淫羊藿苷對心力衰竭大鼠線粒體自噬及能量代謝的影響

程相閣，劉萬周，王東偉

1.黃河三門峽醫(yī)院心臟重癥醫(yī)學(xué)科，三門峽 472000；2.黃河三門峽醫(yī)院醫(yī)務(wù)部，三門峽 472000；3.鄭州中心醫(yī)院心內(nèi)科，鄭州 450000

心力衰竭是由心臟疾病引起心肌細胞凋亡、進行性細胞喪失導(dǎo)致心臟收縮和舒張功能障礙的綜合征，是心血管疾病的終末期表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，長期心力衰竭會使患者患癌癥的概率增加［1］，因此，研發(fā)治療心力衰竭的有效藥物刻不容緩。在多種心臟疾病中，由自噬引起的心肌細胞凋亡已被廣泛報道，例如缺血再灌注損傷、糖尿病心肌病等［2-3］。自噬引起癌細胞凋亡，發(fā)揮抑瘤作用［4］。淫羊藿苷（icariin）是淫羊藿的主要化學(xué)成分，具有廣泛的生物活性，在心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)疾病中均具有治療作用［5］。有研究報道，淫羊藿苷通過抑制細胞自噬，降低糖氧剝奪造成的細胞凋亡［6］。但是淫羊藿苷在心力衰竭中的作用需進一步探討，本研究旨在探討淫羊藿苷是否能降低線粒體自噬，抑制細胞凋亡，從而改善心力衰竭大鼠的心功能和心肌代謝。

1 儀器和材料

1.1 儀器

JEM1230型透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）；T0P0 型動物呼吸機（上海贊德醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 試藥

淫羊藿苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%，四川維克奇生物技術(shù)有限公司）；單磷酸腺苷（adenosinemonophosphate，AMP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）ELISA 試劑盒，均購自南京卡米洛生物工程有限公司；TUNEL 染色試劑盒（瑞士Roche公司）；PINK1過表達質(zhì)粒（pcDNA3.1-PINK1，上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；兔抗大鼠微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtube-associated protein 1 light chain 3，LC3），PTEN誘導(dǎo)激酶1（PTEN-induced kinase 1，PINK1），E3泛素連接酶帕金森病蛋白（E3 ubiquitin ligases，parkin），p62和GAPDH 抗體均購自英國Abcam 公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（美國Sigma公司）。

1.3 動物

健康清潔級雄性SD 大鼠，55只，8周齡，體質(zhì)量為180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2018-0001。飼養(yǎng)于河南省疾病預(yù)防控制中心，實驗動物使用許可證號SYXK（豫）2017-0009，動物倫理福利批準(zhǔn)號ZZZXYY20180306 01；飼養(yǎng)期間自由進水，室內(nèi)溫度控制在22～25℃，保持相對濕度為40%～60%，12 h／12 h明暗交替。

2 方法

2.1 分組與給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，用戊巴比妥鈉麻醉，固定于鼠板上，連接心電圖機。鈍性分離氣管，用小型動物呼吸機輔助呼吸。45只大鼠于左胸第3～4肋骨間分離皮層、筋膜、肌肉、暴露胸腔，剪開心包，在左心耳下緣與肺動脈圓錐間距主動脈根部3 mm 處用0 號絲線結(jié)扎左冠狀動脈前降支（left anterior descending branch，LAD），觀察心電圖，直到ST 段抬高、左心室前壁變蒼白為造模成功［7］，縫合關(guān)胸，待恢復(fù)大鼠自主呼吸后，撤掉呼吸機。另外10只大鼠打開胸腔，剪開心包，于相同部位穿線但不結(jié)扎，其余操作步驟同上，作為假手術(shù)組。術(shù)后24 h，假手術(shù)組大鼠存活10只，40只大鼠左冠狀動脈前降支結(jié)扎成功，隨機分為模型組、淫羊藿苷組、PINK1 組以及PINK1＋淫羊藿苷組，每組10只。術(shù)后第2天，淫羊藿苷組和PINK1＋淫羊藿苷組大鼠用淫羊藿苷60 mg·kg－1灌胃，假手術(shù)組、模型組和PINK1組大鼠用等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃14 d；從術(shù)后第8天開始，PINK1組和PINK1＋淫羊藿苷組大鼠打開胸腔，暴露心臟，在左心室游離壁的上、下、左和右4個部位局部注射pcDNA3.1-PINK1 20μL，每隔1 d進行一次，假手術(shù)組、模型組和淫羊藿苷組大鼠注射生理鹽水，縫合關(guān)胸。

