湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲的單倍型多樣性及種系發(fā)育關(guān)系分析

李中波，侯強(qiáng)紅，李 暉，舒 鳴

（1. 懷化職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 懷化 418000；2. 湘西民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 吉首 416000）

呂氏泰勒蟲（Theileria luwenshun）為一種常見且重要的蜱傳性血液原蟲[1]，隸屬于泰勒科、泰勒屬[2]，寄生于山羊、綿羊的紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)[3]，可引發(fā)一種以發(fā)熱、貧血、黃疸、消瘦、體表淋巴結(jié)腫大及拉血紅蛋白尿為特征性臨床癥狀的血液原蟲病——羊泰勒蟲病[4‐5]。呂氏泰勒蟲1914 年首次被發(fā)現(xiàn)于埃及的患病羊只[6]，而后世界上多個國家和地區(qū)（如歐洲、非洲、中東及亞洲）陸續(xù)有報道[7]，尤以熱帶、亞熱帶地區(qū)流行最為普遍[8]。呂氏泰勒蟲因具有較強(qiáng)的感染力和致病力，且分布廣泛，已成為我國范圍寄主的優(yōu)勢蟲株之一[9]。該蟲一旦感染羊只，可引起被感染羊只出現(xiàn)發(fā)熱、溶血性黃疸、貧血、消瘦及拉血紅蛋白尿等癥狀[4‐5]，如救治不及時或不當(dāng)可導(dǎo)致羊只大量死亡[10]，給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。鐘維等[11]調(diào)查四川阿壩州牦牛及藏綿羊中呂氏泰勒蟲的感染情況，發(fā)現(xiàn)其感染率高達(dá)75%。此外，多種因素影響呂氏泰勒蟲病的流行，如氣候環(huán)境對呂氏泰勒蟲的分布影響極大[12]。地理位置的阻隔，在一定程度上也會影響呂氏泰勒蟲的基因交流、種群結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育。地理位置為呂氏泰勒蟲的物種多樣性、遺傳多樣性和單倍型多樣性提供先決條件。

單倍體基因型簡稱單倍型，是指在一染色單體上具有統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)意義的一類單核苷酸多態(tài)性[13]。我國地域?qū)拸V，地理、氣候多樣，是造就物種多樣性的基本條件。同一物種為快速適應(yīng)棲息地的環(huán)境和氣候，往往在自身的形態(tài)及遺傳結(jié)構(gòu)等方面發(fā)生變化，形成單倍型多態(tài)性及個體多樣性。然而，一個物種的單倍型多樣性及遺傳多樣性又是研究物種遺傳資源保護(hù)不可或缺的內(nèi)容。因此，研究一個物種的單倍型多態(tài)性和種系發(fā)育關(guān)系，不僅為物種遺傳資源保護(hù)提供重要的信息和理論基礎(chǔ)，而且還有助于今后理解該物種在自然環(huán)境中的進(jìn)化過程，因而這方面的研究已越來越受到人們的重視和關(guān)注。迄今為止，國內(nèi)外已開展諸多關(guān)于寄生蟲的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)、單倍型多態(tài)性及種系發(fā)育關(guān)系等方面的研究。AMZATI 等[14]基于線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ（cox1）基因和12S rRNA序列研究具尾扇頭蜱（Rhipicephalus appendiculatus）的種群結(jié)構(gòu)和單倍型；MALATJI 等[15]基于cox1基因分析雞蛔蟲（Ascaridia galli）的遺傳結(jié)構(gòu)和單倍型。我國僅有馮雪皎[16]基于線粒體cox1、16S rDNA 和核糖體ITS-2 基因?qū)? 個地理種群長角血蜱（Haemaphysalis longicornis）的單倍型及遺傳多樣性進(jìn)行研究。

核糖體、線粒體基因均具有進(jìn)化速度快、缺乏基因重組及母系遺傳等特征[17‐19]。目前，核糖體、線粒體基因已廣泛應(yīng)用于種群結(jié)構(gòu)、分子標(biāo)記、生物進(jìn)化、種系發(fā)育、物種鑒定、單倍型及進(jìn)化基因組學(xué)等方面研究[20‐21]。國內(nèi)學(xué)者研究集中在某一寄生蟲的鑒定、歸類、形態(tài)描述、遺傳進(jìn)化關(guān)系及其所攜病原微生物檢測等方面，鮮有學(xué)者就某一寄生蟲的單倍型多樣性進(jìn)行研究。湘西地區(qū)毗鄰云貴高原，為多山陵地帶，轄區(qū)內(nèi)含有極為豐富的蜱種，然其內(nèi)溝壑縱橫，氣候多變，交通極為不便，給蜱蟲的生殖交流造成一定程度上的地理隔離，間接為呂氏泰勒蟲個體及遺傳多樣性的形成提供了先決條件，但關(guān)于這一地區(qū)呂氏泰勒蟲單倍型多樣性及種系發(fā)育關(guān)系等方面的研究甚少。因此，對該地區(qū)羊源呂氏泰勒蟲的單倍型多態(tài)性及種系發(fā)育關(guān)系進(jìn)行研究，不僅有助于該地區(qū)醫(yī)學(xué)、公共衛(wèi)生事業(yè)及畜牧業(yè)的發(fā)展，還可為今后泰勒蟲病的分子流行病學(xué)調(diào)查、診斷、防控及相關(guān)藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。為此，以16株來自湘西地區(qū)的羊源性呂氏泰勒蟲為樣品，采用PCR 擴(kuò)增其18S rRNA、cox1基因序列，分析呂氏泰勒蟲的單倍型多態(tài)性及種系發(fā)育關(guān)系，為泰勒蟲的種類鑒定、分類提供依據(jù)，并為該地區(qū)泰勒蟲病的診斷、控制及分子流行病學(xué)調(diào)查提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

