批號(hào)：100101）；肌酐對(duì)照品（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，純度99.0%，批號(hào)：17110323）；乙腈為色譜純，購(gòu)自山東禹王實(shí)業(yè)公司禹城化工廠；甲醇為色譜純，購(gòu)自德國(guó)默克公司；去離子水為蘭州大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱選用安捷倫Zorbax Eclipse Plus C18 柱（4.6mm×100mm，3.5μm）；流動(dòng)相為甲醇-水溶液等度洗脫，洗脫比例為85 ∶15；流速為1mL/min，應(yīng)用三通進(jìn)行柱后分流（分流比1 ∶4，v/v）；柱溫為50℃；進(jìn)樣量為20μL。

2.2 質(zhì)譜條件 離子源選用電噴霧離子源（ESI）；毛細(xì)管電壓為5000V；干燥氣溫度為350℃；干燥氣流速為11L/min；霧化氣壓力40psi；應(yīng)用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）進(jìn)行正離子掃描，EMV 設(shè)定為200V。MRM 監(jiān)測(cè)離子對(duì)：他克莫司m/z 826.2 →616.1，碰撞能36V，碎裂電壓200V；肌酐m/z 114.3 →44.0，撞能量16 V，碎裂電壓60V；子囊霉素（內(nèi)標(biāo)）m/z 814.1 →604.0，碰撞能量36V，碎裂電壓200V。該質(zhì)譜條件下他克莫司、肌酐及子囊霉素的子離子掃描質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 他克莫司（A）、肌酐（B）及子囊霉素（C）的子離子掃描質(zhì)譜

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液配制 取他克莫司對(duì)照品適量，約相當(dāng)于他克莫司2.0mg，精密稱(chēng)定。置于5mL容量瓶中，用乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度約為390.8μg/mL 的他克莫司儲(chǔ)備液；稱(chēng)取肌酐標(biāo)準(zhǔn)品適量，約相當(dāng)于肌酐1.5mg，精密稱(chēng)定，置于10mL容量瓶中，用乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，配置成質(zhì)量濃度約為150.0μg/mL 的肌酐儲(chǔ)備液；取子囊霉素對(duì)照品適量，約相當(dāng)于子囊霉素2.1mg，置于5mL 容量瓶中，用乙腈稀釋后配成420.0μg/mL 的子囊霉素儲(chǔ)備液。將上述試劑置于4℃冰箱中儲(chǔ)存。

2.4 樣品處理 離心管中加入全血樣品200μL，然后依次加入10μL 濃度約為420ng/mL 的內(nèi)標(biāo)工作液及20μL 飽和硫酸鋅溶液，渦旋混勻，加入1mL 甲基叔丁基醚，渦旋1min，14000r/min 離心8min，取上層有機(jī)相800μL 于另一離心管中，室溫下氮?dú)獯蹈?，加?00μL流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋混勻，14000r/min 離心5min，取上清液進(jìn)樣20μL。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備 將他克莫司儲(chǔ)備液及肌酐儲(chǔ)備液用乙腈稀釋成系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中含他克莫司質(zhì)量濃度約為390.8、195.4、97.7、48.85、24.43、12.21、6.11ng/mL，含肌酐質(zhì)量濃度約640、320、160、80、40、20、10μg/mL。精確吸取上述系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各50μL，分別加入空白全血450μL，配置成含他克莫司質(zhì)量濃度約為39.08、19.54、9.77、4.89、2.44、1.22、0.61ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)全血樣品，其中含肌酐質(zhì)量濃度約64、32、16、8、4、2、1μg/mL。按“2.4”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣分析。他克莫司以濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)進(jìn)行為回歸分析后求得回歸方程；肌酐也以其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，其扣除本底后的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析后求得回歸方程。

2.6 方法學(xué)確證

2.6.1 專(zhuān)屬性。本研究色譜質(zhì)譜條件下他克莫司、肌酐以及內(nèi)標(biāo)的峰形良好，保留時(shí)間分別在1.2min，2.9min及2.8min，全血中其他內(nèi)源性物質(zhì)不干擾分析物測(cè)定，其色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 他克莫司及肌酐的人全血LC-MS/MS 色譜圖

2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及定量范圍。本方法中，他克莫司測(cè)定的回歸方程為Y=0.926099X+0.033751，R2=0.9991，線(xiàn)性范圍為0.61～39.08ng/mL，最低定量限為0.15ng/mL（S/N＞10）；肌酐測(cè)定的回歸方程為Y=56.761118X+294.809368，R2=0.9998，線(xiàn)性范圍為1～64μg/mL，最低定量限為0.5μg/mL（S/N＞10）。本研究中他克莫司及肌酐在全血中的定量范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，符合測(cè)定要求。

2.6.3 精密度。按“2.5”項(xiàng)下方法配制高、中、低3 個(gè)濃度樣品，每個(gè)濃度分別測(cè)定，1 天內(nèi)測(cè)定5 次，此為日內(nèi)精密度；連續(xù)配制3 天，每天分別測(cè)定，此為日間精密度，其檢測(cè)結(jié)果如表1 所示。

表1 他克莫司及肌酐在人全血中的精密度（n=6，±s）

表1 他克莫司及肌酐在人全血中的精密度（n=6，±s）

檢測(cè)物 添加濃度 日內(nèi)精密度 日間精密度測(cè)定濃度 RSD（%） 測(cè)定濃度 RSD（%）1.21 1.08±0.13 12.04 1.11±0.15 13.32 4.89 4.81±0.31 6.44 5.36±0.48 8.94 19.54 19.03±1.07 5.62 18.75±1.32 6.98肌酐（μg/mL）他克莫司（ng/mL）2 1.98±0.16 8.24 1.73±0.14 7.93 8 9.83±0.37 3.76 9.92±0.52 5.25 32 30.56±1.01 3.31 31.2±1.24 3.98

