E2F1調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞自噬對(duì)小鼠糖尿病腎病腎纖維化的作用研究*

鄒琴， 李清璇， 屈玲玲， 安小敏， 黃靖惠， 王金艷， 龍?zhí)烊A， 石明雋

E2F1調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞自噬對(duì)小鼠糖尿病腎病腎纖維化的作用研究*

鄒琴， 李清璇， 屈玲玲， 安小敏， 黃靖惠， 王金艷， 龍?zhí)烊A， 石明雋△

（貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，貴州省常見(jiàn)慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025）

探討E2F轉(zhuǎn)錄因子1（E2F transcription factor 1， E2F1）是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞（renal tubular epithelial cells， RTECs）自噬而影響糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy， DN）小鼠腎纖維化進(jìn)程，并探討其可能機(jī)制。將12只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照（normal control， NC）組和糖尿?。╠iabetes mellitus， DM）組，每組各6只，用鏈脲佐菌素（55 mg/kg，腹腔注射，每天1次，連續(xù)5 d）復(fù)制小鼠1型DM模型。16周時(shí)處死小鼠后檢測(cè)血糖和24 h尿總蛋白；HE和Masson染色觀察腎組織病理形態(tài)改變；免疫組織化學(xué)染色觀察腎組織E2F1表達(dá)情況；Western blot和RT-qPCR檢測(cè)腎組織E2F1、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）、自噬及纖維化相關(guān)指標(biāo)表達(dá)的變化。高糖培養(yǎng)RTECs并分別轉(zhuǎn)染敲減或過(guò)表達(dá)的質(zhì)粒，Western blot法檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。與NC組相比，DM組小鼠血糖和24 h尿總蛋白均顯著增高（<0.05）。HE和Masson染色觀察到DM組小鼠腎小管管腔塌陷，腎小球基底膜增厚，且腎間質(zhì)有大量膠原纖維沉積。RT-qPCR結(jié)果顯示，與NC組相比，DM組小鼠E2F1、III型膠原（collagen type III， Col III）和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的mRNA表達(dá)上調(diào)（<0.05），上皮鈣黏素（E-cadherin）的mRNA表達(dá)下調(diào)（<0.05）。Western blot結(jié)果顯示，與NC組比較，DM組小鼠腎組織及高糖培養(yǎng)的RTECs中E2F1、mTOR、自噬降解底物蛋白P62、Col III和α-SMA的蛋白表達(dá)上調(diào)（<0.05），E-cadherin蛋白表達(dá)水平和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-II（microtubule-associated protein 1 light chain 3-II， LC3-II）/LC3-I比值降低（<0.05）。與空載體組相比，在高糖狀態(tài)下轉(zhuǎn)染敲減表達(dá)的質(zhì)粒后，RTECs中mTOR、P62、Col III和α-SMA蛋白表達(dá)下調(diào)（<0.05），E-cadherin蛋白表達(dá)水平和LC3-II/LC3-I比值升高（<0.05）；而過(guò)表達(dá)后，mTOR、P62、Col III和α-SMA的蛋白表達(dá)增加（<0.05），E-cadherin蛋白表達(dá)水平和LC3-II/LC3-I比值降低（<0.05）。E2F1/mTOR可通過(guò)抑制RTECs自噬水平而促進(jìn)小鼠DN腎纖維化進(jìn)程。

E2F轉(zhuǎn)錄因子1；自噬；腎間質(zhì)纖維化；糖尿病腎病

糖尿?。╠iabetes mellitus， DM）是一種常見(jiàn)的慢性內(nèi)分泌性疾病，而糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy， DN）是DM最嚴(yán)重的全身性微血管并發(fā)癥之一，已成為DM患者終末期腎衰竭及死亡的主要原因［1］。腎小管間質(zhì)纖維化是DN發(fā)展至終末期腎衰竭的重要病理改變，而腎小管上皮細(xì)胞（renal tubular epithelial cells， RTECs）的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）在腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［2-5］，但其具體發(fā)生機(jī)制迄今尚未充分闡明。

