過表達(dá)TaGS1/TaGS2對(duì)煙草氮素吸收的影響

王瀟然，于美琴，韋一昊，張志勇，李會(huì)強(qiáng)，王小純,*

過表達(dá)對(duì)煙草氮素吸收的影響

王瀟然1，于美琴1，韋一昊2，張志勇2，李會(huì)強(qiáng)1，王小純1,2*

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450002

【】為揭示小麥氮素同化關(guān)鍵酶谷氨酰胺合成酶（TaGS1/TaGS2）在煙草中過表達(dá)對(duì)煙草氮素吸收同化能力的影響及其機(jī)制?！尽恳詿煵菰耘嗥贩NK326為對(duì)照，測(cè)定分析過表達(dá)/煙草的生長(zhǎng)及氮代謝指標(biāo)；利用轉(zhuǎn)錄組結(jié)合進(jìn)化樹分析，確定煙草硝酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族（NtNRT/NPF）及其表達(dá)水平?！尽窟^表達(dá)/煙草根系發(fā)達(dá)、葉片變大，氮素吸收同化積累顯著升高；在煙草中鑒定到36個(gè)/家族基因；過表達(dá)/引起其中28個(gè)/家族基因表達(dá)變化，與qRT-PCR結(jié)果一致。【】過表達(dá)/可能通過提高、、等/家族基因表達(dá)，促進(jìn)煙草氮素吸收、同化與積累，為煙草生長(zhǎng)發(fā)育提供充足氮源。

GS；氮吸收；硝酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；過表達(dá)；煙草

氮是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要營(yíng)養(yǎng)元素，是構(gòu)成蛋白質(zhì)、核酸、葉綠素、輔酶、維生素以及煙堿、煙氣致香物質(zhì)的組成成分，對(duì)煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)起著關(guān)鍵作用[1-4]。探索提升煙草氮素吸收和利用效率的途徑，挖掘其分子機(jī)制，不僅對(duì)提高煙草產(chǎn)量及品質(zhì)，降低生產(chǎn)成本具有重要價(jià)值，同時(shí)對(duì)緩解氮肥過度使用造成的農(nóng)業(yè)面源污染具有積極意義。

在高等植物中，氮素的同化是通過谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶循環(huán)（GS/GOGAT）完成的，其中谷氨酰胺合成酶（Glutamine Synthetase，GS）作為無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的催化酶，在氮素利用過程中至關(guān)重要[1]。高等植物中按照其亞細(xì)胞定位的不同可將GS分為2類：胞質(zhì)型GS（GS1）和質(zhì)體型GS（GS2）[5]。GS1主要參與植物根系NH4+的初始同化和衰老葉中氮的再轉(zhuǎn)移[6-7]。而GS2主要在葉綠體表達(dá)，負(fù)責(zé)植物光呼吸釋放的NH4+及NO3-還原產(chǎn)生的NH4+的同化過程[8]。Oliveira等研究證實(shí)，煙草過表達(dá)大豆基因可以顯著提高其干重和鮮重[9]。煙草過表達(dá)基因可促進(jìn)煙草氨基酸積累，加速幼苗生長(zhǎng)，使植株鮮重提高20%～30%[10]。由此可知，過表達(dá)基因可提高煙草對(duì)氮的利用效率，然而，過表達(dá)基因是否通過調(diào)節(jié)/家族基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)氮素利用效率的提高尚不清楚。

植物根系主要以硝態(tài)氮（NO3-）和銨態(tài)氮（NH4+）兩種形式從土壤中攝取氮素，煙草以吸收土壤中硝態(tài)氮為主[11]。負(fù)責(zé)植物硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的是硝酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Nitrate Transporter/Peptide Transporter Family，NRT/NPF），根據(jù)它們轉(zhuǎn)運(yùn)硝酸鹽的活性，可分為高親和性（NRT2）和低親和性（NRT1）兩類[12]。NRT2是高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，其中NRT2.1、NRT2.2、NRT2.4、NRT2.5在根系表達(dá)，在硝酸鹽的吸收過程中發(fā)揮重要作用[12-17]。NRT1（NPF）主要由低親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)成，其中NRT1.1（NPF6.3）、NRT1.2（NPF4.6）是植物根系對(duì)NO3-吸收的核心成員[18-20]。除了NRT2和NPF外，還有另一個(gè)成員NRT3，它與NRT2相互作用參與高親和硝酸鹽的運(yùn)輸[21-22]。目前在擬南芥和水稻中，/家族基因得到了較為深入的研究，然而煙草/家族基因成員數(shù)量及其功能的研究仍鮮有報(bào)道。

