黃瓜白粉病拮抗放線菌的篩選、鑒定及活性評價(jià)

王海利，張曉慷，王瀅秀，蔣愛忠，韓金濤，左伯軍，張新剛

(山東省農(nóng)藥科學(xué)研究院，濟(jì)南 250000)

白粉病(Sphaerotheca fuliginea)是黃瓜在大棚栽培過程中常見的病害之一，直接影響黃瓜葉片的光合作用，在黃瓜生長后期發(fā)生嚴(yán)重時(shí)引起產(chǎn)量損失50%以上，甚至絕產(chǎn)[1]。當(dāng)前，白粉病主要依靠化學(xué)殺菌劑來防治，其已對多種藥劑產(chǎn)生不同程度的抗藥性，且發(fā)展速度極快。因此，尋求高效、安全及環(huán)境友好的生物防治藥劑已成為國內(nèi)外黃瓜白粉病防治研究的新趨勢[2]。

放線菌廣泛分布于自然界中，能產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物，其中許多活性物質(zhì)對細(xì)菌和真菌性病害具有較好的防治效果，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域[3]。由于其具有生產(chǎn)工藝簡單、原料不具腐蝕性、設(shè)備安全耐用、幾乎不產(chǎn)生污水等優(yōu)點(diǎn)，因此對于保障人們的生命與健康和保護(hù)生態(tài)環(huán)境都十分重要，并將極大地增強(qiáng)我國農(nóng)產(chǎn)品的國際競爭力[4]。

本試驗(yàn)旨在通過對黃瓜根際土壤放線菌株的分離、純化、鑒定和活性篩選，發(fā)掘?qū)项惏追鄄》佬л^好的菌株，以期為下一步田間藥效試驗(yàn)評價(jià)和開發(fā)出生產(chǎn)上具有較好競爭力的產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器和試劑

ZWY-2112B搖床(上海智誠分析儀器制造有限公司)；SPX-150B-Z型恒溫震蕩培養(yǎng)箱、SW-CJ-1FD潔凈工作臺、YXQ-LS-50S11高壓蒸汽滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；TD5M離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；C22-RT22E01美的電磁爐(美的集團(tuán))；KDM型1升電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)；HZT-A2000電子秤(華志電子科技有限公司)。

葡萄糖、可溶性淀粉(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、酵母膏、瓊脂(分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；NaCl、KH2PO4、K2HPO4、KNO3、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 供試作物

黃瓜(Cucumis sativusL.)，易感病品種名稱為寶楊5號，購自于上海市種子市場。

1.2.2 供試致病真菌

黃瓜白粉病病菌(Sphaerotheca fuliginea)、水稻紋枯病病菌(Thanatephorus cucumeris)、小麥赤霉病病菌(Gibberella zeae)、番茄早疫病病菌(Alternaria solani)、草莓灰霉病病菌(Botrytis cinereaPers.)、水稻惡苗病病菌(Gibborella fujikuroi)、水稻稻瘟病病菌(Pyricoraria orizae)，均是本實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 培養(yǎng)基

菌種分離篩選培養(yǎng)基[5]：高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉 20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂20 g，自來水 1 000 mL，pH 7.2～7.4。

菌種活化培養(yǎng)基(日本培養(yǎng)基)：可溶性淀粉5 g，葡萄糖5 g，蛋白胨1 g，牛肉膏1 g，酵母膏1 g，瓊脂15 g，自來水1 000 mL，pH 7.2。

菌種發(fā)酵培養(yǎng)基(C4培養(yǎng)基)：可溶性淀粉10 g，葡萄糖20 g，花生餅粉25 g，牛肉膏1 g，酵母粉4 g，氯化鈉2 g，磷酸氫二鉀0.05 g，自來水1 000 mL，pH 7.2。

1.2.4 對照藥劑

20%吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)懸浮劑(利民化工股份有限公司)；50%多菌靈(carbendazim)可濕性粉劑(上海悅聯(lián)化工有限公司)

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 拮抗放線菌的分離純化

采用梯度稀釋平板涂布法分離黃瓜根際土壤中的放線菌[6]：

⑴ 根據(jù)配方制作高氏一號培養(yǎng)基，趁熱將適量培養(yǎng)基注入培養(yǎng)皿中，待凝成平板，備用。

⑵ 稱取黃瓜根際土壤約10 g，放入裝有100 mL無菌水和玻璃珠的錐形瓶中，并加入10%酚10滴，以抑制細(xì)菌的生長。搖床振蕩10 min左右，制成10-1菌懸液。按照連續(xù)稀釋分離法，進(jìn)一步制成10-3菌懸液。

