宏基因組二代測序技術在兒童包裹性膿胸診療過程中的應用價值

楊燕霞，王 欣，李淑華，柳小平

(西北民族大學 甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030)

包裹性膿胸(Encapsulated Empyema)是因多種原因引起的胸膜腔被致病微生物入侵，在慢性期或機化期滲出的纖維素使得臟壁層胸膜增厚顯著，腔隙狹窄且膿液黏稠，即臟層胸膜和肺被機化的纖維素包裹[1].兒童因氣管支氣管較成人短而狹窄，血管豐富，軟骨柔軟，缺乏彈性支撐，纖毛運動弱而清除能力差，易發(fā)生呼吸道感染.此外,兒童輔助性T細胞暫時性低下，分泌性IgA、IgG含量低微，溶菌素、干擾素、補體數(shù)量和活性不足，使得患兒在基礎病基礎上并發(fā)包裹性膿胸[2].宏基因組的二代測序技術作為新興病原微生物快速檢測手段，具有高通量、測序迅速及覆蓋面廣的特點，在潛在病原體和特殊病原體檢測中發(fā)揮著重要作用[3].

1 資料和方法

1.1 研究對象

2019年1月至2020年12月間甘肅省第二人民醫(yī)院呼吸科和兒科收治的包裹性膿胸患兒.根據(jù)《臨床診療指南——胸外科分冊》(中華醫(yī)學會編著，人民衛(wèi)生出版社)標準，確定兒童包裹性膿胸依據(jù)：①患兒有發(fā)熱、胸痛、咳嗽、咳痰、氣短、食欲不振和全身不適等，伴有乏力、貧血、低蛋白血癥等.②體征：患側肋間隙狹窄，胸廓下陷，呼吸活動度減小，縱膈向患側移位，語音震顫減弱，聽診呼吸音減弱或消失，脊柱側彎，杵狀指.③影像學檢查：X線檢查可見胸腔積液引起的致密影，多成密度增強的毛玻璃狀模糊陰影，肋隔間模糊變鈍，縱膈患側移位，膈肌升高.④在X線定位和B超指引下進行胸腔穿刺，胸腔積液細菌圖片或細菌培養(yǎng)陽性.收集研究對象的一般人口學資料、臨床資料和影像學資料，48例確診為兒童包裹性膿胸患者，男22例、女19例，中位年齡5.0(0.7～14)歲.本研究得到甘肅省第二人民醫(yī)院科研倫理委員會批準.

1.2 方法

1.2.1 取樣

胸腔鏡下胸膜活檢：根據(jù)患兒情況選擇吸入麻醉、靜脈麻醉或靜吸復合麻醉;切口位置經(jīng)B超引導定位于包裹腔外病變相對輕且易進入胸腔的肋間為切口位置,避免直接進入包裹腔內影響手術視野清晰.對膿液腔部位進行活檢，取壁層胸膜、膈肌黏膜或病變組織.多部位取材，數(shù)量為6～10塊放置于樣品袋內[4].

1.2.2 mNGS檢測

在提取完成后，實驗室使用QubitTM熒光定量儀對核酸進行定量，使用NanoDropTM分光光度計檢測核酸純度，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸片段的完整性或降解程度[5].文庫制備過程包括DNA打斷、接頭連接、PCR擴增等過程.在文庫制備完成，測序之前，采用QubitTM熒光定量儀對文庫進行定量，采用Agilent 2100 Bioanalyzer對文庫片段大小進行質控.質控合格數(shù)據(jù)需要通過生物信息學分析方法進一步過濾，去除低質量的序列和人源宿主序列[6].經(jīng)過上述過濾后的序列與病原數(shù)據(jù)庫中的參考序列進行比對，得到最終病原比對結果，包括病原體的比對序列數(shù)、相對豐度、基因組覆蓋度和深度等參數(shù)(其中檢出序列數(shù)：比對過程中，如果一條序列只能唯一精確比對至單一基因組，定義該序列為特異性序列[7].基因組覆蓋度：檢出序列覆蓋到的基因組長度占物種基因組總長度的比例[8]).mNGS檢測的陽性標準：①對于分枝桿菌和嗜肺軍團菌、真菌、支原體、病毒和寄生蟲，mNGS檢測到的菌種特異性序列數(shù)≥1為陽性.②對于細菌(不包括分枝桿菌和嗜肺軍團菌)，mNGS檢測到的特異性序列數(shù)≥3為陽性[9].