本研究以煙草栽培品種K326為對(duì)照，研究了過表達(dá)/基因?qū)煵萆L(zhǎng)發(fā)育、氮代謝、/家族基因表達(dá)水平的影響，揭示過表達(dá)/基因?qū)煵莸盏挠绊懠捌錂C(jī)制，為氮高效煙草種質(zhì)資源創(chuàng)制提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料包括煙草栽培品種K326（L.）及其過表達(dá)（DQ124209）純合株系OE-TaGS1-1、OE-TaGS1-2和OE-TaGS1-3，過表達(dá)（DQ124212）純合株系OE-TaGS2-1、OE-TaGS2-2和OE-TaGS2-3，由本實(shí)驗(yàn)室保存[23]。

1.2 煙草幼苗的培養(yǎng)

過表達(dá)/煙草株系及K326種子分別用75%酒精處理4 min，6.25%次氯酸鈉處理10min，無菌水沖洗后轉(zhuǎn)入MS滅菌培養(yǎng)基中于25℃，光周期16/8 h條件下培養(yǎng)10 d。移栽到直徑7 cm、高10 cm的盆缽中（蛭石與營(yíng)養(yǎng)土以3:2混勻），培養(yǎng)19 d后選取生長(zhǎng)一致的煙苗移栽到育苗盆中，每盆1株，繼續(xù)培養(yǎng)。

苗齡45 d時(shí)（10葉期），拍照記錄OE-TaGS1、OE-TaGS2及K326煙草植株地上部及根系形態(tài)，并統(tǒng)計(jì)干重（3次生物學(xué)重復(fù)）。同時(shí)，隨機(jī)選取同批移栽O(shè)E-TaGS1、OE-TaGS2及K326各3個(gè)單株分別取根系、從下往上數(shù)第6、7、8片展開葉，液氮速凍后于-80℃保存。

1.3 氮含量測(cè)定

將煙草組織在液氮中研磨至粉末狀，采用Berthelot顏色反應(yīng)法測(cè)定NH4+含量[24]，采用水楊酸比色法測(cè)定NO3-含量[25]。煙草組織烘干粉碎后采用流動(dòng)分析儀測(cè)定總氮（Total nitrogen, TN）含量[26]。葉片（根系）氮積累量，單位干重葉片（根系）氮素含量×單株葉片（根系）總干重。

1.4 煙草根系轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

取OE-TaGS1、OE-TaGS2及K326煙草的根系，每個(gè)株系2次技術(shù)重復(fù)，液氮研磨后各取3 g送北京百邁克有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，剩余樣品-80℃保存。RNA-Seq數(shù)據(jù)用R語言DESeq數(shù)據(jù)包進(jìn)行差異基因篩選，篩選條件為變異倍數(shù)（上調(diào)/下調(diào)）大于等于1.5倍，且FDR≤0.001,差異基因相對(duì)表達(dá)量以log2（FPKMOE/FPKMWT）表示。

1.5 RNA提取和cDNA合成

取煙草根系樣品，采用RNE35廣譜型植物RNA提取試劑盒（諾貝萊）提取RNA，cDNA合成按照HiScriptⅡQ RT SurMix for qRT-PCR（+gDNA wir）說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.6 熒光定量PCR

基于根系RNA-Seq測(cè)序結(jié)果，篩選表達(dá)豐度較高的/家族基因設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工合成（表1）。以煙草（LOC107800553）為內(nèi)參基因，設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，反應(yīng)程序參照諾唯贊公司的AceQ qRT-PCR SYBR Green Master Mix說明書，利用Bio-Rads實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行定量檢測(cè)。數(shù)據(jù)利用2-ΔΔCt方法計(jì)算。（轉(zhuǎn)基因植株的目標(biāo)基因表達(dá)量為ΔCtOE=2-（Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因），野生型植株目標(biāo)基因表達(dá)量為ΔCtWT=2-（Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因），轉(zhuǎn)基因與野生型植株的差異倍數(shù)為F=ΔCtOE/ΔCtWT，即2-ΔΔCt）

