蛋白質(zhì)水解物類(lèi)植物生物刺激劑簡(jiǎn)介

申繼忠，余武秀

(上海艾農(nóng)國(guó)際貿(mào)易有限公司，上海 200122)

1 植物生物刺激劑的定義和類(lèi)別

歐洲生物刺激劑工業(yè)委員會(huì)(EBIC)最早給出了生物刺激劑的定義。美國(guó)2018年12月頒布的農(nóng)業(yè)法案(2018 Farm Bill)也給出了植物生物刺激劑的定義，Ute Albrecht認(rèn)為該定義與歐洲生物刺激劑工業(yè)委員會(huì)的定義基本一致[1]。根據(jù)此定義，生物刺激劑有2大類(lèi)，一類(lèi)是基于微生物的產(chǎn)品，另一類(lèi)是基于非微生物類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)品。非微生物類(lèi)生物刺激劑產(chǎn)品很多，包括以下幾大類(lèi)：腐殖酸類(lèi)、海藻提取物及其他植物物質(zhì)、幾丁質(zhì)和殼聚糖及其他聚合物、蛋白質(zhì)水解物及其他含氮物質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽(如硅和鈷)、復(fù)雜有機(jī)復(fù)合物等[1,2]。生物刺激劑的功效表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：提高水分利用率、提高養(yǎng)分利用率、促進(jìn)根結(jié)構(gòu)的發(fā)育和生長(zhǎng)、增強(qiáng)抗病能力、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性產(chǎn)生、提高植物抗脅迫能力等。

2 蛋白質(zhì)水解物類(lèi)生物刺激劑

Giuseppe Colla等充分討論了蛋白質(zhì)水解物的生產(chǎn)工藝及其對(duì)水解物組成的影響，以及動(dòng)物源和植物源蛋白質(zhì)水解物的優(yōu)缺點(diǎn)等[3]。

蛋白質(zhì)水解物的種類(lèi)可以根據(jù)來(lái)源和生產(chǎn)方法予以分類(lèi)(表1)[3]。

表1 蛋白質(zhì)水解物的分類(lèi)

生產(chǎn)工藝及蛋白質(zhì)來(lái)源對(duì)蛋白質(zhì)水解物的化學(xué)特性影響很大。蛋白質(zhì)在酸性或堿性條件下的化學(xué)水解通常是生產(chǎn)動(dòng)物性蛋白質(zhì)水解物的首選方法。酸水解是在高溫(＞121 ℃)和高壓(＞220.6 kPa)下進(jìn)行的激烈反應(yīng)。在酸水解中，主要使用鹽酸和硫酸水解蛋白質(zhì)，最常用的是鹽酸。堿性水解是一個(gè)相當(dāng)簡(jiǎn)單和直接的過(guò)程，蛋白質(zhì)在加熱條件下溶解，然后添加堿性物如氫氧化鈣、鈉或鉀，并將溫度保持在一個(gè)理想的設(shè)定值?；瘜W(xué)水解可以破壞蛋白質(zhì)的所有肽鍵，因此蛋白質(zhì)水解程度較高，游離氨基含量也高，某些氨基酸會(huì)被破壞(例如，色氨酸通常被酸水解完全破壞；部分半胱氨酸、絲氨酸和蘇氨酸會(huì)丟失；天冬氨酸和谷氨酰胺可通過(guò)酸水解轉(zhuǎn)化為它的酸性形式)。

此外，其他有用的耐熱化合物(如維生素)也大部分在化學(xué)水解過(guò)程中被破壞?；瘜W(xué)水解的另一個(gè)關(guān)鍵方面是把游離氨基從L-型轉(zhuǎn)化成D-型(外消旋作用)。由于生物體內(nèi)蛋白質(zhì)中的氨基酸都是以L(fǎng)-型存在的，因此植物在代謝過(guò)程中不能直接利用D-型氨基酸，故化學(xué)水解的蛋白質(zhì)水解物將減效，甚至對(duì)植物構(gòu)成潛在毒性。最后，大量使用酸/堿水解導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解物的鹽度增加。

