硫氫化鈉通過(guò)抑制經(jīng)典細(xì)胞焦亡信號(hào)通路減輕巨噬細(xì)胞焦亡*

張旭琳， 田香勤， 賈珍麗， 劉博蔚， 梁高遠(yuǎn)， 張子辰， 李玲△， 張亮，△

硫氫化鈉通過(guò)抑制經(jīng)典細(xì)胞焦亡信號(hào)通路減輕巨噬細(xì)胞焦亡*

張旭琳1， 田香勤2，3▲， 賈珍麗1， 劉博蔚1， 梁高遠(yuǎn)1， 張子辰1， 李玲1△， 張亮1，2△

（1石河子大學(xué)新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003；2國(guó)家衛(wèi)生健康委中亞高發(fā)病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832008；3新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

：探討硫化氫（hydrogen sulfide， H2S）供體硫氫化鈉（sodium hydrosulfide， NaHS）對(duì)巨噬細(xì)胞焦亡的作用。人髓系白血病單核細(xì)胞THP-1經(jīng)佛波酯刺激并分化為巨噬細(xì)胞后，采用不同濃度的氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein， ox-LDL）和NaHS對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，并分為空白對(duì)照組、ox-LDL刺激組和NaHS+ox-LDL干預(yù)組。采用CCK-8法檢測(cè)THP-1巨噬細(xì)胞活力；采用油紅O染色和光鏡分別觀察THP-1巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積和焦亡細(xì)胞形態(tài)；采用Hoechst 33342/碘化丙啶（propidium iodide， PI）熒光染色和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDH）活性檢測(cè)評(píng)估細(xì)胞焦亡程度；采用H2S檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的H2S水平；采用試劑盒測(cè)定細(xì)胞中的caspase-1活性；采用Western blot分析細(xì)胞中焦亡關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平。與空白對(duì)照組相比，ox-LDL（100和150 mg/L）可顯著增加THP-1巨噬細(xì)胞中的PI陽(yáng)性細(xì)胞比例、LDH釋放、caspase-1活性以及核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3， NLRP3）、caspase-1 （p20）、gasdermin D（GSDMD）、GSDMD-N和IL-18的蛋白表達(dá)（<0.05或<0.01），且ox-LDL（100 mg/L）可使THP-1巨噬細(xì)胞出現(xiàn)明顯脂質(zhì)沉積和典型的細(xì)胞焦亡形態(tài)。而NaHS（100和200 μmol/L）干預(yù)則可顯著改善巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)沉積和焦亡，并可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的caspase-1活性增加及焦亡信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)上調(diào)（<0.05或<0.01）。H2S供體NaHS可通過(guò)抑制經(jīng)典焦亡信號(hào)通路而減輕ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡。

硫化氫；氧化低密度脂蛋白；巨噬細(xì)胞；細(xì)胞焦亡

細(xì)胞焦亡作為機(jī)體應(yīng)對(duì)病原微生物感染和細(xì)胞應(yīng)激的一種促炎性細(xì)胞程序性死亡，其最初發(fā)現(xiàn)于巨噬細(xì)胞［1-3］。研究表明巨噬細(xì)胞的適度焦亡是各種傳染性、自身免疫性和炎癥性疾病發(fā)病過(guò)程中的重要先天免疫應(yīng)答機(jī)制，且其有利于宿主通過(guò)招募各種免疫細(xì)胞以清除病原體或修復(fù)受損組織，并增強(qiáng)宿主細(xì)胞的免疫防御反應(yīng)［2，4-5］。然而，免疫穩(wěn)態(tài)失衡引起的由核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3， NLRP3）/胱天蛋白酶1（caspase-1）/消皮素 D（gasdermin D， GSDMD）介導(dǎo)的經(jīng)典焦亡信號(hào)通路的過(guò)度激活及巨噬細(xì)胞的過(guò)度焦亡則可加劇組織損傷及自身免疫性或炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展［2，6］。目前研究已證實(shí)血管內(nèi)膜下的泡沫巨噬細(xì)胞焦亡在炎癥性血管疾病——?jiǎng)用}粥樣硬化（atherosclerosis， AS）的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，泡沫巨噬細(xì)胞焦亡可造成AS斑塊中脂質(zhì)壞死核心的形成擴(kuò)大、AS斑塊的不穩(wěn)定性，以及動(dòng)脈血栓的形成［7-9］。而細(xì)胞焦亡信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的藥理特異性阻斷和基因缺失則可有效緩解巨噬細(xì)胞焦亡及AS斑塊的形成病變［10-13］，因此，細(xì)胞焦亡中涉及的關(guān)鍵分子可為防治AS提供新思路和新靶點(diǎn)。

