HPLC法同時測定益腎湯中7種成分的含量

程 偉，趙群濤，裘 罡，杜 瑞，尚慶霞

信陽市食品藥品檢驗所，信陽 464000

中藥湯劑是最常用的中藥復(fù)方劑型，也是中藥歷史上應(yīng)用最久和最廣的制劑。從臨床療效來看，一般認(rèn)為湯劑的療效優(yōu)于其他制劑［1］。益腎湯是信陽市圣康醫(yī)院開發(fā)的常用方劑，療效顯著。本方由紅花、肉蓯蓉、當(dāng)歸、丹參、淫羊藿、補(bǔ)骨脂等十余味中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、活血助陽的功效，用于氣陰兩虛、陽痿血瘀阻滯所致的面色無華或晦暗、少氣乏力、手足心熱、口干咽燥、腰脊酸痛、溺少浮腫、肢冷體麻等慢性腎炎證候者的治療。紅花在方中起活血通經(jīng)、散瘀止痛的功效，大量研究發(fā)現(xiàn)，紅花主要含黃酮類、生物堿類、聚炔類等多種化學(xué)成分，紅花黃色素為紅花中的主要活性成分［2］。肉蓯蓉素有“沙漠人參”之美譽(yù)，其化學(xué)成分及特有的結(jié)構(gòu)是肉蓯蓉發(fā)揮功效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，如苯乙醇苷類中的松果菊苷、毛蕊花糖苷及多糖是抗氧化抗衰老、緩解疲勞等生物活性的物質(zhì)基礎(chǔ)［3］。中高劑量的松果菊苷可以降低糖尿病腎病大鼠的血糖，抑制糖尿病腎病大鼠的腎間質(zhì)纖維化和腎組織細(xì)胞凋亡，改善大鼠的腎功能［4］。研究表明，當(dāng)歸中的有效化學(xué)成分在抑制微炎癥和慢性腎小球腎炎方面的效果明顯［5］。丹參及其提取物均被證實有良好的抗炎效果，丹參水提物和醇提物均顯示出良好的腎保護(hù)作用［6］。研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷可以改善腎臟組織學(xué)形態(tài)和功能，增加腎臟干、祖細(xì)胞數(shù)量和調(diào)節(jié)腎發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，更能改善由氫化可的松誘導(dǎo)的大鼠腎陽不足證［7］。補(bǔ)骨脂中的呋喃香豆素類成分補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素是其主要活性成分，在調(diào)節(jié)雌激素水平、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗炎、抗抑郁、促進(jìn)骨生長、保護(hù)神經(jīng)等方面有多重活性［8］。本方法以方中6味藥材所含的主要成分羥基紅花黃色素A 等為指標(biāo)成分，建立測定此藥7種活性成分的高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC），為控制該制劑的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1200型高效液相色譜儀（G1314B VWD 可變波長紫外檢測器，安捷倫科技有限公司）；Mettler XS205型十萬分之一電子分析天平、TGW16型臺式高速離心機(jī)均購自長沙英泰儀器有限公司；德國普蘭德移液槍（1、5 m L）購自保定普倫商貿(mào)有限公司。

1.2 試藥

對照品：羥基紅花黃色素A（批號111637-201308，質(zhì) 量 分 數(shù) 為96.5%），松 果 菊 苷（批 號111670-201505，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為92.5%），阿魏酸（批號110773-201614，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%），丹酚酸B（批號111592-201716，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.1%），淫羊藿苷（批號110737-201516，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.2%），補(bǔ)骨脂素（批號110739-201617，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%），異補(bǔ)骨脂素（批號110738-201715，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純，美國天地公司）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

益腎湯由紅花、肉蓯蓉、當(dāng)歸、丹參、淫羊藿、補(bǔ)骨脂、補(bǔ)骨脂、地龍、雞血藤、巴戟天、黃精、黨參、金櫻子、菟絲子組成，為本實驗室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色 譜 柱：Sunniest C18（250 mm×4.6 mm，5μm）。流動相：乙腈（A）-1 m L·L－1磷酸水溶液（B）。梯度洗脫（0～5 min，14%A；5～30 min，14%A～34%A；30～40 min，34%A；40～45 min，34%A～14%A；45～55 min，14%A）。檢測波長：0～10 min為403 nm（檢測羥基紅花黃色素A），10～16 min為330 nm（檢測松果菊苷），16～22 min為320 nm（檢測阿魏酸），22～30 min為286 nm（檢測丹酚酸B），30～34 min為270 nm（檢測淫羊藿苷），34～50 min為246 nm（檢測補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素）。流速：1.0 m L·min－1。柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 樣品的制備 各味藥裝布袋加水浸泡30 min，置于煎藥機(jī)中加熱煎煮2次，第1次2 h，第2次1.5 h，合并煎液，靜置，沉淀，過濾，將濾液減壓濃縮至1 000 m L，加熱至沸，灌封，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取羥基紅花黃色素A、松果菊苷、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素7種對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量 濃 度 分 別 為436.18、577.94、455.00、683.92、639.05、489.73、451.73μg·m L－1的對照品儲備溶液，按照不同稀釋倍數(shù)配制成5個不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取樣品1 m L，置于5 m L 具塞錐形瓶中，加甲醇至刻度，振搖后以15 000 r·min－1離心，上清液用0.45μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 按處方比例和制備工藝分別制備不含紅花、不含肉蓯蓉、不含當(dāng)歸、不含丹參、不含淫羊藿、不含補(bǔ)骨脂的陰性樣品，再按照2.2.2項下方法分別制備陰性樣品溶液。