酶法水解通常用于生產(chǎn)植物蛋白質(zhì)水解物。酶法水解是通過(guò)源自動(dòng)物器官(如胰酶、胃蛋白酶)或植物(如木瓜蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶)或微生物(如堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶)等各種蛋白水解酶進(jìn)行的。蛋白水解酶水解過(guò)程比酸/堿水解溫和，不需要高溫(＜60 ℃)，通常針對(duì)特定的目標(biāo)肽鍵發(fā)生作用(例如，胃蛋白酶切斷含有苯丙氨酸或亮氨酸鍵的氨基酸鏈；木瓜蛋白酶切斷與精氨酸、賴(lài)氨酸和苯丙氨酸相鄰的鏈；胰酶則在有精氨酸、賴(lài)氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸的地方切斷氨基酸鏈)。酶解所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)水解物是一種含有不同長(zhǎng)度的氨基酸和肽的混合物，含鹽度較低，其組成不隨時(shí)間而變化。

由上可知，通過(guò)不同的生產(chǎn)方法獲得的蛋白質(zhì)水解物中，氨基酸含量、肽的含量和分子量分布會(huì)有很大不同。

除了氨基酸和肽外，蛋白質(zhì)水解物還含有其他能起到生物刺激作用的化合物，包括脂肪、碳水化合物、酚類(lèi)、礦物元素、植物激素和其他有機(jī)化合物(如多胺)。例如，在基于紫花苜蓿的蛋白質(zhì)水解物中發(fā)現(xiàn)有兩種植物激素(即吲哚乙酸和異戊烯腺苷)，在紫花苜蓿衍生蛋白質(zhì)水解物中發(fā)現(xiàn)有一種刺激植物生長(zhǎng)的脂肪醇，即三十烷醇。此外，植物性蛋白質(zhì)水解物含有在能量代謝和氧化應(yīng)激防御中起重要作用的可溶性碳水化合物以及酚類(lèi)物質(zhì)。相比之下，動(dòng)物性蛋白質(zhì)水解物則缺乏碳水化合物、酚和植物激素。礦物含量也受蛋白質(zhì)來(lái)源的影響，通常植物來(lái)源的蛋白質(zhì)水解物含有更多的礦物質(zhì)，肉粉的蛋白質(zhì)水解物中存在大量的鈉，在植物源蛋白質(zhì)水解物中有很高水平的鎂、錳、鐵和鋅等營(yíng)養(yǎng)成分，由皮革作為原材料生產(chǎn)的蛋白質(zhì)水解物可能含有重金屬鉻，它作為污染物受到特別關(guān)注。

不同來(lái)源和不同生產(chǎn)方法獲得的蛋白質(zhì)水解物化學(xué)特性的異同點(diǎn)見(jiàn)表2[4]。

表2 基于不同來(lái)源蛋白和不同生產(chǎn)方法獲得的蛋白質(zhì)水解物化學(xué)特性

3 氨基酸和肽對(duì)植物的重要性

近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)植物氮代謝的許多過(guò)程和代謝途徑明顯受到全部或幾種氨基酸和酰胺濃度的調(diào)控。氨基酸和酰胺在硝酸鹽和銨態(tài)氮吸收、硝態(tài)氮還原、銨態(tài)氮摻入、蛋白質(zhì)代謝和氮再動(dòng)員中起重要作用。研究表明，游離氨基酸的濃度與植物的氮素狀態(tài)有關(guān)，游離氨基酸可能參與了植物生長(zhǎng)和氮素代謝的調(diào)控[5]。

氨基酸對(duì)植物的抗脅迫能力也有積極影響。受脅迫的植物表現(xiàn)出脯氨酸和其他氨基酸的積累，被積累的氨基酸所起的作用有：作為滲透物、調(diào)節(jié)離子運(yùn)輸、調(diào)控氣孔開(kāi)放和解毒重金屬。氨基酸也影響某些酶的合成和活性、基因表達(dá)和氧化還原平衡[6]。