2.6.4 基質(zhì)效應(yīng)及提取回收率。取空白全血18 份，除以相同體積乙腈替代標(biāo)準(zhǔn)溶液、內(nèi)標(biāo)溶液外，其余按“2.5”項(xiàng)下操作，在氮?dú)獯蹈珊蠹尤牒?、中、高濃度混合?biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)的流動(dòng)相溶液各6 份，進(jìn)樣記錄所得他克莫司及肌酐濃度數(shù)據(jù)為SET1；配制低、中、高濃度乙腈溶液的質(zhì)控樣品各6 份，進(jìn)樣記錄所得數(shù)據(jù)為SET2；配制低、中、高濃度乙腈溶液質(zhì)控樣品各6 份，依照“2.5”項(xiàng)操作，所得結(jié)果記為SET3，以SET1：SET2計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，SET3：SET1 計(jì)算提取回收率，所得RSD值小于13.8%，質(zhì)控結(jié)果符合樣品測(cè)定要求。

2.6.5 穩(wěn)定性。本研究中血樣經(jīng)凍融3 次、室溫條件靜置8h 及-80℃冰箱凍存21 天后測(cè)定，其RSD 值均小于10.7%，表明待測(cè)物在該條件下穩(wěn)定，符合測(cè)定要求。

2.7 方法學(xué)應(yīng)用 本研究共選取12 例患者，應(yīng)用他克莫司治療，均為口服給藥，給藥間隔12h，抽取其達(dá)藥物穩(wěn)態(tài)谷濃度后的靜脈血進(jìn)行測(cè)定，其臨床資料及測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 12 例患者的臨床資料、他克莫司及肌酐在血中的濃度

3 討論

目前應(yīng)用于他克莫司血藥濃度監(jiān)測(cè)的方法有微粒酶免疫分析法（MEIA 法）［5］、酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）［6］及液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS/MS）等。ELISA 法和MEIA 法測(cè)定時(shí)，體內(nèi)代謝物可能與原藥產(chǎn)生交叉反應(yīng)，其測(cè)定結(jié)果較LC-MS/MS 將明顯偏高［7-8］，而LC-MS/MS 由于具有專(zhuān)屬性強(qiáng)，靈敏度及準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，從而能更準(zhǔn)確反映他克莫司原型藥物的體內(nèi)血藥濃度特征，因此適用于他克莫司治療藥物監(jiān)測(cè)及藥代動(dòng)力學(xué)研究，并被用來(lái)作為該藥物測(cè)定方法的參考金標(biāo)準(zhǔn)［9］。他克莫司的LC-MS/MS 法測(cè)定前處理方法有沉淀蛋白法、液液萃取法及固相萃取法等，本研究在方法建立時(shí)需綜合考慮各種前處理方法對(duì)人血液中他克莫司及肌酐測(cè)定的影響，經(jīng)實(shí)驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)沉淀蛋白及液液萃取兩種方法較固相萃取法簡(jiǎn)單、省時(shí)，適合應(yīng)用于治療藥物監(jiān)測(cè)中，而沉淀蛋白法內(nèi)源性物質(zhì)去除能力不如液液萃取法，在對(duì)他克莫司及肌酐進(jìn)行同時(shí)測(cè)定時(shí)會(huì)影響樣品測(cè)定的穩(wěn)定性及靈敏度，因此本研究確定選用液液萃取法做樣品前處理。在對(duì)二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚、甲基叔丁基醚等不同種類(lèi)的萃取試劑及這些試劑不同比例的相互配比進(jìn)行反復(fù)實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，單用甲基叔丁基醚對(duì)待測(cè)物及內(nèi)標(biāo)的萃取效果最為穩(wěn)定，因此本研究選用甲基叔丁基醚作為萃取試劑。在色譜條件的優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)，柱溫對(duì)他克莫司及內(nèi)標(biāo)峰形的影響至關(guān)重要，柱溫越高其峰形及響應(yīng)越好，但過(guò)高的柱溫勢(shì)必對(duì)色譜柱造成較大損傷，因此本研究在嘗試不同柱溫后，最終確定檢測(cè)柱溫為50℃，待測(cè)物及內(nèi)標(biāo)的峰形均較為理想。

腎毒性是他克莫司治療過(guò)程中主要的不良反應(yīng)之一，患者在服用此藥物后可造成經(jīng)常性腎功能異常以及偶發(fā)性或特異性腎組織受損、透析依賴(lài)性腎功能衰竭、蛋白尿、血尿、腎水腫等，還可導(dǎo)致溶血性尿毒癥及腎小球病的發(fā)生，因此在他克莫司的治療過(guò)程中必須密切關(guān)注腎功能的變化。肌酐是人體內(nèi)的小分子內(nèi)源性物質(zhì)，可通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)，且在腎小管內(nèi)很少被重吸收，因此血肌酐是評(píng)價(jià)腎功能的重要指標(biāo)之一。肌酐的正常值參考范圍為4.98～12.21μg/mL，在本研究選取的12 例檢測(cè)樣本中有5 例肌酐值明顯高于正常范圍，檢測(cè)結(jié)果提示此5 例患者可能發(fā)生了不同程度的腎損傷，在后期的用藥及治療中應(yīng)密切監(jiān)測(cè)血藥濃度及腎功能變化情況，防止嚴(yán)重腎毒性的發(fā)生。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立的應(yīng)用LC-MS/MS 同時(shí)測(cè)定血中他克莫司及肌酐的方法，操作簡(jiǎn)單、快速且精密、準(zhǔn)確，可應(yīng)用于他克莫司的治療藥物監(jiān)測(cè)中。