1.2.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 mNGS檢測兒童包裹性膿胸的感染病原微生物組成

注：(a)感染病原微生物種類比例；(b)混合感染中各細菌比例；(c)混合感染中各病毒比例；(d)其他

將收集的48例患兒包裹性膿胸進行mNGS檢測，結果所示：如圖1(a)所示，由單一細菌引起的有6例(14.63%)，由單一真菌引起的有2例(4.88%)，由單一病毒引起的有5例(12.20%).混合感染的有28例(68.29%)，混合感染中病原菌有9例，細菌-病毒型有12例，細菌-真菌型2例，病毒-真菌型2例，病毒-病毒型3例.如圖1(b)所示，混合感染中各細菌比例：肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌為20.93%，糞腸球菌、嗜肺軍團菌為13.95%(肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌為20.93%、糞腸球菌、嗜肺軍團菌為13.95%).如圖1(c)所示,混合感染中各病毒比例：人類皰疹病毒比例61.90%、為最高，人腺病毒和EB 病毒為14.29%.如圖1(c)所示,其他感染病原體中耶氏肺孢子菌及念珠菌感染比例較高，分別為50.0%和33.33%，黃曲霉菌為8.33%，鸚鵡熱衣原體為8.33%(比例最低).

2.2 兒童包裹性膿胸感染病原微生物和可疑病原微生物的基因覆蓋度梯度

如表1所示，利用mNGS檢測48例包裹性膿胸的患兒感染病原體和可疑病原體，其基因覆蓋度結果顯示：細菌種屬中肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌、鮑氏不動桿菌和結核分支桿菌的基因組覆蓋度相對較高(P<0.05)；病毒種屬中人類皰疹病毒、EB病毒、小細環(huán)病毒基因組覆蓋度相對較高(P<0.05)；黃曲霉菌、耶氏肺孢子菌、念珠菌、鸚鵡熱衣原體基因組覆蓋度也相對較高(P<0.05).

表1 mNGS檢測出感染病原體和可疑病原體的基因覆蓋度梯度

2.3 mNGS樣本陽性影響因素分析

如表2所示，48例包裹性膿胸患兒的mNGS樣本以臨床參考正常值作為標準，按照性別、年齡、白細胞數(shù)量、C反應蛋白含量(CRP)、降鈣素原含量(PCT)、淋巴細胞比例以及中性粒細胞比例進行影響因素分組，結果顯示以上因素均不會對患兒mNGS感染性病原體檢出造成影響(P>0.05).

表2 mNGS樣本陽性影響因素的單因素分析

3 討論

本研究以48例包裹性膿胸患兒為研究對象，利用宏基因二代測序技術對胸腔鏡下所得的樣本進行檢測分析，得出病原體的比對序列數(shù)、相對豐度、基因組覆蓋度和深度等相關參數(shù)，獲得了兒童包裹性膿胸感染病原微生物的組成特點，不同病原體感染常見菌株或毒株種屬以及類型.根據(jù)病例資料統(tǒng)計與分析發(fā)現(xiàn)，患兒年齡、性別以及血液檢查指標均對mNGS檢測結果的陽性檢出率沒有影響.由此可以說明,宏基因二代測序技術在診治兒童包裹性膿胸優(yōu)勢凸顯：①高效性：宏基因組測序技術不依賴于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)，無需特異性擴增，速度快、靈敏度高，對于新發(fā)現(xiàn)致病微生物、耐藥病原微生物所致包裹性膿胸病例有較高的檢出率；②精確度高，無偏倚：樣本數(shù)據(jù)經(jīng)過質控以及生物信息學分析，去除低質量序列和人源宿主序列，排除了不同病原體定植競爭生存干擾的影響，使得感染病原體的分類分型更加精確.③覆蓋面廣，適用性強：檢出序列數(shù)低的可疑病原體、環(huán)境中常見的機會致病菌、常見院內感染菌以及具有可致病性的人體定植菌等可輔助臨床醫(yī)生規(guī)范用藥和調整治療方案，能有效針對兒童這一特殊人群采取正確的醫(yī)療措施.