自噬是細(xì)胞中蛋白質(zhì)降解的2種主要途徑之一［6］，即細(xì)胞通過(guò)降解自噬小體內(nèi)包裹的受損細(xì)胞器、侵入的病原體及衰老的蛋白質(zhì)等，以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、能量生成和細(xì)胞器的更新。研究顯示，在DN大鼠RTECs中自噬水平明顯受到抑制［7］，當(dāng)提高自噬水平后，可明顯抑制RTECs的EMT進(jìn)程及DN的發(fā)生與發(fā)展［8］。以上研究提示，自噬與DN時(shí)RTECs EMT的關(guān)系密切，但其具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。E2F轉(zhuǎn)錄因子1（E2F transcription factor 1， E2F1）是細(xì)胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，可以誘導(dǎo)肺癌和骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生EMT［9-10］。另外，在大鼠心肌細(xì)胞中通過(guò)敲減的表達(dá)可以明顯提高細(xì)胞自噬水平［11］。然而在高糖（high glucose， HG）狀態(tài)下，E2F1對(duì)RTECs自噬水平及EMT的作用尚不清楚。因此，本項(xiàng)工作擬以1型DM小鼠模型及HG狀態(tài)下小鼠RTECs為研究對(duì)象，觀察E2F1對(duì)HG狀態(tài)下RTECs自噬水平及EMT的影響，探討其對(duì)DN腎纖維化的作用及可能機(jī)制，為進(jìn)一步闡明DN的發(fā)生機(jī)制提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞

健康清潔級(jí)雄性6周齡C57BL/6小鼠12只，體重（24±5） g，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0002；小鼠RTECs株購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司。

2　藥品與試劑

鏈脲佐菌素（streptozotocin， STZ）購(gòu)自Sigma；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒和免疫組織化學(xué)染色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）購(gòu)自BIOIND；過(guò)表達(dá)和敲減質(zhì)粒購(gòu)自上海毅樂(lè)生物科技有限公司；質(zhì)粒小提中量提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；抗β-actin抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔和羊抗小鼠IgG購(gòu)自武漢普美克生物技術(shù)有限公司；兔抗III型膠原（collagen type III， Col III）和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；鼠抗上皮鈣黏素（E-cadherin）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin， α-SMA）和P62抗體購(gòu)自Abcam；兔抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3， LC3）抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；兔抗E2F1抗體購(gòu)自Absin；所用引物由上海生物工程股份有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成。

3　主要方法

3.1動(dòng)物模型復(fù)制和分組C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，參考相關(guān)文獻(xiàn)方法復(fù)制DM小鼠模型［12］。小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照（normal control， NC）組和DM組，每組6只。模型復(fù)制前小鼠禁食不禁水4 h，DM組小鼠給予腹腔注射2%的STZ（55 mg/kg；采用高壓滅菌、0.1 mol/L、pH 4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制），連續(xù)5 d，NC組予以腹腔注射等體積STZ溶媒。給藥2周后檢測(cè)小鼠空腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L即為模型復(fù)制成功，繼續(xù)飼養(yǎng)小鼠16周，每周檢測(cè)小鼠體重和空腹血糖各1次，2組小鼠均予普通飼料喂養(yǎng)。

3.2動(dòng)物標(biāo)本采集糖尿病模型復(fù)制成功16周后處死各組小鼠，處死前1 d接取24 h尿液，處死當(dāng)天禁食不禁水4 h，測(cè)空腹血糖和體重；行乙醚麻醉，摘取眼球取血，室溫離心（92 r/min，5 min）取血清，置于-80 ℃冰箱保存；取雙側(cè)腎臟，去除包膜脂肪，記錄腎臟重量，留取部分組織切片約1 mm于4%多聚甲醛溶液中固定，其余部分于-80 ℃冰箱保存。

