低氧條件下HIF-1α 與VEGF 在宮頸癌Hela 細(xì)胞中的表達(dá)

苗麗娟 武梅 孫禮 王劍 毛寶宏 武美麗 姚婷婷 王曉霞 劉青

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730050

宮頸癌是最常見的婦科癌癥之一，近年來，發(fā)病率和死亡率逐年上升，引起全球關(guān)注［1-2］。宮頸癌發(fā)病的因素較多，近年來一些研究表明，低氧微環(huán)境對(duì)癌癥的發(fā)生發(fā)展有重要影響，低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor、HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作為已被證明在癌癥發(fā)生歷程中有直接影響的重要轉(zhuǎn)錄因子，在宮頸癌形成階段的作用是一個(gè)值得被研究的領(lǐng)域［3-5］。本研究通過三氣培養(yǎng)箱模擬缺氧條件下對(duì)人宮頸癌Hela 細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，探究低氧條件下HIF-1α 和VEGF 在宮頸癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄變化規(guī)律，探討宮頸癌治療和改善預(yù)后的新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人宮頸癌Hela 細(xì)胞（甘肅省動(dòng)物細(xì)胞創(chuàng)新中心）；HIF-1α 多克隆抗體；VEGF 多克隆抗體；Cy3-labeled Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；DMEM 高糖細(xì)胞培養(yǎng)液（蘭州百靈生物技術(shù)有限公司）；新生牛血清NBS；聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）；Normal Goat Serum（原液）（蘭州民海生物工程有限公司）；4%多聚甲醛；DAPI solution（ready-to-use）（北京索萊寶生物科技有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇人宮頸癌Hela 細(xì)胞，在37℃、5%CO2、飽和濕度的普通培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞單層融合率約為80%且形態(tài)正常、長勢良好時(shí)傳代，分為低氧培養(yǎng)組與常氧培養(yǎng)組兩組。

1.3 細(xì)胞低氧及常氧培養(yǎng)環(huán)境的建立 常氧：普通培養(yǎng)箱設(shè)置條件為37℃，CO2濃度5%、O2濃度21%。低氧：低氧培養(yǎng)箱設(shè)置條件為37℃，CO2濃度5%、O2濃度5%。

1.4 細(xì)胞爬片 常氧和低氧兩組細(xì)胞分別通過胰蛋白酶消化法消化、離心，制成細(xì)胞懸液，均勻鋪于6 孔板中爬片，并分別在相應(yīng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)48h，待細(xì)胞單層融合率約80%～90%時(shí)用4%多聚甲醛固定。

1.5 免疫熒光染色 固定完成的細(xì)胞爬片用PBS 溶液清洗后加入0.5%Triton X100 通透液，室溫通透15～20min；待細(xì)胞膜通透完成后再次用PBS 浸洗3 次并吸干多余液體，加入提前用原液稀釋的Normal GoatSerum，在室溫條件下封閉30min；30min 后用濾紙吸去封閉液，分別加入稀釋好的一抗HIF-1α 和VEGF（稀釋比例1 ∶300），在4℃冰箱中孵育12h。一抗孵育完成后洗脫雜質(zhì)，滴入適量熒光二抗，37℃孵育2h 后在避光環(huán)境下用DAPI 染液將細(xì)胞核復(fù)染，洗脫雜質(zhì)后封片以備觀察。利用熒光顯微成像系統(tǒng)采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖片，控制曝光時(shí)間和激發(fā)光電壓等參數(shù)條件相同。

1.6 數(shù)據(jù)分析 使用數(shù)據(jù)分析軟件Image pro plus6.0對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行測量，Graphpad Prism 8 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，每組結(jié)果選取5 個(gè)隨機(jī)視野進(jìn)行測量。t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF 的表達(dá)情況 細(xì)胞核與細(xì)胞漿中均存在VEGF 陽性表達(dá)。見圖1。使用圖片處理軟件對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)：低氧培養(yǎng)條件下VEGF 在Hela 細(xì)胞中所展現(xiàn)的熒光強(qiáng)度值高于常氧培養(yǎng)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見圖2、表1。

表1 VEGF 熒光強(qiáng)度檢測結(jié)果

圖1 VEGF 熒光染色結(jié)果

圖2 VEGF 熒光強(qiáng)度檢測結(jié)果

2.2 HIF-1α 的表達(dá)情況 細(xì)胞核中存在HIF-1α 大量陽性表達(dá)。見圖3。使用圖片處理軟件對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)：低氧培養(yǎng)條件下HIF-1α 在Hela 細(xì)胞中所展現(xiàn)的熒光強(qiáng)度值高于常氧培養(yǎng)組，低氧培養(yǎng)組的細(xì)胞中HIF-1α 熒光強(qiáng)度與常氧培養(yǎng)組中相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見圖4、表2。