隨著檢測感染病原體宏基因組二代測序技術普及，2020年11月15日發(fā)布了《中國宏基因組學第二代測序技術檢測感染病原體的臨床應用專家共識》，建立了中國感染病原體宏基因組學檢測的標準規(guī)范[10].本文依據(jù)上述共識的專家意見，從臨床應用范圍、樣本采集、分析解讀和診斷效能等方面對兒童包裹性膿胸進行探究，旨在探究兒童包裹性膿胸的發(fā)病特點和感染病原微生物特征，以求指導臨床實踐.

3.1 根據(jù)包裹性膿胸的疾病特征選擇mNGS樣本種類和方法

胸膜是覆蓋在胸膜腔內表面的一層薄膜，由結締組織和纖維彈力組織支持的間皮細胞層組成.小兒發(fā)生膿胸時，膿液白細胞增多，纖維蛋白附著于胸膜形成纖維板，分隔膿腔成多房狀，如果僅通過單純穿刺引流并不能徹底清除病灶內黏稠膿液，纖維板機化會形成包裹性膿胸，反復感染，影響小兒呼吸功能[11].因此在兒童包裹性膿胸的mNGS樣本選擇時可以考慮患兒排出的痰液、血液、胸腔積液、病灶組織、支氣管肺泡灌洗液甚至嚴重感染侵及腦部的腦脊液.但通過既往研究查閱，如DUAN，H X等人[12]利用宏基因測序技術和傳統(tǒng)檢測方法對收集的109例患者支氣管肺泡灌洗液、痰液、胸腔液以及腦脊液樣本進行分組比較發(fā)現(xiàn)，mNGS的敏感性比傳統(tǒng)檢測方法高，尤其在血液，支氣管肺泡灌洗液和痰液樣本中，mNGS陽性感染病原體的拷貝濃度與疾病的嚴重程度，住院天數(shù)和死亡率密切相關.LI，H N等人[13]采用mNGS檢測肺活檢組織的感染病原體分別與組織病理學方法和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法進行對比，發(fā)現(xiàn)mNGS在檢測肺活檢組織樣本感染病原體細菌的靈敏性高于傳統(tǒng)培養(yǎng)，在檢測真菌靈敏性方面優(yōu)于組織病理學.結合臨床內科，采用胸腔鏡方法取活檢組織，最終樣本類型選擇病灶組織(包含膿液和血液).

3.2 通過mNGS檢測分析兒童包裹性膿胸感染病原體特點

目前研究表明，mNGS檢測的靈敏性明顯優(yōu)于傳統(tǒng)病原檢測，特別對混合病原體感染情況，如FANG，X W等人[14]通過對收集的72例呼吸機相關性肺炎患者支氣管肺泡灌洗液的mNGS和常規(guī)檢測進行分析發(fā)現(xiàn)，mNGS陽性樣本檢出率明顯高于常規(guī)檢測，且在病毒和細菌混合感染檢測方面顯示出明顯優(yōu)勢.WANG，J H等人[15]通過mNGS和常規(guī)檢測分析鑒定了55例肺部感染病例，其中36例為混合感染，并按照混合感染中最常見的病原體優(yōu)化了肺部真菌感染的診斷指標.本研究結果顯示，兒童包裹性膿胸感染病原體復雜，其中由單一細菌引起的有6例(14.63%)，由單一真菌引起的有2例(4.88%)，由單一病毒引起的有5例(12.20%).混合感染的有28例(68.29%)，混合感染中病原菌感染9例，細菌-病毒型感染12例，細菌-真菌型感染2例，病毒-真菌型感染2例，病毒-病毒型感染3例.