3.3生化指標(biāo)檢測(cè)葡萄糖氧化酶GOD法檢測(cè)血清血糖；鄰苯三酚紅鉬比色法測(cè)尿總蛋白（urinary total protein， UTP）。以UTP乘以24 h尿量計(jì)算24 h UTP。

3.4腎組織形態(tài)觀察取4%多聚甲醛溶液中固定的腎組織經(jīng)梯度乙醇脫水、透明、石蠟包埋后制成3 μm厚的石蠟切片，進(jìn)行常規(guī)HE和Masson染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織病理形態(tài)改變情況。

3.5免疫組織化學(xué)染色參照北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司小鼠二步法試劑盒操作，石蠟切片脫蠟后，梯度乙醇水化，PBS洗滌，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波抗原修復(fù)，加兔抗E2F1抗體（1∶100），4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，復(fù)溫，PBS洗滌后，滴加即用型辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，37 ℃恒溫孵育30 min，PBS洗滌，DAB顯色，自來(lái)水沖洗終止顯色；蘇木精染核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，自然晾干后封片，光學(xué)顯微鏡觀察并拍照保存。

3.6細(xì)胞培養(yǎng)及分組用含10％FBS的正常糖（normal glucose， NG； 5.5 mmol/L葡葡糖）DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)RTECs，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到40%時(shí)，加入無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液同步化培養(yǎng)細(xì)胞12 h，再將細(xì)胞分為NG組（5.5 mmol/L葡葡糖+1% FBS）和HG組（30 mmol/L葡葡糖+1% FBS），繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞蛋白標(biāo)本進(jìn)相關(guān)檢測(cè)。

3.7激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)將RTECs進(jìn)行爬片，分別用NG和HG培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗滌后，用4%多聚甲醛溶液室溫固定15 min，預(yù)冷的PBS洗滌，加入0.2% Triton X-100室溫放置6 min，PBS洗滌，加入3% BSA室溫孵育封閉30 min，PBS洗滌，滴加Ⅰ抗（LC3-I和LC3-II抗體，1∶100），4 ℃冰箱孵育過(guò)夜；次日室溫復(fù)溫1 h，PBS洗滌后，加入熒光Ⅱ抗FITC-IgG（1∶100），37 ℃避光孵育1 h，PBS洗滌，抗熒光淬滅劑封片后，使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察圖像并拍攝保存。

3.8細(xì)菌接種和質(zhì)粒提取將含有敲減和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的甘油菌Z型劃線接種于已加氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)15～18 h后可見(jiàn)單克隆菌落，挑取單克隆菌落接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37 ℃搖菌培養(yǎng)12～15 h，根據(jù)質(zhì)粒小提中量提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒。

3.9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染待RTECs密度達(dá)到50%時(shí)，將細(xì)胞分為HG組、HG+空載體轉(zhuǎn)染組（HG+vector組）和HG+敲減質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（HG+E2F1-shRNA組），以及NG組、NG+空載體轉(zhuǎn)染組（NG+vector組）、NG+過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（NG+OE-E2F1）、HG組、HG+vector組和HG+過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（HG+OE-E2F1）組，用聚乙烯亞胺轉(zhuǎn)染法將空載質(zhì)粒、敲減及過(guò)表達(dá)的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)分組的目的細(xì)胞，待質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞6 h后均換為含1% FBS的對(duì)應(yīng)NG或HG培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)。

3.10RT-qPCR實(shí)驗(yàn)取出-80 ℃冰箱中凍存的腎臟組織，各取50 mg腎皮質(zhì)于1.5 mL EP管中，加入500 μL的Trizol液，置于高通量研磨機(jī)中研磨，根據(jù)Trizol法提取腎臟皮質(zhì)總RNA，測(cè)定總RNA濃度，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，存放于-20 ℃冰箱備用。以cDNA為模板擴(kuò)增E2F1、α-SMA、E-cadherin和Col III。PCR總體系為20 μL，其中Hieff UNICON qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板DNA 1 μL，RNase-Free ddH2O 8.2 μL。擴(kuò)增上機(jī)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40次循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參照，E2F1、α-SMA、E-cadherin和Col III的mRNA相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt表示。引物序列見(jiàn)表1。

表1　引物序列

F： forward； R： reverse.