表1 qRT-PCR引物序列

續(xù)表1

基因名稱(Gene name)上游引物序列（5'-3'）(Upstream primer sequence)下游引物序列（5'-3'）(Downstream primer sequence) NPF5.6AATCTCAGTTGGGACAGGAGGGCACCAAGTAATAGTCCGCAGCATA NPF6.3ATTTTAGGAGTTGAGGCAGTGGAGGTAACAATGTTTGCGGCGTTAG NPF6.4AGCAGGCTCCTTTTCCGTCAGTATCAGTCCGATTCCAACCG NPF7.3GGGTTGTCCATGTCTTCCTCAGATCCAAGTGCCCGTCGTTTA β-actinTACTTACTGAAGCACCCTTGAATCCGATCACGACCAGCAAGATCCAAC

1.7 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

基于組學(xué)數(shù)據(jù)獲取K326煙草相關(guān)硝酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列，根據(jù)Ensembl Plants（http://plants. ensembl.org/index.html）獲取擬南芥及水稻相關(guān)硝酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列，采用MEGA 7.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，方法為鄰接法（Neighbor-Joining），Bootstrap次數(shù)為1000。

1.8 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel和Graphpad Prism 8進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 20.0進(jìn)行方差分析（S-N-K），<0.05。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)TaGS1/TaGS2對(duì)煙草苗期生長(zhǎng)的影響

煙苗生長(zhǎng)至10葉期時(shí)，OE-TaGS1和OE-TaGS2與栽培品種K326相比葉面積增大（圖1A），根系更加發(fā)達(dá)，主根顯著長(zhǎng)于野生型（圖1B）。OE-TaGS1和OE-TaGS2的地上部與根系干重均呈現(xiàn)顯著高于K326（圖1C）?？梢?，過表達(dá)/基因能夠促進(jìn)煙苗生長(zhǎng)，提高生物量。

注：（A）不同株系的表型；（B）根長(zhǎng)；（C）干物重。不同小寫字母表示不同植株間差異顯著（P＜0.05），下同。

2.2 過表達(dá)TaGS1/TaGS2對(duì)煙草氮素含量的影響

對(duì)K326、OE-TaGS1和OE-TaGS2的葉片和根部氮素含量及積累量的測(cè)定結(jié)果表明，每克植株干重平均氮含量表現(xiàn)為TN（35 mg）>NO3-（6 μg）>NH4+（0.2 μg），葉片NH4+含量與根系NH4+含量一致，僅約0.2 μg；葉片NO3-含量約50 μg，是根系的5倍?？梢?，葉片及根系總氮主要以蛋白質(zhì)等有機(jī)氮形式存在，有機(jī)氮主要來源于根系對(duì)無機(jī)氮（主要是NO3-）吸收轉(zhuǎn)運(yùn)及葉片的同化，因此植株總氮可以代表煙草對(duì)無機(jī)氮的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)及同化積累。OE-TaGS1和OE-TaGS2葉片總氮含量與K326沒有顯著差異（圖2A），但氮素積累量顯著高于K326（圖2C）；OE-TaGS1和OE-TaGS2根系總氮含量及積累量顯著高于K326（圖2B、圖2D）?？梢?，過表達(dá)/可促進(jìn)煙草氮素的吸收同化。OE-TaGS2和K326葉片NO3-含量及總量差異不大，但均顯著高于OE-TaGS1；OE-TaGS1和OE-TaGS2根系NO3-含量及總量顯著高于K326，過表達(dá)/可促進(jìn)根系對(duì)NO3-吸收。葉片NH4+含量表現(xiàn)為OE-TaGS2>K326>OE-TaGS1，但總量差異不大；根系NH4+含量表現(xiàn)為K326>OE-TaGS2> OE-TaGS1，根系NH4+總量K326>OE-TaGS2>OE- TaGS1（圖2B、圖2D），推測(cè)過表達(dá)促進(jìn)根系中NH4+同化，故而含量降低。由此可見，過表達(dá)/可促進(jìn)根系對(duì)NO3-的吸收、植株對(duì)氮素的同化利用。