⑶ 用移液槍吸取0.1 mL 10-3菌懸液，注入平板培養(yǎng)基上，用無菌玻璃棒將菌懸液均勻涂抹在整個(gè)培養(yǎng)基上。然后將培養(yǎng)皿倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)7～10 d，培養(yǎng)基上會出現(xiàn)適量微生物菌落。如果菌落硬度較大，干燥致密，且與基質(zhì)緊密結(jié)合，不易被針挑起，這就是放線菌菌落。

⑷ 挑取放線菌菌落，接種于斜面培養(yǎng)基上。

1.3.2 種子菌液的制備

將分離保存的菌種轉(zhuǎn)接到 C4培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)48 h進(jìn)行活化，活化后挑取部分菌落接于裝有100 mL C4培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，28 °C，180 r/min，振蕩培養(yǎng)48 h即為種子菌液。

發(fā)酵液的制備：將發(fā)酵好的種子液按5% (體積比)的比例接種到裝有200 mL C4培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，28 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)96 h備用。

1.3.3 拮抗放線菌的篩選

1.3.3.1 初篩

初篩采用含毒介質(zhì)法[7]，具體步驟：⑴ 先將配制好的PDA培養(yǎng)基基質(zhì)加熱至沸騰；⑵ 向已經(jīng)經(jīng)過高溫消毒處理的培養(yǎng)皿加入1 mL樣品發(fā)酵液，混合均勻；⑶ 向培養(yǎng)皿中加入10 mL PDA培養(yǎng)基基質(zhì)，冷卻至室溫，紫外滅菌至少30 min；⑷ 在培養(yǎng)基中心位置分別放置倒置的水稻紋枯病、小麥赤霉病、番茄早疫病、草莓灰霉病、水稻惡苗病或水稻稻瘟病的病原菌菌餅(d=8 mm)；⑸ 將制備好的培養(yǎng)皿倒置放在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(放在盒子中或者用報(bào)紙包好保存，防止被培養(yǎng)箱中熱風(fēng)吹干)。其中以不放置致病菌菌餅作為對照試驗(yàn)、50%多菌靈可濕性粉劑做為陽性對照試驗(yàn)。每組試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)。28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對照組的病原菌菌絲體鋪滿整個(gè)平板時(shí)，測量試驗(yàn)組病菌直徑，計(jì)算抑菌率。計(jì)算公式為：

1.3.3.2 復(fù)篩

對初篩試驗(yàn)中效果較好(抑菌率＞60%)的拮抗菌進(jìn)行復(fù)篩。以黃瓜白粉病菌為指示菌，采用活體生測法，篩選對其有效的拮抗菌株。在溫室條件下，挑選飽滿的黃瓜種子播種到小花盆里，保濕，置于25 ℃室溫下光照培養(yǎng)。待黃瓜幼苗長出2片真葉時(shí)，挑選長勢一致的黃瓜苗，將初篩的放線菌發(fā)酵液4 000 r/min進(jìn)行離心處理15 min，上清液原液及其2倍稀釋和4倍稀釋藥液分別均勻噴灑于葉片上，待藥液晾干后接種孢子濃度為10萬個(gè)/mL左右的白粉病菌孢子懸浮液，用接種噴霧器在黃瓜苗上均勻噴霧接種，然后把接種白粉病菌的黃瓜苗移至恒溫室燈光下(24 ℃左右)，培養(yǎng)期間每天保溫、保濕，于7 d和14 d后按黃瓜白粉病的常規(guī)分級標(biāo)準(zhǔn)及方法計(jì)算病情指數(shù)和防治效果[8]，每處理3次重復(fù)。對照藥劑為吡唑醚菌酯懸浮劑，以清水作為空白對照。

1.3.4 拮抗放線菌株的觀察與鑒定

1.3.4.1 拮抗放線菌株的培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征

對復(fù)篩試驗(yàn)中拮抗活性最強(qiáng)的放線菌，用活化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中觀察菌落形態(tài)，并對菌落進(jìn)行革蘭氏染色，觀察染色后的顏色。

1.3.4.2 拮抗放線菌株的鑒定

拮抗放線菌株的16S rDNA片段的擴(kuò)增與序列分析采用通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增[9]。正向引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'、反向引物：5'-ACGGCTACCTTGTTA CGACT-3'。PCR產(chǎn)物由山東圣強(qiáng)德生物技術(shù)有限公司測序，結(jié)果在Genbank中進(jìn)行 Blast同源序列檢索。將所測得的16srDNA序列用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性比對，應(yīng)用Clustal X進(jìn)行多重比對后，根據(jù)MEGA5.0軟件采用Neibor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[10]，自舉分析10 000次重復(fù)檢測分子系統(tǒng)樹的置信度，最后確定該菌株的分類地位。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)性分析，用Minitab Statistical Software軟件進(jìn)行差異性顯著分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗放線菌的分離篩選和初篩結(jié)果