3.11Western blot實(shí)驗(yàn)取出-80 ℃冰箱中腎組織，稱量100 mg腎皮質(zhì)組織轉(zhuǎn)移入1.5 mL EP管中，加1 mL蛋白裂解液，經(jīng)勻漿研磨后離心，取上清液制成蛋白樣本進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入小鼠抗β-actin抗體（1∶5 000），鼠抗α-SMA（1∶1 000），兔抗P62、LC3、Col III和E-cadherin抗體（1∶1 000），兔抗E2F1和mTOR抗體（1∶1 500），置于4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜；TBST洗膜，加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠Ⅱ抗（1∶6 000）和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗（1∶7 000），室溫?fù)u床孵育1 h；TBST洗滌后加入Smart-ECL發(fā)光試劑，凝膠成像儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光曝光，結(jié)果用Image Lab 5.0程序軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析處理，并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間比較采用檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　DM小鼠腎組織及HG培養(yǎng)的RTECs中Col III、α-SMA及E-cadherin的表達(dá)

NC組小鼠生長(zhǎng)正常，狀態(tài)良好，DM組小鼠出現(xiàn)“三多一少”的癥狀。與NC組相比，DM組小鼠血糖和24 h UTP水平均顯著升高（<0.05），見(jiàn)圖1A、B。HE染色結(jié)果顯示，NC組小鼠腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)較為清晰，上皮細(xì)胞排列較為整齊，基底膜完整，腎間質(zhì)中未見(jiàn)到炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而DM組小鼠腎組織中可見(jiàn)腎小管間質(zhì)周圍增寬，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管管腔擴(kuò)張，基底膜增厚；Masson染色可見(jiàn)DM組小鼠腎小球及腎間質(zhì)有大量藍(lán)色膠原沉積，見(jiàn)圖1C。此外，Western blot結(jié)果顯示，DM組小鼠腎組織Col III和α-SMA蛋白表達(dá)顯著升高（<0.05），E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低（<0.05），RT-qPCR結(jié)果與蛋白表達(dá)結(jié)果一致，見(jiàn)圖1D、E。在HG培養(yǎng)的RTECs中上述蛋白表達(dá)的趨勢(shì)與DM小鼠腎組織的Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，見(jiàn)圖1F。

Figure 1.　The expression levels of collagen type III （Col III）， α-smooth muscle actin （α-SMA） and E-cadherin in kidney tissues of diabetes mellitus （DM） mice and mouse renal tubular epithelial cells （RTECs） cultured with high glucose （HG）. A： the blood glucose level in normal control （NC） group and DM group； B： 24 h urinary total protein （UTP） in NC group and DM group； C： the images of HE and Masson staining of renal tissues in NC group and DM group； D： the mRNA levels ofCol III， α-SMA and E-cadherin in kidney tissues of DM mice were detected by RT-qPCR； E and F： the protein levels of Col III， α-SMA and E-cadherin in kidney tissues of DM mice and HG-stimulated mouse RTECs were determined by Western blot， respectively. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs NC group；#P<0.05 vs normal glucose （NG） group.

2　DM小鼠腎組織及HG培養(yǎng)的RTECs的自噬情況

與NC組小鼠和NG培養(yǎng)的RTECs相比，DM組小鼠腎組織中和HG培養(yǎng)的RTECs中LC3-II/LC3-I比值顯著降低（<0.05），而P62蛋白累積增多（<0.05），見(jiàn)圖2A、B。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察到，NG組RTECs中有大量自噬小體形成，而HG培養(yǎng)細(xì)胞后，自噬小體形成明顯減少，見(jiàn)圖2C。

Figure 2.　The autophagy levels in kidney tissues of diabetes mellitus （DM） mice and mouse renal tubular epithelial cells （RTECs） cultured with high glucose （HG） were inhibited. A： the protein levels of P62， microtubule-associated protein 1 light chain 3-I （LC3-I） and LC3-II in normal control （NC） group and DM group were determined by Western blot； B： the protein levels of P62， LC3-I and LC3-II in HG-stimulated mouse RTECs were determined by Western blot； C： laser scanning confocal microscopy was used to detect autophagosomes. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs NC group；#P<0.05 vs normal glucose （NG） group.