蛋白質(zhì)水解物對(duì)植物非生物脅迫有改善作用。非生物脅迫對(duì)作物生產(chǎn)產(chǎn)生不利影響，導(dǎo)致其產(chǎn)量下降。在不同的非生物脅迫中，干旱是最重要的一種，因?yàn)橛邢薜乃止?yīng)對(duì)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育有負(fù)面影響。Silvana Francesca等研究番茄在有限水分供應(yīng)下，生物刺激素與關(guān)鍵生理反應(yīng)機(jī)制之間的相互作用，并為提高番茄在干旱脅迫下的性能制定策略。采用一種新型蛋白質(zhì)水解生物刺激劑(商品名CycoFlow，意大利Agriges公司)，研究了在最優(yōu)條件(100%灌溉)和有限水分供應(yīng)(50%灌溉)條件下生長(zhǎng)的番茄(基因型E42)的生理反應(yīng)。與未處理相比，經(jīng)水解蛋白處理的植株在干旱脅迫下表現(xiàn)出更好的水分狀況和花粉活力，產(chǎn)量也更高。生物刺激素處理對(duì)葉片和果實(shí)中抗氧化物質(zhì)的含量和活性也有影響。這些研究結(jié)果表明，蛋白質(zhì)水解物應(yīng)用在有限水分供應(yīng)時(shí)能夠改善植株的性能[7]。

氨基酸是所有生物合成蛋白質(zhì)的重要組成部分，在植物中，游離的“蛋白質(zhì)源”氨基酸在氮的同化和運(yùn)輸中起著補(bǔ)充的作用，是信號(hào)化合物、滲透劑以及制造各種激素、輔助因子和其他主要化合物(如葉綠素)的前體。植物還利用氨基酸的集體作用產(chǎn)生數(shù)千種特殊化合物，促進(jìn)生態(tài)相互作用，并對(duì)環(huán)境脅迫作出適應(yīng)性反應(yīng)。

植物中的氨基酸也可以聚合成小肽，通常由 5到60個(gè)氨基酸組成。某些小肽在植物生長(zhǎng)和發(fā)育中起類(lèi)似激素的作用。另一些則在傷口、病原體感染、營(yíng)養(yǎng)失衡、干旱或高鹽度下發(fā)揮作用。

20世紀(jì)80年代和90年代，通過(guò)從各種植物組織中分離出的膜泡進(jìn)行吸收測(cè)定，開(kāi)始了對(duì)氨基酸和多肽吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的生化過(guò)程研究。利用放射性標(biāo)記底物和熒光標(biāo)記方法，揭示了多種氨基酸和肽轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的發(fā)生。從那時(shí)起，在非菌根植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)了至少12個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)體家族的成員。還有研究揭示了轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在土壤氨基酸攝取、進(jìn)出細(xì)胞和/或植物維管系統(tǒng)長(zhǎng)途運(yùn)輸中的作用[8,9]。

氨基酸在植物中的作用非常之多，各種作用正在不斷被發(fā)現(xiàn)。目前已知的最重要作用有[10]：⑴ 提高葉綠素產(chǎn)量；⑵ 提供豐富的有機(jī)氮來(lái)源；⑶ 刺激維生素的合成；⑷ 影響許多酶系統(tǒng)；⑸ 刺激開(kāi)花；⑹ 促進(jìn)果實(shí)的形成；⑺ 提高產(chǎn)量，改善果實(shí)的味道、大小和顏色；⑻ 提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量；⑼ 增強(qiáng)植物抗性。

肽是由 2～50個(gè)氨基酸通過(guò)肽鍵連接而成的分子。超過(guò)50個(gè)氨基酸組成的分子稱(chēng)為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的水解不僅能釋放氨基酸，還能釋放因水解程度不同而含量不同的可溶性肽。軟水解，如酶水解，比化學(xué)水解產(chǎn)生更多的肽。