2.2 超聲心動圖檢測心功能

末次給藥24 h后，麻醉大鼠，胸部脫毛，用高分辨率超聲心動系統(tǒng)進行經(jīng)胸超聲心動圖檢測，得到左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）、左 心 室 收 縮 末 期 內(nèi)徑（left ventricular end-systolic dimension，LVESD）、左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD）。

2.3 ELISA 檢測血清ATP、ADP、AMP水平

超聲心動圖檢測完畢后，主動脈采血，靜置30 min后，以3 000 r·min－1離心15 min，收集上清。按照ELISA 試劑盒說明書中的步驟進行操作，檢測血清中ATP、ADP、AMP的含量。

2.4 qRT-PCR法檢測PINK1 mRNA的相對表達量

取部分心肌梗死交界區(qū)組織，用Trizol試劑提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板，進行PCR 擴增。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)，72℃延伸10 min。引物序列見表1。以GAPDH 為內(nèi)參，用2－CT法計算PINK1 m RNA 的相對表達量。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 Primer sequence of qRT-PCR

2.5 TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡

采血完畢后，處死大鼠，摘取心臟，取部分梗死交接區(qū)心臟組織置于質(zhì)量濃度為100 g·L－1的多聚甲醛中固定后，常規(guī)脫水，包埋，切片，烤片，切片厚度為4μm，用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇梯度脫水后，嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒說明書操作。在激光共聚焦顯微鏡下采集圖像，每張切片隨機選取5個視野，計算心肌細胞凋亡率。心肌細胞凋亡率＝（凋亡細胞核數(shù)／總細胞核數(shù)）×100%。

2.6 透射電鏡觀察心肌細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)

在梗死交接區(qū)取體積為3 mm×3 mm×3 mm的心臟組織，置于戊二醛中固定3 h。用磷酸緩沖液漂洗3次，每次10 min，置于鋨酸中固定3 h，用磷酸緩沖液漂洗3 次，每次10 min，依次用體積分?jǐn)?shù)50%、70%、80%、90%、95%的乙醇和乙醇梯度脫水。用樹脂浸透包埋后置于70℃聚合48 h，60 nm 超薄切片，用醋酸雙氧鈾染色10 min，檸檬酸鉛染色10 min，室溫干燥后置于透射電子顯微鏡下觀察。

2.7 Western blot檢測心肌組織蛋白的表達

取心肌梗死交接區(qū)組織100 mg保存于液氮中，勻漿，加入適量RIPA 裂解液裂解，冰上靜置30 min，在4℃以12 000 r·min－1離心10 min后收集上清液。用BCA 法測定蛋白濃度，加入溴酚藍煮沸。進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔加入蛋白樣品20μL，120 V 恒壓電泳1.5 h，直至溴酚藍電泳至分離膠底部，停止電泳。將蛋白條帶濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，洗膜3次，每次5 min；室溫封閉2 h；PINK1、parkin、p62、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和GAPDH 一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，洗膜3次，每次5 min；二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，洗膜3次，每次5 min；ECL 化學(xué)發(fā)光顯影。用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH 蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達水平。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 qRT-PCR 檢測結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組PINK1 m RNA 的相對表達量升高；與模型組比較，淫羊藿苷組PINK1 mRNA的相對表達量降低，PINK1組PINK1 mRNA的相對表達量升高（P＜0.05）；與淫羊藿苷組比較，PINK1＋淫羊藿苷組PINK1 mRNA 的相對表達量升高（P＜0.05）；與PINK1組比較，PINK1＋淫羊藿苷組PINK1 m RNA 的相對表達量降低（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 PINK1 mRNA相對表達量的比較（±s，n＝10）Tab.2 Comparison of the mRNA relative level of PINK1（±s，n＝10）