注：（A）葉片含氮量；（B）根系氮含量；（C）葉片氮積累量；（D）根系氮積累量。

2.3 煙草硝酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族進(jìn)化分析

植物NO3-的吸收與運(yùn)輸主要由NRT/NPF家族蛋白完成。在K326、OE-TaGS1和OE-TaGS2煙草根系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定到36個(gè)NtNRT/NPF家族蛋白，其中30個(gè)NtNPF，4個(gè)NtNRT2，2個(gè)NtNRT3。將上述36個(gè)蛋白與擬南芥及水稻同源蛋白（擬南芥55個(gè)，水稻22個(gè)）進(jìn)行進(jìn)化樹分析，顯示煙草NtNRT/NPF家族蛋白分為3類，即NtNPF、NtNRT2及NtNRT3，且煙草NtNRT/NPF與相應(yīng)的擬南芥蛋白同源性更高（圖3）。

注：紅色標(biāo)記為煙草的36個(gè)硝酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

2.4 過表達(dá)TaGS1/TaGS2對(duì)煙草根系NRT/NPF家族基因表達(dá)的影響

根系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，與K326相比，OE-TaGS1和OE-TaGS2根系有28個(gè)/家族基因差異表達(dá)，其中在二者中同時(shí)上調(diào)表達(dá)有5個(gè)，根據(jù)表達(dá)豐度高低依次為、、、和；僅在OE-TaGS1上調(diào)表達(dá)有7個(gè)，依次為、、、、和；僅在OE-TaGS2上調(diào)表達(dá)的有4個(gè)，依次為、、和；其余12個(gè)基因在轉(zhuǎn)/煙草中有不同程度下調(diào)或無差異表達(dá)（圖4A）。利用qRT-PCR對(duì)10個(gè)差異表達(dá)硝酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行檢測(cè)，并利用上述基因生成回歸曲線證實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠（R>0.6，圖4D、E）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在OE-TaGS1轉(zhuǎn)錄組下調(diào)表達(dá)，而qRT-PCR檢測(cè)其顯著上調(diào)（圖4B、C）?？梢姡^表達(dá)和可能通過調(diào)節(jié)不同硝酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)影響煙草對(duì)氮素吸收效率。

注：（A）基于轉(zhuǎn)錄組的差異基因分析；（B、C）OE-TaGS1和OE-TaGS2轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗(yàn)證；（D、E）回歸曲線。

3 討論

氮素的吸收、運(yùn)輸和利用是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的最重要因素之一。GS是氮素同化的關(guān)鍵酶，小麥過表達(dá)促進(jìn)地上部和根系發(fā)育，顯著提高生物量[27]。煙草過表達(dá)能夠促進(jìn)NO3-吸收及NH4+同化，顯著提高煙草干鮮重[28]。本研究表明，煙草過表達(dá)或植株生物量和氮素積累量顯著提高，即過表達(dá)可以提高煙草植株無機(jī)氮同化效率，與他人研究結(jié)論一致。氮同化及生物量的增加必然與氮吸收的增加密切相關(guān)，但過表達(dá)外源基因如何影響煙草氮吸收相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)鮮有報(bào)道。

植物氮素主要以硝態(tài)氮（NO3-）和銨態(tài)氮（NH4+）兩種無機(jī)氮形式吸收，其中又以NO3-為主[29]。硝酸還原酶（NR）和亞硝酸還原酶（NiR）在氮素同化過程將NO3-還原為NH4+，為GS提供催化底物[30]。NR、NiR及GS等氮素同化相關(guān)酶在脅迫條件下呈現(xiàn)共表達(dá)趨勢(shì)[31]。因此，過表達(dá)促進(jìn)NH4+同化也必然提升NO3-利用效率。本研究表明，OE-TaGS1根系及OE-TaGS2根系和葉片NO3-含量比K326出現(xiàn)不同程度增加，過表達(dá)/煙草總氮含量顯著提高，證明過表達(dá)促進(jìn)煙草對(duì)NO3-的吸收和同化，為促進(jìn)煙草生長(zhǎng)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