3.3 兒童包裹性膿胸常見病原體和特殊病原體mNGS高效檢出性

宏基因組二代檢測技術基于Illumina測序平臺的高通量測序[16]，通過微生物專用數(shù)據(jù)庫進行比對分析，經(jīng)過智能化算法獲得致病微生物種屬信息，鑒定樣本中存在的致病微生物.可檢測范圍包括基因組序列中已知的細菌、病毒、真菌、寄生蟲.LIU，X等人[17]通過對疑似和確診的311名肺結核病人進行mNGS、半巢式全自動實時熒光定量PCR檢測(Xpert MTB/RIF)和培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，mNGS、Xpert和培養(yǎng)物在結核分枝桿菌復合體和其他病原體完全匹配度比例很高，說明基于傳統(tǒng)檢測方法綜合mNGS可以高質量地增加結核分枝桿菌復合體的檢出率.本研究通過48例患兒感染病原體和可疑病原體的基因覆蓋度分析得出：細菌種屬中以肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌、鮑氏不動桿菌和結核分支桿菌檢出效能最高；病毒種屬中人類皰疹病毒、EB病毒、小細環(huán)病毒檢出效能最高；黃曲霉菌、耶氏肺孢子菌、念珠菌、鸚鵡熱衣原體等特殊病原體檢出效能最高，這給兒童包裹性膿胸的早期經(jīng)驗性用藥提供了臨床參考資料，有利于幫助制定臨床治療策略和調整治療計劃.

3.4 兒童包裹性膿胸病例特征對mNGS檢出率影響分析

既往研究發(fā)現(xiàn)，兒童相關感染病原體檢出率會受病例的發(fā)熱情況、住院時間、血液檢測指標、用藥情況等因素影響.HUANG，H等人[18]通過對75例小兒腺病毒性肺炎進行mNGS檢測發(fā)現(xiàn)，腺病毒7型引起的小兒重癥腺病毒性肺炎死亡率最高，其中患兒的發(fā)熱時長、白介素-1含量、氧合指數(shù)、乳酸脫氫酶含量等均能對檢出陽性率造成影響.但本研究通過對患兒病例資料相關指標統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，在兒童包裹性膿胸病例特征中，患兒年齡、性別血清學相關指標均不是mNGS檢出陽性率的獨立影響因素.

4 本研究偏差解釋、不足之處和深入探究設想

1)根據(jù)《中國宏基因組學第二代測序技術檢測感染病原體的臨床應用專家共識》，對于呼吸道感染者，若3天內未通過傳統(tǒng)實驗室檢查獲得明確的病原學依據(jù)且經(jīng)驗性抗感染治療無效，推薦進行宏基因組二代測序.本研究搜集病例資料時沒有收集是否采取經(jīng)驗性用藥資料，也未對抗生素是否可作為影響因素進行探究[19].由于本研究病例樣本量收集較為困難，在今后工作中還應進行大樣本驗證研究.

2)48例包裹性膿胸病例資料中以血液病為原發(fā)病的患兒有9例，以重癥肺炎為原發(fā)病的患兒有22例，以肺部感染為原發(fā)病的患兒有10例，以不明原因出現(xiàn)肺部陰影的患兒7例.進行mNGS陽性樣本影響因素分析以及感染病原體和可疑病原體基因覆蓋度檢測時會因原發(fā)病的特點而造成統(tǒng)計資料出現(xiàn)偏倚，因此在后續(xù)病例數(shù)據(jù)收集整理時可進行分組，從而探究不同原發(fā)病對于該疾病感染病原體的影響.分析討論宏基因組二代測序技術對兒童包裹性膿胸診療有較高的應用價值，有待研究者進行更深入研究和挖掘.