表2 HIF-1α 熒光強(qiáng)度檢測結(jié)果

圖3 HIF-1α 熒光染色結(jié)果

圖4 HIF-1α 熒光強(qiáng)度檢測結(jié)果

3 討論

宮頸癌是一種嚴(yán)重危害婦女健康的惡性腫瘤，在國際癌癥研究機(jī)構(gòu)提供的全球2018 癌癥發(fā)病率和死亡率統(tǒng)計(jì)中，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率均排在第四位［6］。造成宮頸癌患者死亡的大多數(shù)原因是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。目前已經(jīng)有大量研究證實(shí)HIF-1α 及VEGF 在宮頸癌Hela 細(xì)胞中高表達(dá)，研究［7］表明，在腫瘤細(xì)胞中HIF-1α 和VEGF 的高表達(dá)預(yù)示著更高的侵襲性和增殖性。

缺氧通常貫穿癌癥病程的始終，誘導(dǎo)細(xì)胞代謝過程中適應(yīng)性改變，包括從氧化磷酸化到糖酵解的轉(zhuǎn)變，增加糖原合成，以及從葡萄糖到谷氨酰胺的開關(guān)作為脂肪酸合成的主要基材。這類廣泛的代謝變化由HIF-1α的表達(dá)水平協(xié)調(diào)以平衡供氧和需求［8］。HIF-1α 是腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧而產(chǎn)生的一種核轉(zhuǎn)錄因子。在缺氧微環(huán)境下能夠激活其轉(zhuǎn)錄活性，使腫瘤的一些生物學(xué)特性改變，這些生物學(xué)特性包括腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移以及腫瘤血管的形成等［9］。HIF-1α 也伴隨腫瘤的抑制劑（如VHL）功能和致癌因子增益損失，導(dǎo)致（PI3K / AKT /MTOR）活性在癌細(xì)胞內(nèi)被激活，并介導(dǎo)癌癥發(fā)展和抗治療的代謝改變［4］。大量研究證實(shí)，VEGF 在多種人類腫瘤中均過度表達(dá)，是腫瘤血管生成的主要調(diào)控者。阻斷HIF-1α 從而減少VEGF 的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，可以抑制腫瘤的生長。研究表明HIF-1α/VEGF-A 軸是癌癥免疫的必需組成部分［10］。滲透腫瘤的毒性T 細(xì)胞在腫瘤內(nèi)缺氧的微環(huán)境適應(yīng)過程中調(diào)動(dòng)HIF-1α。HIF-1α對(duì)于CD8+T 細(xì)胞的效應(yīng)狀態(tài)至關(guān)重要。CD8+T 細(xì)胞中HIF-1α 的喪失可以降低腫瘤的浸潤能力和細(xì)胞殺傷，并減弱腫瘤的血管化。若CD8+T 細(xì)胞內(nèi)缺失VEGFA，HIF 靶基因則促使腫瘤發(fā)生過程加速并同時(shí)促進(jìn)血管化改變。有研究顯示VEGF-A 表達(dá)和CD8+T 細(xì)胞侵襲能力之間的關(guān)系呈反比。

低氧狀態(tài)能促使HIF-1α 和VEGF 在Hela 細(xì)胞中蛋白水平增高。本研究通過細(xì)胞免疫熒光染色Hela細(xì)胞，證實(shí)HIF-1α 及VEGF 在缺氧及常氧條件下的蛋白表達(dá)存在差異，在缺氧條件下，HIF-1α 及VEGF 均高表達(dá)，并且主要分布于細(xì)胞核中。提示HIF-1α 可能通過某種細(xì)胞信號(hào)通路影響VEGF 表達(dá)。有研究認(rèn)為，HIF-1α 通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)VEGF 表達(dá)，主要包括兩方面調(diào)節(jié)作用：一是介導(dǎo)了VEGF mRNA 的穩(wěn)定性增加；二是介導(dǎo)了VEGF 的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)［11］。也有學(xué)者推測，在腫瘤缺氧微環(huán)境中，表達(dá)增高的HIF-1α 經(jīng)VEGF 基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游區(qū)域存在的缺氧反應(yīng)元件誘導(dǎo)了下游VEGF 的高表達(dá)［12］。結(jié)合上述研究結(jié)論可推斷出低氧狀態(tài)在宮頸癌Hela 細(xì)胞的生長過程中具有重要作用，很可能通過影響HIF-1α 和VEGF 分子的表達(dá)從而介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

在宮頸癌Hela 細(xì)胞中，HIF-1α 和VEGF 的表達(dá)依賴氧濃度的調(diào)節(jié)，改善宮頸癌組織中缺氧微環(huán)境，可能有助于改善宮頸癌患者HIF-1α 和VEGF 的水平，從而改善患者治療結(jié)局及遠(yuǎn)期預(yù)后。因此，低氧環(huán)境對(duì)癌癥調(diào)控因子，如HIF-1α，VEGF 的影響可能為宮頸癌治療提供新的理論基礎(chǔ)和新的思路。