NRT/NPF家族蛋白是植物體內(nèi)NO3-主要轉(zhuǎn)運(yùn)體，不同家族成員負(fù)責(zé)植物根部對(duì)NO3-吸收及組織內(nèi)部運(yùn)輸[32]。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)/導(dǎo)致多個(gè)/家族基因發(fā)生表達(dá)變化，這可能是轉(zhuǎn)基因煙草中NO3-吸收效率改變的重要原因。NPF6.3（NRT1.1）是植物中第一個(gè)被鑒定出的家族基因成員，在NO3-的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮重要作用，一旦其功能缺失可能誘發(fā)生長(zhǎng)素（IAA）積累，進(jìn)而導(dǎo)致植物側(cè)根發(fā)育受到抑制[33]。組學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)可能僅在OE-TaGS2中上調(diào)表達(dá)，可靠性更高的qRT-PCR驗(yàn)證可知過表達(dá)均引發(fā)表達(dá)上調(diào)，說明對(duì)OE-TaGS1和OE-TaGS2中NO3-吸收和積累發(fā)揮重要作用。通過調(diào)控及基因表達(dá)，改變根系對(duì)NO3-的吸收效率[34]，本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)均引發(fā)表達(dá)上調(diào)，且葉片氮積累量高于K326，說明可提高OE-TaGS1和OE-TaGS2根系對(duì)氮的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)效率。為低親和轉(zhuǎn)運(yùn)體系，在木質(zhì)部表達(dá)，介導(dǎo)硝酸鹽經(jīng)由木質(zhì)部向地上運(yùn)輸[35]，本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)均引發(fā)顯著上調(diào)，促進(jìn)煙草根部對(duì)硝態(tài)氮吸收，提高煙草對(duì)NO3-的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。

GS1主要存在于輸導(dǎo)組織細(xì)胞質(zhì)中，GS2主要存在于葉肉細(xì)胞的葉綠體中，二者在無機(jī)氮同化過程中存在功能差異[36]。這可能導(dǎo)致OE-TaGS1和OE-TaGS2煙草部分/家族基因呈現(xiàn)不同變化趨勢(shì)。盡管過表達(dá)/煙草表型及生理指標(biāo)相似，但家族基因表達(dá)存在差異，推測(cè)不同家族基因可能與相同激素作用調(diào)控氮吸而收[12]，也可能在煙草中存在相對(duì)保守的機(jī)制，導(dǎo)致/過表達(dá)均能提升煙草的氮素吸收和利用效率，但其分子機(jī)制仍待深入研究。

4 結(jié)論

過表達(dá)/基因均能夠促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)，影響硝酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族36個(gè)成員中28個(gè)成員發(fā)生表達(dá)變化，可能調(diào)控、、等表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)硝態(tài)氮吸收，為GS同化無機(jī)氮提供原料。

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The effect of/overexpression on nitrogen uptake in tobacco

WANG Xiaoran1, YU Meiqin1, WEI Yihao2, ZHANG Zhiyong2, LI Huiqiang1, WANG Xiaochun1,2*

1 College of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China;2 Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China

This study aims to reveal the effects of wheat glutamine synthetase(/) overexpression on nitrogen uptake and assimilation in tobacco (L.) as well as the hidden mechanism.Taking the tobacco cultivar K326 as control, the growth and nitrogen metabolism indicators of overexpressed transgenic lines/(OE-TaGS1/OE-TaGS2) were detected; RNA-Seq and cluster analysis were used to identify nitrate transporter (NtNRT/NPF) family members and analyze the abundance of/genes.The overexpressed/showed stronger roots, larger leaf area, the significant increasing accumulation and assimilation of nitrogen. A total of 36 genes of/were identified from the RNA-Seq, 28 genes among them showed variation on RNA level, which was consistent with qRT-PCR results.The/overexpression may trigger up-regulation of the crucial members of/family in tobacco, such as,and, etc., which promotes nitrogen uptake, assimilation and accumulation and provides sufficient nitrogen for tobacco growth and development.

GS; nitrogen uptake; nitrate transporter; overexpression; tobacco

Corresponding author. Email：xiaochun.w@163.com

不同氮效率小麥品種氮素吸收、同化及轉(zhuǎn)運(yùn)差異的分子機(jī)理（32071956）

王瀟然（1983—），博士，副教授，主要研究方向?yàn)橹参锏x，Tel：0371-63555790，Email：xiaoranwang@henau.edu.cn

王小純（1966—），Tel：0371-63555790，Email：xiaochun.w@163.com

2021-11-08；

2022-02-22

王瀟然，于美琴，韋一昊，等. 過表達(dá)TaGS1/TaGS2對(duì)煙草氮素吸收的影響[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2022，28（3）.WANG Xiaoran, YU Meiqin, WEI Yihao, et al. The effect of TaGS1/TaGS2 overexpression on nitrogen uptake in tobacco[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022, 28(3). doi:10.16472/j.chinatobacco. 2021.T0202