表2 PINK1 mRNA相對表達量的比較（±s，n＝10）Tab.2 Comparison of the mRNA relative level of PINK1（±s，n＝10）

注：與假手術(shù)組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05；與淫羊藿苷組比較，c P＜0.05；與PINK1組比較，d P＜0.05。

項目PINK1假手術(shù)組0.23±0.09模型組 0.55±0.12a淫羊藿苷組 0.35±0.10ab PINK1組 0.76±0.12abc PINK1＋淫羊藿苷組 0.64±0.11abcd F 39.178 P＜0.001

3.2 心功能指標(biāo)的檢測結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組LVEF 和LVFS降低，LVESD 和LVEED 增長（P＜0.05）；與模型組比較，淫羊 藿 苷 組LVEF 和LVFS 升 高，LVESD 和LVEED縮 短，PINK1 組LVEF 和LVFS 降 低，LVESD 和LVEED 增長（P＜0.05）；與淫羊藿苷組比 較，PINK1 組LVEF 和LVFS 降 低，LVESD 和LVEED 增長（P＜0.05）；與PINK1組比較，PINK1＋淫 羊 藿 苷 組LVEF 和LVFS 升 高，LVESD 和LVEED縮短（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3 心功能指標(biāo)比較（±s，n＝10）Tab.3 Comparison of the index of heart function（±s，n＝10）

表3 心功能指標(biāo)比較（±s，n＝10）Tab.3 Comparison of the index of heart function（±s，n＝10）

注：與假手術(shù)組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05；與淫羊藿苷組比較，c P＜0.05；與PINK1組比較，d P＜0.05。

項目 LVEF LVFS LVESD／mm LVEDD／mm假手術(shù)組 72.63%±5.12% 40.71%±5.22% 3.19±0.52 6.13±0.66模型組 47.88%±5.74%a 22.18%±3.04%a 7.83±0.74a 9.78±0.73a淫羊藿苷組 65.60%±6.47%ab 34.50%±4.32%ab 4.59±0.51ab 7.64±0.62ab PINK1組 40.34%±5.31%abc 16.74%±5.62%abc 9.53±0.58abc 11.58±0.64abc PINK1＋淫羊藿苷組 54.17%±6.02%abcd 29.80%±4.41%abcd 5.17±0.52abcd 8.71±0.74abcd F 51.611 42.921 195.588 92.887 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3.3 ELISA 檢測結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組ATP 含量降低，ADP和AMP含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，淫羊藿苷組ATP 含 量 升 高，ADP 和AMP 含 量 降 低，PINK1組ATP 含量降低，ADP 和AMP 含量升高（P＜0.05）；與淫羊藿苷組比較，PINK1＋淫羊藿苷組ATP 含 量 降 低，ADP 和AMP 含 量 升 高（P＜0.05）；與PINK1 組比較，PINK1＋淫羊藿苷組ATP含量升高，ADP和AMP含量降低（P＜0.05）。結(jié)果見表4。

表4 血清中ATP、ADP和AMP含量比較（±s，n＝10）Tab.4 Comparison of ATP，ADP and AMP levels in serum（±s，n＝10）

表4 血清中ATP、ADP和AMP含量比較（±s，n＝10）Tab.4 Comparison of ATP，ADP and AMP levels in serum（±s，n＝10）

注：與假手術(shù)組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05；與淫羊藿苷組比較，c P＜0.05；與PINK1組比較，d P＜0.05。

images/BZ_60_2021_2461_2038_2461.png項目 含量／（μg·L－1）ATP ADP AMP假手術(shù)組724.02±112.30 235.60±58.37 146.30±32.48模型組 308.74±65.58a 594.63±94.22a 347.28±56.47a淫羊藿苷組 594.69±105.27ab 352.14±67.40ab 194.73±34.21ab PINK1組 243.24±62.44abc 747.58±52.68abc 502.69±31.54abc PINK1＋淫羊藿苷組 412.39±108.57abcd 423.51±50.17abcd 273.64±42.55abcd F 45.765 92.439 119.335 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3.4 心肌細胞凋亡率的檢測結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與模型組比較，淫羊藿苷組大鼠心肌細胞凋亡率降低，PINK1組升高（P＜0.05）；與淫羊藿苷組比較，PINK1＋淫羊藿苷組大鼠心肌細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與PINK1組比較，PINK1＋淫羊藿苷組大鼠心肌細胞凋亡率降低（P＜0.05）。結(jié)果 見圖1、表5。