2.3 專屬性考察

取2.2項下混合對照品溶液、供試品溶液、6 種陰性樣品溶液各5μL，按照2.1項下的色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果見圖1。由圖1 可知，供試品色譜圖中在與對照品色譜圖上相對應(yīng)的位置有相同的色譜峰，且陰性樣品無干擾。

圖1 HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

依次精密吸取2.2.1項下的系列混合對照品溶液5μL注入高效液相色譜儀，按照2.1 項下的色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。分別以各成分的質(zhì)量濃度（μg·m L－1）為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y），進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，7種成分在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與其峰面積線性關(guān)系良好。

表1 回歸方程與線性范圍Tab.1 Regression equations and linear ranges

2.5 精密度實驗

精密吸取2.2.1 項下的同一混合對照品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，按照2.1 項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。計算得羥基紅花黃色素A、松果菊苷、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂 素 峰 面 積 的RSD 值 分 別 為0.94%、0.72%、1.02%、0.51%、1.10%、0.45%、0.68% （n＝6），表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗

取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣5μL，按照2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。計算得羥基紅花黃色素A、松果菊苷、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD 值 分 別 為1.20%、0.98%、1.41%、1.52%、0.84%、1.05%、0.95%，表明在24 h內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性實驗

取同一批益腎湯（批號20210318），平行精密量取6份，每份1 m L，按照2.2.2項下供試品溶液處理方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算羥基紅花黃色素A、松果菊苷、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量。計算得7種成分的含量平均值分別為35.7、234.5、45.2、138.1、50.6、49.1、45.0μg·mL－1，RSD值 分 別 為1.02%、1.13%、1.38%、0.85%、0.93%、0.62%、0.75% （n＝6），表明方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率實驗

取已知含量的益腎湯（批號20210318）樣品6份，每份精密量取0.5 m L，分別精密加入混合對照品溶液1 m L（羥基紅花黃色素A、松果菊苷、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的質(zhì)量濃度 分 別 為17.45、115.59、22.75、68.39、25.56、24.49、22.59μg·m L－1），按照2.2.2項下供試品溶液處理方法制備加樣供試品溶液，再按照2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算各成分的回收率。計算得羥基紅花黃色素A、松果菊苷、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的平均加樣回收率分別為99.20%（RSD＝0.61%）、96.25%（RSD＝2.63%）、98.53%（RSD＝1.18%）、96.98%（RSD＝2.10%）、96.90%（RSD＝1.81%）、98.78%（RSD＝1.09%）、98.65%（RSD＝1.00%）（n＝6）。

2.9 樣品的含量測定

取3批益腎湯，按照2.2.2項下供試品溶液處理方法制備供試品溶液，再按照2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，根據(jù)2.4項下得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算各成分的含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab.2 Results of content determination（n＝3）

3 討論

中藥湯劑是中醫(yī)臨床用藥最古老、最常用的劑型?！稖罕静荨分杏杏涊d“湯者，蕩也，去大病用之”。在治療新冠肺炎的處方中，最常用的肺炎1號、清肺排毒湯等經(jīng)臨床驗證有一定療效［9］，在新冠肺炎預(yù)防應(yīng)用中，共檢索到預(yù)防方102條，其中主要采用水煎劑（69種）或代茶飲（26種）口服方式［10］。益腎湯應(yīng)用于慢性腎炎證候者有較好的療效，前期曾用薄層色譜法對其個別成分進(jìn)行定性鑒別，但由于中藥制劑配方復(fù)雜、成分較多，僅進(jìn)行薄層鑒別難以保證質(zhì)量的均一性和可靠性，故本研究對其制劑中的7種有效成分進(jìn)行測定。

本實驗分別考察甲醇-1 m L·L－1磷酸溶液、乙腈-1 m L·L－1磷酸溶液和乙腈-水3種不同流動相系統(tǒng)，結(jié)果表明，以乙腈-1 m L·L－1磷酸溶液作為流動相時，各成分峰形較好，且分離效果良好，分析效率更高，更節(jié)約檢測時間和成本。在選擇檢測波長參數(shù)方面，參考目標(biāo)成分現(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)［11-20］，按不同時間段設(shè)置波長參數(shù)：0～10 min為403 nm（檢測羥基紅花黃色素A），10～16 min為330 nm（檢測松果菊苷），16～22 min為320 nm（檢測阿魏酸），22～30 min為286 nm（檢測丹酚酸B），30～34 min為270 nm（檢測淫羊藿苷），34～50 min為246 nm（檢測補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素），在此條件下各成分均有最大紫外吸收，以保證對各待測成分均能準(zhǔn)確定量。本研究采用HPLC法快速測定該制劑中羥基紅花黃色素A 等7種中藥有效成分的含量，方法簡便、可靠，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可為益腎湯的質(zhì)量控制提供參考。