采用梯度稀釋平板涂布法從黃瓜根系土壤中共分離得到放線菌108株，通過離體生測方法測定了這些放線菌對水稻紋枯病、小麥赤霉病、番茄早疫病、草莓灰霉病、水稻惡苗病、水稻稻瘟病的6種致病菌的抑制活性，發(fā)現(xiàn)具有廣譜防效的菌株占17%，拮抗能力均在50%以上的菌株只占5%左右，有較弱拮抗作用的菌株占8%，其余均無活性。

選取拮抗能力最強(qiáng)的一株放線菌菌株編號為SDNY-040，再次進(jìn)行離體生測試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示，與清水對照相比，SDNY-040對水稻紋枯病、小麥赤霉病、番茄早疫病、草莓灰霉病、水稻惡苗病、水稻稻瘟病病原菌的抑菌率均超過90%，較50%多菌靈可濕性粉劑對番茄早疫病和草莓灰霉病的防效分別高86.2%和38%，說明該株放線菌具有廣譜的抗真菌能力。結(jié)果見表1。

表1 SDNY-040的離體抑菌效果

2.2 放線菌株SDNY-040復(fù)篩結(jié)果

盆栽測定結(jié)果顯示，放線菌株SDNY-040發(fā)酵液原液以及2倍稀釋和4倍稀釋藥液在施用7 d后，白粉病病情指數(shù)分別為2.7、3.7和3.7，藥劑防效分別為95.7%、93.2%和93.2%，施藥后第14 d時(shí)3個(gè)施藥濃度的病害病情指數(shù)分別為8.3、11.1和22.2，藥劑防治效果分別為87.9%、83.9%和67.7%。與20%吡唑醚菌酯懸浮劑相比，原液在第7 d和14 d時(shí)的防效要低4.3%和13%，防治效果與清水相比，均呈顯著性差異，說明此拮抗放線菌的防效比較顯著。結(jié)果見表2。

表2 放線菌SDNY-040對盆栽黃瓜白粉病防治效果

2.3 放線菌株SDNY-040的形態(tài)特征

放線菌株SDNY-040革蘭氏染色呈陽性，在日本培養(yǎng)基上生長較緩慢，單菌落呈皺褶狀，基內(nèi)菌絲呈褐色，發(fā)酵液呈褐色，上清液澄清透明，具備生產(chǎn)、儲藏以及應(yīng)用上的優(yōu)勢。

2.4 放線菌株SDNY-040的16s rDNA的序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

經(jīng)測序，放線菌株SDNY-040的16s rDNA全長序列1 408 bp，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對，結(jié)合進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示其與紫色鏈霉菌(Streptomycessp.)親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)到99%以上，結(jié)合菌落形態(tài)特征，可以初步判斷放線菌株SDNY-040是鏈霉菌屬相關(guān)變種，系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖1。

圖1 基于16s rDNA序列同源性的SDNY-040和相關(guān)菌屬的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié) 論

大多數(shù)天然存在的抗生素來源于放線菌，放線菌素是人們在1940年首次發(fā)現(xiàn)來源于鏈霉菌的抗生素，由抗生素鏈霉菌產(chǎn)生[11]，1942年發(fā)現(xiàn)了由淡紫灰鏈霉菌(Streptomyces lavendulae)產(chǎn)生的鏈絲菌素，1944年發(fā)現(xiàn)了由灰色鏈霉(Streptomyces griseus)產(chǎn)生的鏈霉素(streptomycin)。鏈霉菌一直是臨床抗生素的主要來源，其中放線菌源的抗生素有80%以上的來源于鏈霉菌[12]。

本文通過對黃瓜根際土壤菌進(jìn)行分離純化，以離體試驗(yàn)進(jìn)行大范圍初篩，發(fā)現(xiàn)了一株具有對水稻紋枯病、小麥赤霉病、番茄早疫病、草莓灰霉病、水稻惡苗病、水稻稻瘟病病原菌抑菌率均在90%以上廣譜殺菌放線菌株，且對黃瓜白粉病具有較高的生防效果。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定推測該菌與紫色鏈霉菌屬(Streptomycessp.)屬于同一屬，具有較好的市場開發(fā)潛力。