硫化氫（hydrogen sulfide， H2S）作為一種繼一氧化氮和一氧化碳之后的新型氣體信號(hào)分子，其供體藥物在心血管疾病治療中具有重要的應(yīng)用價(jià)值［14］，但H2S對(duì)AS發(fā)病中巨噬細(xì)胞焦亡的作用尚不明確。在本研究中，我們采用AS發(fā)病危險(xiǎn)因素——氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein， ox-LDL）刺激人髓系白血病單核細(xì)胞系THP-1起源的巨噬細(xì)胞，構(gòu)建泡沫巨噬細(xì)胞焦亡模型，旨在探討外源性H2S供體硫氫化鈉（sodium hydrosulfide， NaHS）對(duì)泡沫巨噬細(xì)胞焦亡的調(diào)節(jié)作用。

材料和方法

1　材料

1.1 細(xì)胞 人髓系白血病單核細(xì)胞THP-1購(gòu)自ATCC。

1.2 藥物和試劑 THP-1細(xì)胞專用培養(yǎng)液購(gòu)自Procell；佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate， PMA）和細(xì)胞蛋白抽提試劑盒購(gòu)自Solarbio；ox-LDL購(gòu)自Yiyuan Biotechnology；NaHS購(gòu)自Sigma；CCK-8試劑購(gòu)自Dojindo；Hoechst 33342/PI熒光染料及乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDH）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；caspase-1活性測(cè)定試劑盒購(gòu)Beyotime；小鼠抗人β-actin抗體和Ⅱ抗（包括辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠抗體）均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗人NLRP3、pro-caspase-1和GSDMD抗體購(gòu)自Abcam；GSDMD-N抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；兔抗人caspase-1 （p20）抗體和IL-18抗體購(gòu)自Proteintech；化學(xué)發(fā)光試劑盒和PVDF膜購(gòu)自Millipore。

1.3主要儀器設(shè)備細(xì)胞培養(yǎng)箱（賽默飛世爾公司）；熒光顯微鏡（奧林巴斯公司）；低溫高速離心機(jī)（賽默飛世爾公司）；酶標(biāo)儀（賽默飛世爾公司）；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（北京六一生物科技有限公司）。

2　方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)將THP-1細(xì)胞以1×109L-1接種于含THP-1專用培養(yǎng)液［RPMI-1640、10%胎牛血清、0.05 mmol/L β-巰基乙醇和1%雙抗（1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素）］的細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于CO2培養(yǎng)箱（37 ℃飽和濕度環(huán)境、5% CO2）中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度為3×108～2×109L-1時(shí)進(jìn)行傳代鋪板，并進(jìn)行后續(xù)藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)。

2.2藥物干預(yù)與實(shí)驗(yàn)分組將THP-1細(xì)胞接種于含1%胎牛血清培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)板中，使用濃度為100 μg/L PMA處理THP-1細(xì)胞24 h，以誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。將細(xì)胞密度調(diào)整為1×108～2×109L-1之后使用ox-LDL或/和NaHS對(duì)THP-1細(xì)胞進(jìn)行處理，并分為以下3組：（1）空白對(duì)照組：正常THP-1細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)THP-1巨噬細(xì)胞24 h；（2）ox-LDL處理組：根據(jù)文獻(xiàn)［15］采用終濃度為25、50、100和150 mg/L的ox-LDL處理THP-1巨噬細(xì)胞24 h；（3）NaHS+ox-LDL干預(yù)組：根據(jù)文獻(xiàn)［16］采用50、100和200 μmol/L NaHS預(yù)處理THP-1巨噬細(xì)胞30 min，再加入ox-LDL（100 mg/L）后培養(yǎng)細(xì)胞24 h。