肽作為信號(hào)分子在植物生理中起著重要的作用，能調(diào)節(jié)植物防御機(jī)制以對(duì)脅迫、生長(zhǎng)和發(fā)育做出反應(yīng)。肽分子在細(xì)胞膜層面起激活植物特定代謝作用[4]。

生物活性肽在農(nóng)業(yè)上具有廣泛的應(yīng)用前景，作為有效的營(yíng)養(yǎng)和藥劑用途已被充分證明，但在解決生物和非生物脅迫、植物病害控制和營(yíng)養(yǎng)利用效率等農(nóng)業(yè)應(yīng)用方面尚未受到太多關(guān)注。生物活性肽能夠增強(qiáng)植物根際分子信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)結(jié)瘤、營(yíng)養(yǎng)吸收和脅迫管理，可與農(nóng)藥配制，并在葉片處理中通過(guò)葉片系統(tǒng)吸收，以實(shí)現(xiàn)廣泛的植物效益，包括著色、干旱條件下的營(yíng)養(yǎng)傳遞、植物健康和作物保護(hù)等[11]。

4 蛋白質(zhì)水解物類(lèi)刺激劑的功效

蛋白質(zhì)水解物可影響植物的生長(zhǎng)、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)利用、對(duì)非生物脅迫的耐受性以及植物的根際微生物群落。蛋白質(zhì)水解物產(chǎn)品之所以具有這些功效，是因?yàn)槠浜猩L(zhǎng)刺激肽和氨基酸，而所含氨基酸是一些植物激素的代謝前體(例如色氨酸是吲哚乙酸的前體，精氨酸是多胺的前體)。蛋白質(zhì)水解物對(duì)植物氮營(yíng)養(yǎng)也有積極影響，因?yàn)榘被岷碗闹械挠袡C(jī)氮可以作為植物氮的直接來(lái)源，它們可被快速吸收、同化和轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部分。然而，這些氮的使用濃度很低，使用目的不是向作物提供大量的氮素。

蛋白質(zhì)水解物對(duì)植物營(yíng)養(yǎng)的積極作用還體現(xiàn)在氨基酸和肽能夠復(fù)合礦物質(zhì)，提高礦物質(zhì)的溶解度，從而提升其可利用度。蛋白質(zhì)水解物特別有利于提高鐵、錳、鋅等微量元素在堿性環(huán)境中的生物有效性。

蛋白質(zhì)水解物還可以通過(guò)激活參與營(yíng)養(yǎng)吸收的特定根酶來(lái)改善作物營(yíng)養(yǎng)。例如，在根和葉面施用植物源蛋白質(zhì)水解物可以提升番茄根鐵螯合還原酶活性，從而在堿性脅迫條件下增加植物對(duì)鐵的吸收。但是使用動(dòng)物源的蛋白質(zhì)水解物對(duì)鐵螯合還原酶活性的影響則較小。

蛋白質(zhì)水解物除了能促進(jìn)養(yǎng)分的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和積累外，還能提高作物對(duì)非生物脅迫的耐受性，如不適宜的溫度和濕度脅迫、鹽度、干旱和弱光條件等。例如，萵苣對(duì)低溫的耐受性可因?yàn)槿~面施用蛋白質(zhì)水解物而提高。蛋白質(zhì)水解物提高植物對(duì)非生物脅迫耐受性的積極作用歸因于根系生長(zhǎng)更好、根莖比更高、植株?duì)I養(yǎng)狀況更好、較高的細(xì)胞膜穩(wěn)定性、滲透物(如脯氨酸)和抗氧化劑的積累。

蛋白質(zhì)水解物可以增加水果的品質(zhì)，許多氨基酸如丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸是芳香化合物的前體，苯丙氨酸是花青素生物合成的前體，精氨酸、丙氨酸、甘氨酸和脯氨酸是風(fēng)味的前體物質(zhì)。