3　DM小鼠腎組織及HG培養(yǎng)的RTECs中E2F1和mTOR的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，NC組小鼠腎小管間質(zhì)幾乎無(wú)E2F1的陽(yáng)性表達(dá)，而DM組小鼠腎小管細(xì)胞質(zhì)中顆粒狀E2F1蛋白陽(yáng)性表達(dá)顯著增多，見(jiàn)圖3A。與NC組相比，DM組小鼠腎組織E2F1的mRNA表達(dá)水平顯著升高（<0.05），見(jiàn)圖3B。Western blot結(jié)果顯示，與NC組小鼠和NG培養(yǎng)的RTECs相比，DM組小鼠腎組織和HG培養(yǎng)的RTECs中E2F1和mTOR的蛋白表達(dá)水平顯著升高（<0.05），見(jiàn)圖3C、D。

Figure 3.　The expression levels of E2F transcription factor 1 （E2F1） and mammalian target of rapamycin （mTOR） were increased in kidney tissues of diabetes mellitus （DM） mice and mouse renal tubular epithelial cells （RTECs）cultured with high glucose （HG）. A： immunohistochemical staining was used to detect the expression of E2F1 in the kidney tissue； B： the mRNA level of E2F1 was detected by RT-qPCR； C： the protein levels of E2F1 and mTOR in normal control （NC） group and DM group were determined by Western blot； D： the protein levels of E2F1 and mTOR in HG-stimulated mouse RTECs were determined by Western blot. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs NC group；#P<0.05 vs normal glucose （NG） group.

4　E2F1對(duì)RTECs自噬、EMT及細(xì)胞外基質(zhì)沉積的影響

在HG培養(yǎng)的RTECs中敲減內(nèi)源性表達(dá)后，mTOR的蛋白表達(dá)顯著減少（<0.05），自噬指標(biāo)LC3-II/LC3-I比值顯著升高（<0.05），P62蛋白表達(dá)顯著減少（<0.05），同時(shí)E-cadherin的蛋白表達(dá)顯著增多（<0.05），α-SMA和Col III的蛋白表達(dá)顯著減少（<0.05），見(jiàn)圖4。

Figure 4.　The protein levels of E2F transcription factor 1 （E2F1）， mammalian target of rapamycin （mTOR）， P62， microtubule-associated protein 1 light chain 3-I （LC3-I）， LC3-II， α-smooth muscle actin （α-SMA）， E-cadherin and collagen type III （Col III） in high glucose （HG）-stimulated mouse renal tubular epithelial cells transfected with E2F1 knockdown （shRNA） plasmid were determined by Western blot. A： E2F1 and mTOR； B： P62， LC3-I and LC3-II； C： α-SMA， E-cadherin and Col III. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs HG+vector group.

在HG狀態(tài)下過(guò)表達(dá)后，RTECs中mTOR的蛋白表達(dá)顯著增加（<0.05），P62蛋白表達(dá)顯著增加（<0.05），LC3-II/LC3-I比值顯著降低（<0.05），同時(shí)α-SMA和Col III蛋白表達(dá)顯著增多（<0.05），E-cadherin蛋白表達(dá)顯著減少（<0.05），見(jiàn)圖5。

Figure 5.　The protein levels of E2F transcription factor 1 （E2F1）， mammalian target of rapamycin （mTOR）， P62， microtubule-associated protein 1 light chain 3-I （LC3-I）， LC3-II， α-smooth muscle actin （α-SMA）， E-cadherin and collagen type III （Col III） in high glucose （HG）-stimulated mouse renal tubular epithelial cells transfected with E2F1 over-expression （OE） plasmid were determined by Western blot. A： E2F1 and mTOR； B： P62， LC3-I and LC3-II； C： α-SMA， E-cadherin and Col III. Mean±SD. n=3. #P<0.05 vs normal glucose （NG） group；△P<0.05 vs HG+vector group.