2.3細(xì)胞活性檢測(cè)PMA誘導(dǎo)分化的THP-1巨噬細(xì)胞（每孔1×104細(xì)胞）經(jīng)不同濃度NaHS（0、50、100、200和400 μmol/L）干預(yù)24 h后向各孔加入100 μL含CCK-8溶液（體積比10%）的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，在37 ℃條件下孵育1～3 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度。最后參照CCK-8試劑盒中的公式計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)活力。

2.4Hoechst 33342/PI染色Hoechst 33342是具有一定細(xì)胞膜通透性的熒光染料，能進(jìn)入正常細(xì)胞中與DNA結(jié)合使細(xì)胞染上深藍(lán)色熒光；PI是一種DNA結(jié)合性染料，不能透過(guò)正常完整的細(xì)胞膜，但當(dāng)細(xì)胞焦亡形成膜穿孔時(shí)可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)使其染上紅色熒光。本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)［17］中的方法檢測(cè)各組細(xì)胞在3個(gè)隨機(jī)視野下的PI陽(yáng)性染色的細(xì)胞數(shù)目，并根據(jù)公式PI陽(yáng)性染色的細(xì)胞比例（%）=PI陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%計(jì)算分析各組細(xì)胞焦亡情況。

2.5LDH釋放測(cè)定參照文獻(xiàn)［18］使用LDH活性檢測(cè)試劑盒于450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清的吸光度（），并根據(jù)公式LDH活性（U/L）=（測(cè)定孔值-對(duì)照孔值）/（標(biāo)準(zhǔn)孔值-標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照孔值）×0.2×1 000，計(jì)算出培養(yǎng)液上清中的LDH活性。

2.6油紅O染色THP-1巨噬細(xì)胞經(jīng)指定藥物干預(yù)24 h后，用PBS漂洗3次后于4%多聚甲醛溶液中固定15 min；隨后經(jīng)PBS漂洗后于37 ℃條件下用油紅O染液染色10 min；再經(jīng)雙蒸水漂洗后用蘇木素復(fù)染2 min；最后經(jīng)雙蒸水沖洗分色返藍(lán)后甘油封片，并于顯微鏡下觀察拍照。

2.7H2S含量測(cè)定胰酶消化收集經(jīng)特定藥物干預(yù)處理24 h后的細(xì)胞，并向其中加入600 μL磷酸緩沖液（pH 6.8）裂解勻漿，隨后采用H2S檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞中的H2S水平。

2.8caspase-1活性測(cè)定各組細(xì)胞經(jīng)不同藥物干預(yù)24 h后，胰酶消化細(xì)胞，并在600×、4 ℃下離心5 min收集細(xì)胞，PBS漂洗離心后往細(xì)胞團(tuán)塊中加入100 μL裂解液，于冰浴條件下孵育裂解15 min；隨后在4 ℃、18 000×條件下將細(xì)胞勻漿液離心15 min，并吸取上清檢測(cè)細(xì)胞中的蛋白含量。之后根據(jù)caspase-1活性檢測(cè)試劑盒中提供的的試劑和方法，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組樣品405 nm處的吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組細(xì)胞中的caspase-1活性。