根部使用蛋白質(zhì)水解物還能刺激土壤微生物的生長(zhǎng)，改變微生物區(qū)系，有助于提高土壤的整體生物肥力[4,12]。

Christoph Stephan Schmidt等通過(guò)盆栽試驗(yàn)，比較了一種新型雞毛水解物(FH)和一種參考蛋白質(zhì)水解物(RH)對(duì)大麥和小麥的生物刺激作用，研究了它們與叢枝菌根真菌(AMF)和磷的交互作用。結(jié)果表明所有試驗(yàn)因素都影響大麥生長(zhǎng)，其中 FH增加大麥的莖高和生物量，RH降低莖高和生物量，AMF降低高磷供應(yīng)下大麥的生物量。在小麥中，AMF處理組的生物量略有降低，而其他因子對(duì)生物量的影響不顯著。在田間平行試驗(yàn)中，RH和FH對(duì)大麥產(chǎn)量和籽粒大小均有提高作用，而2種水解液對(duì)小麥均無(wú)顯著影響。施用時(shí)間對(duì)水解液效果無(wú)影響。兩種酶解物在盆栽試驗(yàn)中均能增加大麥網(wǎng)斑病的嚴(yán)重程度，而在田間試驗(yàn)中則能降低網(wǎng)斑病的嚴(yán)重程度。FH促進(jìn)了低磷條件下AMF在小麥根系的定殖。研究結(jié)果表明盆栽測(cè)試結(jié)果在田間條件下的可轉(zhuǎn)移性有限，并顯示了水解產(chǎn)物、土壤磷、植物共生物和病原體之間復(fù)雜的相互作用[13]。

為了滿(mǎn)足人們對(duì)綠色蔬菜日益增加的需求，種植者在高能量投入下種植葉菜作物，尤其是施用高劑量的氮肥。氮肥的過(guò)量使用會(huì)導(dǎo)致硝酸鹽在植物葉片中積累，有時(shí)甚至超過(guò)了歐洲設(shè)置的最高限量。葉片中的硝酸鹽可能對(duì)人體健康有害，因?yàn)樵谌梭w內(nèi)它可以轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，這會(huì)導(dǎo)致高鐵血紅蛋白血癥或產(chǎn)生致癌化合物。為了克服這一問(wèn)題，需要正確的氮素管理，特別是采用提高氮素利用效率的技術(shù)手段。Mola(2020)評(píng)估了 2種重要的植物生物刺激劑對(duì)溫室中小葉萵苣產(chǎn)量和品質(zhì)性狀(硝酸鹽、抗氧化劑活性和類(lèi)胡蘿卜素)的影響。施氮量分別為0、10 (次優(yōu))和20 (最優(yōu)) kg/hm2，所用生物刺激劑為海藻提取物“Ecklonia Maxima”(3 mL/L)以及豆科植物蛋白質(zhì)水解物，并設(shè)未經(jīng)處理的對(duì)照。海藻提取物和豆科植物源蛋白質(zhì)水解物的應(yīng)用提高了產(chǎn)量和葉面積指數(shù)(LAI)，比未處理的植物分別提高了13.4%和12.0%；20 kg/hm2氮處理的產(chǎn)量最高。葉面生物刺激素刺激植物抗氧化系統(tǒng)，改善葉片顏色，提高葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量。在較高施氮水平下，葉片中硝態(tài)氮含量增加，在20 kg/hm2氮處理下硝態(tài)氮達(dá)到歐洲法定限量。因此，在試驗(yàn)條件下，可以通過(guò)增加施用生物刺激素來(lái)減少氮肥施用量并盡可能降低產(chǎn)量損失[15]。