圖1 TUNEL染色觀察心肌細胞凋亡（×400）Fig.1 Myocardial apoptosis detected with TUNEL staining（×400）

表5 心肌細胞凋亡率的比較（±s，n＝10）Tab.5 Comparison of myocardial apoptosis rate（±s，n＝10）

表5 心肌細胞凋亡率的比較（±s，n＝10）Tab.5 Comparison of myocardial apoptosis rate（±s，n＝10）

注：與假手術(shù)組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05；與淫羊藿苷組比較，c P＜0.05；與PINK1組比較，d P＜0.05。

項目 心肌細胞凋亡率假手術(shù)組3.64%±1.20%模型組 14.47%±2.05%a淫羊藿苷組 7.63%±1.14%ab PINK1組 20.41%±2.30%abc PINK1＋淫羊藿苷組 10.64%±2.27%abcd F 119.071 P＜0.001

3.5 線粒體超微結(jié)構(gòu)變化

假手術(shù)組大鼠心肌細胞線粒體膜結(jié)構(gòu)清晰可見，肌小節(jié)排列整齊，橫紋可見；模型組大鼠心肌細胞線粒體水腫，嵴模糊不清，或斷裂、缺失，肌漿網(wǎng)終池擴張；淫羊藿苷組大鼠心肌細胞線粒體輕度水腫，部分嵴融合模糊不清，或斷裂、缺失，病變程度較模型組輕；PINK1組大鼠心肌細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)可見空泡化，膜結(jié)構(gòu)融合，模糊不清，肌纖維紊亂，閏盤扭曲，病變嚴(yán)重；PINK1＋淫羊藿苷組大鼠線粒體超微結(jié)構(gòu)較PINK1組改善。結(jié)果見圖2。

圖2 透射電鏡觀察心肌細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)Fig.2 Mitochondrial ultrastructure of cardiomyocytes observed under transmission electron microscope

3.6 蛋白印跡法檢測結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組PINK1、parkin、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ升高，p62 降低（P＜0.05）；與模型組比較，淫羊藿苷組PINK1、parkin、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ降低，p62 升 高，PINK1 組PINK1、parkin、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ升高，p62 降低（P＜0.05）；與淫羊藿苷組比較，PINK1＋淫羊藿苷組PINK1、parkin、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ升高，p62降低（P＜0.05）；與PINK1組比較，PINK1＋淫羊藿苷組PINK1、parkin、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ降低，p62升高（P＜0.05）。結(jié)果見表6、圖3。

圖3 Western blot檢測心肌組織中各蛋白的表達水平Fig.3 The expression levels of proteins in myocardium by Western blot

表6 心肌組織中PINK1、parkin、p62、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ水平比較（±s，n＝10）Tab.6 Comparison of PINK1、parkin、p62、LC3Ⅱ／LC3Ⅰlevels in myocardioal tissue（±s，n＝10）

表6 心肌組織中PINK1、parkin、p62、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ水平比較（±s，n＝10）Tab.6 Comparison of PINK1、parkin、p62、LC3Ⅱ／LC3Ⅰlevels in myocardioal tissue（±s，n＝10）

注：與假手術(shù)組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05；與淫羊藿苷組比較，c P＜0.05；與PINK1組比較，d P＜0.05。

項目 PINK1 parkin p62 LC3Ⅱ／LC3Ⅰ假手術(shù)組0.54±0.03 0.51±0.05 1.26±0.10 0.27±0.06模型組 0.99±0.10a 0.98±0.12a 0.58±0.08a 0.73±0.07a淫羊藿苷組 0.76±0.05ab 0.64±0.05ab 0.92±0.07ab 0.44±0.05ab PINK1組 1.10±0.11abc 1.13±0.13abc 0.23±0.06abc 0.88±0.06abc PINK1＋淫羊藿苷組 0.86±0.12abcd 0.85±0.10abcd 0.74±0.07abcd 0.65±0.07abcd F 58.396 67.786 246.779 148.795 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