2.9免疫印跡實(shí)驗(yàn)向經(jīng)不同藥物處理24 h的細(xì)胞中加入120 μL預(yù)冷的RIPA細(xì)胞裂解液，冰浴裂解20 min；之后將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，將其在4 ℃、12 000 r/min離心15 min并吸取上清，對(duì)各組總蛋白進(jìn)行蛋白定量。隨后用5×蛋白上樣緩沖液稀釋蛋白樣品并取40 μg蛋白上樣，在恒壓條件下完成SDS-PAGE。采用恒流濕轉(zhuǎn)法將總蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，并將PVDF膜移至封閉液中室溫孵育2 h；隨后用1∶1 000稀釋的一抗溶液將PVDF膜在4 ℃下孵育12～16 h；翌日用TBST溶液洗膜后，向PVDF膜上加入Ⅱ抗溶液（1∶10 000）于室溫孵育1.5～2 h。Ⅱ抗孵育后用TBST溶液漂洗，并向膜上加入化學(xué)發(fā)光顯色液，采用X射線膠片對(duì)目的蛋白條帶進(jìn)行曝光。對(duì)曝光膠片掃描后使用ImageJ軟件對(duì)各蛋白表達(dá)條帶進(jìn)行蛋白積分吸光度分析，以內(nèi)參照蛋白β-actin表達(dá)條帶的灰度值對(duì)目的蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用單因素方差分析進(jìn)行組間均數(shù)比較，多重比較采用LSD-檢驗(yàn)。以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　ox-LDL誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞發(fā)生焦亡

為建立ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡模型，本實(shí)驗(yàn)評(píng)估了不同濃度ox-LDL對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞焦亡及焦亡關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的影響。與空白對(duì)照組相比，100和150 mg/L ox-LDL可使THP-1巨噬細(xì)胞中的PI陽(yáng)性染色細(xì)胞比例和LDH釋放顯著升高（<0.05或<0.01），見圖1；且100和150 mg/L ox-LDL可使THP-1巨噬細(xì)胞中焦亡關(guān)鍵蛋白［NLRP3、caspase-1（p20亞單位）、GSDMD］及焦亡相關(guān)炎性介質(zhì)IL-18的表達(dá)水平顯著上調(diào)（<0.05或<0.01），見圖2。

Figure 1.　Effect of different concentrations of ox-LDL on the pyroptosis of THP-1-derived macrophages. A： double staining of Hoechst 33342 （blue） and PI （red） in THP-1-derived macrophages （scale bar=50 μm）； B： LDH activity in the cell culture supernatants. Mean±SD. n=4. *P<0.05，**P<0.01 vs 0 mg/L group.

Figure 2.　Effect of different concentrations of ox-LDL on the expression of pyroptosis-related proteins in THP-1-derived macrophages. β-actin was used as an internal control. Mean±SD. n=5. *P<0.05，**P<0.01 vs 0 mg/L group.

2　NaHS減輕ox-LDL刺激的THP-1巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積和細(xì)胞焦亡

為初步研究NaHS對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡的影響，我們采用不同濃度NaHS（50、100、200和400 μmol/L）或/和100 mg/L ox-LDL干預(yù)THP-1巨噬細(xì)胞，檢測(cè)了不同濃度NaHS對(duì)細(xì)胞活力的影響，以及各組THP-1巨噬細(xì)胞中的H2S含量、脂質(zhì)沉積、焦亡細(xì)胞形態(tài)、PI陽(yáng)性細(xì)胞比例和LDH釋放。如圖3A所示，與空白對(duì)照相比，不同濃度NaHS對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞無(wú)毒性作用；而ox-LDL處理的THP-1巨噬細(xì)胞中的H2S含量顯著減少（<0.01；圖3B），并出現(xiàn)明顯脂質(zhì)沉積和以細(xì)胞腫脹膨大及氣泡狀突出物為特點(diǎn)的細(xì)胞焦亡（<0.01），且ox-LDL處理可使THP-1巨噬細(xì)胞PI陽(yáng)性細(xì)胞比例和LDH釋放顯著升高（<0.01），見圖4～6。與ox-LDL處理組相比，不同濃度NaHS干預(yù)則可使THP-1巨噬細(xì)胞中的H2S含量顯著升高（<0.05或<0.01；圖3B），并減輕ox-LDL誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積和細(xì)胞焦亡（<0.05或<0.01），見圖4、5。此外，中、高濃度（100和200 μmol/L）NaHS干預(yù)還可顯著降低THP-1巨噬細(xì)胞的焦亡細(xì)胞比例和LDH釋放（<0.01），見圖6。

Figure 3.　Effect of gradient concentrations of NaHS on the viability （A） and H2S level （B） in THP-1-derived macrophages. Mean±SD. n=5. *P<0.05，**P<0.01 vs control group （0 μmol/L NaHS or 0 μmol/L NaHS+0 mg/L ox-LDL）；#P<0.05，##P<0.01 vs ox-LDL （100 mg/L） group.