討論

DN主要臨床病理改變?yōu)槟I小球硬化與腎小管間質(zhì)纖維化，腎小管間質(zhì)纖維化主要表現(xiàn)為腎間質(zhì)內(nèi)腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷以及大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積［12］，而EMT在DN腎小管間質(zhì)纖維化中扮演著重要角色。RTECs發(fā)生EMT后，丟失上皮細(xì)胞表型（如E-cadherin表達(dá)減少等），獲得間充質(zhì)細(xì)胞表型（如α-SMA表達(dá)增加等），同時(shí)合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力明顯增強(qiáng)。在本研究中，DM組小鼠生化指標(biāo)血糖及24 h UTP均較NC組小鼠顯著升高，且DM組腎組織病理結(jié)果顯示，腎小管間質(zhì)周圍增寬，腎小管管腔擴(kuò)張，基底膜增厚，腎間質(zhì)可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，Masson染色顯示腎小球及間質(zhì)有大量藍(lán)色膠原沉積，說(shuō)明小鼠DM模型復(fù)制成功，且發(fā)生了DN表現(xiàn)。同時(shí)Western blot及RT-qPCR結(jié)果還觀察到DM組小鼠腎組織中α-SMA和Col III表達(dá)增加，E-cadherin的表達(dá)減少，提示DM小鼠腎組織發(fā)生了EMT及細(xì)胞外基質(zhì)沉積增多，但其機(jī)制并不清楚。

有研究報(bào)道，自噬可以調(diào)控RTECs的EMT過(guò)程［13］。自噬是一種保守的蛋白降解過(guò)程，在代謝、退行性變和惡性疾病等方面發(fā)揮重要的作用［14-15］。在大鼠RTECs株NRK-52E中，二甲雙胍能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬從而抑制由血清白蛋白所誘導(dǎo)的EMT［16］。在人近端RTECs中，脂聯(lián)素能促進(jìn)自噬進(jìn)而抑制由膽固醇誘導(dǎo)的EMT，而自噬抑制劑氯喹可拮抗該效應(yīng)［17］。但HG狀態(tài)下自噬水平如何變化及是否可以通過(guò)調(diào)控EMT而影響DN的發(fā)病過(guò)程，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究顯示，DM小鼠腎組織以及HG培養(yǎng)的RTECs細(xì)胞中P62蛋白累積增加，LC3-II與LC3-I蛋白比值顯著減小，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察到NG培養(yǎng)的RTECs中有較多自噬小體形成，而HG刺激RTECs細(xì)胞后，自噬小體形成明顯減少。這些結(jié)果提示HG狀態(tài)下RTECs的自噬水平受到抑制，但其原因并不清楚。

近年來(lái)研究顯示，E2F1/mTOR信號(hào)通路與自噬關(guān)系密切，細(xì)胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子E2F1的基因是一種原癌基因，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT［9-10］；mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)，促進(jìn)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、細(xì)胞器等合成代謝，抑制自噬等分解代謝［8］。有研究報(bào)道，在骨肉瘤細(xì)胞中，E2F1能通過(guò)激活mTOR而抑制自噬［18］；另外，在大鼠心肌細(xì)胞中增加E2F1的表達(dá)能促進(jìn)mTOR的表達(dá)，進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞的自噬水平，而敲減的表達(dá)能明顯抑制mTOR的表達(dá)，自噬水平明顯升高［11］。在本研究中，DM小鼠腎組織及HG培養(yǎng)的RTECs中E2F1和mTOR蛋白表達(dá)增加自噬水平明顯下調(diào)，且伴有EMT的發(fā)生。HG狀態(tài)下在小鼠RTECs轉(zhuǎn)染敲減質(zhì)粒后，mTOR表達(dá)減少，細(xì)胞自噬水平增加，EMT現(xiàn)象減輕，細(xì)胞外基質(zhì)沉積減少；而轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后mTOR蛋白表達(dá)增加，細(xì)胞自噬受抑，促進(jìn)了EMT發(fā)生和細(xì)胞外基質(zhì)沉積增多。這些結(jié)果提示，E2F1/mTOR可以通過(guò)調(diào)控表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)自噬水平，參與DN小鼠腎小管-間質(zhì)纖維化過(guò)程。