4 討論

心力衰竭是多種心臟疾病的終末期表現(xiàn)，是造成心臟疾病患者死亡的主要原因。越來越多的研究表明，線粒體功能障礙與多種疾?。ㄈ缧募∪毖俟嘧p傷、急性腎損傷以及糖尿病心肌病等）的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)［8-10］。因此，藥物靶向線粒體治療心臟疾病受到廣泛關(guān)注。線粒體自噬是一種線粒體質(zhì)量控制機制，通過清除損傷的線粒體維持線粒體功能的完整性，發(fā)揮心臟保護作用［11］。在生理狀況下，細胞內(nèi)線粒體自噬水平維持在一定范圍，可有效清除功能損傷的線粒體，并為細胞提供能量。但是在應(yīng)激狀態(tài)下，線粒體自噬過程紊亂，功能缺陷線粒體不能被及時清除，導(dǎo)致功能缺陷線粒體的數(shù)量增加，產(chǎn)生大量活性氧，氧化應(yīng)激水平升高，造成細胞凋亡［12］。線粒體作為主要的能量合成場所，其自噬與能量代謝密不可分。本研究旨在探討淫羊藿苷對心力衰竭大鼠心肌線粒體自噬和心肌能量代謝的影響，為臨床治療心力衰竭提供新的靶點。

本研究采用左冠狀動脈前降支結(jié)扎的方法建立心力衰竭大鼠模型，通過灌胃給藥研究淫羊藿苷對模型大鼠心力衰竭的影響。LVEF、LVESD 和LVEED是臨床上判斷心力衰竭患者心功能的常用指標(biāo)［13］，本研究通過超聲心動圖檢測這些指標(biāo)的改變情況，結(jié)果表明，心力衰竭大鼠LVEF和LVFS降低，LVESD和LVEED 增長，出現(xiàn)明顯心功能障礙，應(yīng)用淫羊藿苷 后，LVEF 和LVFS 升 高，LVESD 和LVEED 縮短，心功能明顯改善。線粒體功能損傷與細胞凋亡的關(guān)系密切，既往的研究表明，線粒體損傷會產(chǎn)生大量的活性氧，導(dǎo)致線粒體功能障礙，促進糖尿病腎小球足細胞凋亡，而淫羊藿苷可以調(diào)節(jié)線粒體功能，抑制足細胞的凋亡［14］。本實驗結(jié)果表明，心力衰竭大鼠心肌組織發(fā)生明顯的線粒體自噬，淫羊藿苷可降低心力衰竭大鼠心肌組織線粒體的自噬水平。線粒體是合成ATP的主要場所，心力衰竭時由于線粒體功能障礙造成ATP 合成量降低，ADP 和AMP 含量升高，淫羊藿苷能夠使線粒體的ATP 合成量增加，降低ADP和AMP的含量。

正常生理狀態(tài)下，PINK1在線粒體外膜被水解，但是當(dāng)線粒體損傷時，PINK1 水解途徑被阻斷，PINK1在線粒體膜上大量聚集，激活parkin E3連接酶活性，觸發(fā)線粒體自噬過程［15］。PINK1／parkin信號通路參與線粒體自噬的調(diào)節(jié)已在多種病理模型中被廣泛研究［16-18］。在本研究中使心力衰竭大鼠心肌組織中的PINK1過表達，在此基礎(chǔ)上給予大鼠淫羊藿苷灌胃處理，觀察淫羊藿苷對大鼠該通路的影響。實驗結(jié)果表明，淫羊藿苷可以降低PINK1的表達水平，降低線粒體自噬水平。該結(jié)果說明，淫羊藿苷至少在一定程度上通過調(diào)節(jié)PINK1／parkin 信號通路抑制心力衰竭大鼠線粒體自噬水平，從而減少心肌細胞凋亡，改善心功能。

綜上所述，淫羊藿苷可改善心力衰竭大鼠的心功能障礙和心肌能量代謝，其可能是通過PINK1／parkin信號通路調(diào)節(jié)線粒體自噬水平發(fā)揮作用，為淫羊藿苷相關(guān)藥物的研發(fā)及應(yīng)用于心力衰竭的臨床治療提供理論支持。