Figure 4.　Effect of gradient concentrations of NaHS on lipid accumulation in ox-LDL incubated THP-1-derived macrophages （oil red O staining， scale bar=25 μm）.

Figure 5.　Effect of gradient concentrations of NaHS on morphological characteristics of pyroptosis in ox-LDL-incubated THP-1-derived macrophages. The scale bar=25 μm in the upper panel， and high-power fields with magnified details were shown in the lower panel. The arrowheads indicate typical pyroptotic cells with cell swelling， and large bubbles extending from the plasma membrane with plasma membrane rupture. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs control group （0 μmol/L NaHS+0 mg/L ox-LDL）；#P<0.01，##P<0.01 vs ox-LDL （100 mg/L） group.

Figure 6.　Effect of gradient concentrations of NaHS on ox-LDL-induced pyroptosis of THP-1-derived macrophages. A： double staining of Hoechst 33342 （blue） and PI （red） in THP-1-derived macrophages （scale bar=50 μm）； B： LDH activity in the cell culture supernatants. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs control group （0 μmol/L NaHS+0 mg/L ox-LDL）；##P<0.01 vs ox-LDL （100 mg/L） group.

3　NaHS抑制ox-LDL處理的THP-1巨噬細(xì)胞中焦亡關(guān)鍵酶caspase-1活性和焦亡關(guān)鍵標(biāo)志蛋白的表達(dá)

為進(jìn)一步探討NaHS抑制THP-1巨噬細(xì)胞焦亡的作用，我們檢測(cè)了不同濃度NaHS對(duì)ox-LDL處理的THP-1巨噬細(xì)胞中細(xì)胞焦亡關(guān)鍵酶caspase-1活性及焦亡關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照相比，ox-LDL處理可使THP-1巨噬細(xì)胞中的caspase-1活性及焦亡關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平（<0.01）顯著升高；而中、高濃度的NaHS可顯著抑制ox-LDL處理的THP-1巨噬細(xì)胞中的caspase-1活性（<0.05或<0.01），并顯著下調(diào)上述焦亡關(guān)鍵標(biāo)志蛋白的表達(dá)（<0.05或<0.01），見圖7、8。

Figure 7. Effect of gradient concentrations of NaHS on the enzymatic activity of caspase-1 in ox-LDL-incubated THP-1-derived macrophages. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs control group （0 μmol/L NaHS+0 mg/L ox-LDL）；#P<0.05，##P<0.01 vs ox-LDL （100 mg/L） group.

Figure 8.　Effect of gradient concentrations of NaHS on the expression of pyroptosis-related proteins in ox-LDL-incubated THP-1-derived macrophages. β-actin was used as an internal control. Mean±SD. n=5. **P<0.01 vs control group （0 μmol/L NaHS+0 mg/L ox-LDL）；#P<0.05，##P<0.01 vs ox-LDL （100 mg/L） group.