綜合文獻(xiàn)及本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，我們認(rèn)為HG狀態(tài)下E2F1/mTOR表達(dá)增多后抑制了自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，加劇了DM小鼠腎纖維化進(jìn)程，從而促進(jìn)其DN的發(fā)生與發(fā)展。因此深入研究E2F1/mTOR在DN腎纖維化中的調(diào)控機(jī)制，對(duì)DN的防治具有重要意義。

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E2F1 promotes renal fibrosis in mouse diabetic nephropathy by regulation autophagy of renal tubular epithelial cells

ZOU Qin， LI Qing-xuan， QU Ling-ling， AN Xiao-min， HUANG Jing-hui， WANG Jin-yan， LONG Tian-hua， SHI Ming-jun△

（，＆，，550025，）

To investigate whether E2F transcription factor 1 （E2F1） modulates the process of renal fibrosis in diabetic nephropathy， and to explore its possible mechanism.Twelve C57BL/6 mice were randomly divided into normal control （NC） group and diabetes mellitus （DM） group. Type 1 DM mouse model was established by injection of streptozotocin （55 mg/kg） for 5 d. At 16 weeks， the mice were sacrifaced to detect the blood glucose and 24 h urinary total protein. The pathological changes of the kidney were observed by HE and Masson staining. The expression of E2F1 was observed by immunohistochemical staining. Western blot and RT-qPCR were used to detect the changes in E2F1， mammalian target of rapamycin （mTOR）， autophagy levels and fibrosis-related indicators. Renal tubular epithelial cells （RTECs） were transfected withknockdown or over-expression plasmids， and the changes of related proteins were detected by Western blot.Higher blood glucose and 24 h urinary total protein were observed in DM group than NC group （<0.05）. The results of HE and Masson staining showed that the renal tubules of DM mice collapsed， the glomerular basement membrane thickened， and a large number of collagen fibers deposited in the renal interstitium. Compared with NC group， the mRNA expression of E2F1， collagen type III （Col III） and α-smooth muscle actin （α-SMA） was increased in DM group （<0.05）， but the expression of E-cadherin was decreased （<0.05）. The protein levels of E2F1， mTOR， P62， Col III and α-SMA were also increased in kidney tissues of DM mice and high glucose-induced RTECs （<0.05）， while the protein expression of E-cadherin and the ratio of microtubule-associated protein 1 light chain 3-II （LC3-II）/LC3-I were decreased （<0.05）. The protein levels of mTOR， P62， Col III and α-SMA were increased （<0.05）， and the protein expression of E-cadherin and the ratio of LC3-II/LC3-I were decreased （<0.05） after knockdown ofin the RTECs. Moreover， over-expression ofincreased the protein expression of mTOR， P62， Col III and α-SMA （<0.05）， and decreased the expression of E-cadherin and the ratio of LC3-II/LC3-I.E2F1/mTOR promotes the progression of renal fibrosis in diabetic nephropathy by inhibiting the autophagy of RTECs.

E2F transcription factor 1； Autophagy； Renal interstitial fibrosis； Diabetic nephropathy

R587.2； R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.06.012

1000-4718（2022）06-1046-10

2021-07-08

2022-01-06

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No. 81860135； No. 82060142）；貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合平臺(tái)人才［2019］5801號(hào)）

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（責(zé)任編輯：余小慧，李淑媛）