Gianluca Caruso等在意大利南部評(píng)估了2種植物生物刺激劑(豆科植物蛋白質(zhì)水解物，Trainer?；熱帶植物提取物，Auxym?)對(duì)細(xì)葉二行芥的影響。在3個(gè)作物周期(秋-冬、冬、冬-春)對(duì)葉片產(chǎn)量、光合作用和色澤狀況、品質(zhì)、元素組成、抗氧化劑含量和活性的影響進(jìn)行評(píng)價(jià)。這兩種生物刺激劑能促進(jìn)多年生二行芥生長(zhǎng)和生產(chǎn)力，冬-春周期的葉片產(chǎn)量高于冬期；能提高葉片干物質(zhì)、草酸、檸檬酸、鈣、磷、酚類(lèi)物質(zhì)和抗壞血酸含量及抗氧化活性，但沒(méi)有增加硝酸鹽的含量，冬-春周期誘導(dǎo)的抗氧化活性和各物質(zhì)含量均高于冬期；這些主要是跟這 2種生物刺激劑含有的氨基酸和可溶性多肽相關(guān)，盡管Auxym?也含有少量的植物激素和維生素。另外，這2種植物生物刺激劑都能提高蔬菜產(chǎn)量、營(yíng)養(yǎng)和功能品質(zhì)，提高作物產(chǎn)量的機(jī)制可能是因?yàn)樘岣吡说V物質(zhì)養(yǎng)分的有效性和吸收[16]。

5 蛋白質(zhì)水解物生物刺激劑商業(yè)化及應(yīng)用

Moses Madende和Maria Hayes收集整理了一些商業(yè)化蛋白質(zhì)水解物制劑及其蛋白質(zhì)來(lái)源、有效成分、使用方法、應(yīng)用作物和功效(表3)。從表3可以看出，這些產(chǎn)品來(lái)自植物、動(dòng)物或微生物，其主要成分是氨基酸和肽，還有些產(chǎn)品含有激素和礦物元素，它們多被應(yīng)用在蔬菜和水果等高附加值作物上[17]。

表3 商業(yè)化的生物刺激劑及其組成和使用策略

美國(guó)FBN公司推出的植物蛋白質(zhì)水解物刺激劑產(chǎn)品，聲稱(chēng)含有18種氨基酸[18]，產(chǎn)品有效成分以氨基酸和肽計(jì)為31%，含有機(jī)氮5.0%，有機(jī)質(zhì)總含量35.5%，含可溶性肽形式的氨基酸，游離氨基酸含量少于4%，并聲稱(chēng)可用于所有作物(表4)。

表4 生物刺激劑ATARRUS中的氨基酸譜(各種氨基酸所占百分比例)

意大利ILSA S.p.A.公司生產(chǎn)的蛋白質(zhì)水解物刺激劑產(chǎn)品APR?，在水培條件下將該產(chǎn)品應(yīng)用于玉米苗，觀(guān)察對(duì)照組和3種不同脅迫(缺氧、鹽和營(yíng)養(yǎng)缺乏)及其組合的條件下玉米苗的變化。結(jié)果表明，APR?是可溶性的，能夠影響根和莖的生長(zhǎng)，影響程度與刺激劑的使用濃度有關(guān)。此外，APR?的有效性在單個(gè)脅迫或組合脅迫條件下明顯提高，從而證實(shí)了先前假設(shè)的該產(chǎn)品對(duì)環(huán)境逆境有抵抗能力。此外，它還調(diào)節(jié)參與硝酸鹽運(yùn)輸和活性氧(ROS)代謝的一組基因的轉(zhuǎn)錄[19]。

蛋白質(zhì)水解物可以施用于根或葉面，其用量為1.5～5 L/hm2。一般建議低濃度多次使用，不建議高濃度臨時(shí)使用。苗期使用蛋白質(zhì)水解物對(duì)幼苗生長(zhǎng)有較快的促進(jìn)作用，還能促進(jìn)根的生長(zhǎng)和植株的快速定植，在生長(zhǎng)旺盛的時(shí)期通過(guò)根和葉面施用則可以加強(qiáng)光合作用，從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)和養(yǎng)分利用效率。特別重要的是，在生產(chǎn)階段通過(guò)葉面使用蛋白質(zhì)水解物可以提高水果和蔬菜的質(zhì)量以及食用產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。在不利的環(huán)境條件下，建議用蛋白質(zhì)水解物進(jìn)行預(yù)防處理，以增強(qiáng)植物對(duì)非生物脅迫的耐受性(例如積累滲透物和次生代謝物)[4]。