討論

巨噬細(xì)胞作為先天免疫和組織修復(fù)中的關(guān)鍵免疫細(xì)胞，其所形成的泡沫巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥應(yīng)答在AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有決定性作用［5，7］。因此，抑制巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)對(duì)于防治AS具有重要意義。研究表明，AS致病危險(xiǎn)因素包括ox-LDL、膽固醇結(jié)晶、甘油三酯和同型半胱氨酸誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞導(dǎo)致AS發(fā)生發(fā)展［3，5，19］的同時(shí)，還可誘導(dǎo)泡沫巨噬細(xì)胞發(fā)生一種促炎性細(xì)胞程序性死亡—細(xì)胞焦亡［5， 19］，其典型細(xì)胞形態(tài)特征為膜孔形成、細(xì)胞腫脹及其滲透性裂解［17， 20］。在本研究中我們采用光鏡觀察和細(xì)胞焦亡鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)［7］（PI染色和LDH釋放）初步證實(shí)了中、高濃度的ox-LDL可顯著誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞發(fā)生以細(xì)胞腫脹裂解、PI陽(yáng)性細(xì)胞比例和LDH釋放升高為主要特征的細(xì)胞焦亡。在體動(dòng)物和細(xì)胞體外研究表明上述AS致病危險(xiǎn)因素均可上調(diào)并激活細(xì)胞焦亡信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白而使巨噬細(xì)胞發(fā)生焦亡［3， 5， 9， 21］。這與本研究中、高濃度的ox-LDL可明顯上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞中NLRP3、caspase-1、GSDMD、GSDMD-N和IL-18的表達(dá)相一致。因此，本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了ox-LDL對(duì)巨噬細(xì)胞焦亡的誘導(dǎo)作用。近期有研究表明阻斷NLRP3或caspase-1可有效抑制巨噬細(xì)胞焦亡及其介導(dǎo)的AS的發(fā)生發(fā)展［10-13］。因此，探討NLRP3-caspase-1-GSDMD介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡可為防治AS提供新思路。

近十年來(lái)對(duì)于信號(hào)分子H2S的心血管保護(hù)和抗炎作用［14，22］已達(dá)成共識(shí)，且本研究中也再次證實(shí)了不同濃度的H2S供體NaHS對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)沉積的抑制作用。然而，H2S是否可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡尚不清楚。在本文中，我們深入探索了不同濃度NaHS對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞焦亡和焦亡關(guān)鍵蛋白表達(dá)或活性的影響，結(jié)果顯示ox-LDL在誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞焦亡的同時(shí)可降低巨噬細(xì)胞中的H2S水平。而中、高濃度NaHS處理可顯著增加細(xì)胞內(nèi)的H2S水平，且其可通過(guò)抑制THP-1巨噬細(xì)胞中的caspase-1活性、下調(diào)焦亡關(guān)鍵蛋白（NLRP3、Pro-caspase-1、caspase-1、GSDMD、GSDMD-N）和焦亡相關(guān)炎性介質(zhì)（IL-18）的表達(dá)而抑制經(jīng)典焦亡信號(hào)通路的激活，進(jìn)而減輕ox-LDL引發(fā)的巨噬細(xì)胞焦亡。這與本課題組已發(fā)表成果中關(guān)于H2S緩釋性供體GYY4137可通過(guò)下調(diào)經(jīng)典焦亡信號(hào)通路而對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞焦亡發(fā)揮抑制作用的研究結(jié)果［17］相一致，因此，本研究進(jìn)一步證實(shí)了H2S對(duì)細(xì)胞焦亡及其信號(hào)通路的調(diào)控作用。

雖然已有研究表明H2S及其供體可通過(guò)下調(diào)巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用［23-27］，但這些研究主要聚焦于H2S對(duì)巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥小體激活的抑制作用，因缺少焦亡關(guān)鍵指標(biāo)的檢測(cè)而未能充分說(shuō)明H2S對(duì)巨噬細(xì)胞焦亡的抑制作用。而本研究不但驗(yàn)證了H2S對(duì)NLRP3炎癥小體激活的抑制作用，且通過(guò)細(xì)胞焦亡關(guān)鍵檢測(cè)指標(biāo)（光鏡觀察、PI陽(yáng)性染色、LDH釋放、焦亡關(guān)鍵酶caspase-1活性、焦亡執(zhí)行者GSDMD蛋白及打孔蛋白GSDMD-N的表達(dá)）明確了H2S對(duì)巨噬細(xì)胞焦亡的抑制效應(yīng)及其可能機(jī)制。然而，本研究結(jié)果及當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究仍局限于H2S供體抑制細(xì)胞焦亡信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)而發(fā)揮抗細(xì)胞焦亡或抗AS效應(yīng)的表象認(rèn)識(shí)，而對(duì)于H2S通過(guò)何種分子機(jī)制抑制細(xì)胞焦亡并發(fā)揮抗AS作用尚不清楚。目前研究認(rèn)為H2S對(duì)功能蛋白的硫巰基化修飾是其發(fā)揮生物學(xué)功能、影響蛋白質(zhì)二硫鍵形成和調(diào)節(jié)眾多功能蛋白活性的關(guān)鍵機(jī)制，且硫巰基化修飾與心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)維持及AS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［28］。因此，H2S是否可通過(guò)硫巰基化修飾焦亡關(guān)鍵蛋白而發(fā)揮抗細(xì)胞焦亡和抗AS效應(yīng)仍有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究在已有相關(guān)研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，在巨噬細(xì)胞中進(jìn)一步提供了H2S通過(guò)下調(diào)經(jīng)典焦亡信號(hào)通路而對(duì)細(xì)胞焦亡發(fā)揮抑制效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

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Sodium hydrosulfide attenuates pyroptosis of macrophages by inhibiting classical pyroptosis signaling pathway

ZHANG Xu-lin1， TIAN Xiang-qin2，3▲， JIA Zhen-li1， LIU Bo-wei1， LIANG Gao-yuan1， ZHANG Zi-chen1， LI Ling1△， ZHANG Liang1，2△

（1，，832003，；2，，，，832008，；3，，453003，）

To investigate the effect of hydrogen sulfide （H2S） donor sodium hydrosulfide （NaHS） on the pyroptosis of macrophages.Human acute monocytic leukemia cell line THP-1 was induced to differentiate into macrophages by phorbol 12-myristate 13-acetate （PMA） stimulation. The PMA-induced THP-1 cells were treated with oxidized low-density lipoprotein （ox-LDL） or/and NaHS at different concentrations and then were divided into control group， ox-LDL （25， 50， 100 and 150 mg/L） treatment groups and different concentrations （50， 100 and 200 μmol/L） of NaHS+ox-LDL （100 mg/L） treatment groups. The viability of THP-1 cells was detected by CCK-8 assay. Lipid accumulation and pyroptotic morphological changes in THP-1 cells were observed by oil red O staining and light microscopy， respectively. Pyroptosis of the THP-1 cells was evaluated by Hoechst 33342/propidium iodide （PI） fluorescence staining and measurement of lactate dehydrogenase （LDH） activity in the cell supernatants. The level of H2S in THP-1 cells was detected by H2S detection assay kit. The enzymatic activity of caspase-1 in THP-1 cells were measured by caspase-1 activity assay kit. The expressional levels of pyroptosis-related proteins in THP-1 cells were analyzed by Western blot.Compared with control group， percentage of PI positive cells， LDH release， caspase-1 activity， and the protein levels of nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 （NLRP3）， caspase-1 （p20）， gasdermin D （GSDMD）， GSDMD-N and interleukin-18 （IL-18） were markedly increased by stimulation with 100 and 150 mg/L of ox-LDL （<0.05 or<0.01）. In addition， ox-LDL （100 mg/L） induced lipid accumulation and typical pyroptotic death in THP-1 cells. However， pre-treatment with NaHS （100 and 200 μmol/L） significantly reduced ox-LDL-induced lipid accumulation and pyroptosis in THP-1 cells， and suppressed caspase-1 activity and the up-regulation of specific markers of pyroptosis signaling pathway in ox-LDL-stimulated THP-1 cells （<0.05 or<0.01）.The H2S donor NaHS attenuates pyroptotic cell death induced by ox-LDL in macrophages by inhibiting classical pyroptosis signaling pathway.

Hydrogen sulfide； Oxidized low-density lipoprotein； Macrophages； Pyroptosis

R543.5； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.06.008

1000-4718（2022）06-1015-09

2022-03-25

2022-05-26

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No. 81600325）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（No. 2020-PT330-003）；國(guó)家衛(wèi)生健康委中亞高發(fā)病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（No. KF202107）；兵團(tuán)“強(qiáng)青科技領(lǐng)軍人才”項(xiàng)目（No. 2022CB002-10）；自治區(qū)研究生創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（No. XJ2021G130）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（No. 202110759023）

張亮 Tel： 0993-2058775； E-mail： zxn20171220@126.com；李玲 Tel： 18209058319； E-mail： 550856991@qq.com

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（責(zé)任編輯：盧萍，羅森）