含有泰勒蟲的山羊血液由湘西民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院寄生蟲實驗室提供，將血液分別編號為XT1—XT16，置于-20 ℃保存，備用。

1.2 主要試劑

動物血液、組織DNA 提取試劑盒購買于北京天根有限公司；Taq高保真酶（Mix）購自寶生物工程（大連)有限公司；蛋白酶K 和DL2000 DNA Marker均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；電泳緩沖液購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 DNA提取

根據(jù)血液、組織DNA 提取試劑盒的使用說明書，分別提取16 株呂氏泰勒蟲的基因組DNA。再將提取好的DNA樣品置于-20 ℃保存、備用。

1.4 目的基因的擴(kuò)增、測序

根據(jù)NCBI 所公布呂氏泰勒蟲的18S rRNA、cox1基因序列，設(shè)計2 對特異性引物（敏感度為0.047 ng/μL），即18S rRNA-F：5′-AACCTGGTTGAT‐CCTGCCAGTAGTCAT-3′，18S rRNA-R：5′-GATCC‐TTCTGCAGGTTCACCTAC-3′和cox1-F：5′-TGACT‐GGACTGTTTGGTGG-3′，cox1-R：5′-TGAGAAACC‐AGCGAAGTGC-3′，分別對16 株羊源呂氏泰勒蟲的18S rRNA、cox1基因序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[22]。PCR 擴(kuò)增體系（總體積均為50μL）：Taq高保真酶（Mix）25μL，DNA 模板1 μL，上下游引物各1 μL，dH2O 22 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃/56 ℃（18S rRNA/cox1)退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃均再延伸5 min。待PCR 反應(yīng)完成后，從每個反應(yīng)體系取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察結(jié)果并拍照。將所有陽性PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測序，獲得呂氏泰勒蟲18S rRNA、cox1基因的部分序列。

1.5 序列比對、校準(zhǔn)和對齊

將所獲得的18S rRNA、cox1基因序列分別進(jìn)行BLAST 分析比對，再運用軟件Clustal X 分別對所獲得的18S rRNA、cox1基因序列進(jìn)行校準(zhǔn)和對齊[23]。

1.6 變異位點與單倍型多樣性分析

基于所獲得的18S rRNA、cox1及18S rRNA+cox1基因序列，運用軟件DNAStar[24]分析基因變異位點；運用軟件DnaSP 5.0[25]、Network 4.6[26]及Arlequin version 3.0[27]分析單倍型多樣性。

1.7 種系發(fā)育關(guān)系分析

基于18S rRNA+cox1基因序列，以所獲呂氏泰勒蟲及從NCBI 中下載的呂氏泰勒蟲蟲株Li2（JF719831、JQ518295）、Li6（JF719833、JQ518296），尤氏泰勒蟲（Theileria uilenbergi）（JF719835、JQ518295），馬泰勒蟲（Theileria equi）（KY111761、MF510491）及小泰勒蟲（Theileria parva）（L02366、AB499089）為內(nèi)群，并以雙芽巴貝斯蟲（Babesia bigemina）（JQ723014、AB499085）為外群，運用軟件Clustal X、PhyML 3.0[28]及MEGA 5.0[29]，采用最大相似法（ML）和GTR+I+G 模型（bootstrap=100）對呂氏泰勒蟲的種系發(fā)育關(guān)系進(jìn)行分析，再運用軟件FigTree v1.3.1[30]描繪所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲18S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲18S rRNA 基因的擴(kuò)增結(jié)果見圖1。從圖1 可以看出，16 個PCR 產(chǎn)物均為陽性，每個泳道只含1 個條帶，無明顯雜帶，且大小與預(yù)期一致，均約為400 bp。

圖1 湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲18S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of 18S rRNA gene of T.luwenshun from western Hunan

2.2 湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲cox1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲cox1基因序列的擴(kuò)增結(jié)果見圖2。從圖2 可以看出，16 個PCR 產(chǎn)物均為陽性，每個泳道只含1 個條帶，無明顯雜帶，且大小與預(yù)期一致，均約為1 100 bp。

圖2 湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲cox1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification of cox1 gene of T.luwenshun from western Hunan

2.3 湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲18S rRNA、cox1基因序列的測序、校準(zhǔn)、對齊與提交

測序結(jié)果顯示，湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲18S rRNA、cox1基因序列長度分別處于387～398 bp 和1 096～1 102 bp。利用軟件Clustal X 分別校準(zhǔn)、對齊所有18S rRNA、cox1基因序列，最終得到18S rRNA基因序列的長度均為384 bp，cox1基因序列長度均為1 092 bp。將所有處理后的18S rRNA、cox1基因序列進(jìn)行BLAST 比對分析，結(jié)果顯示，湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲的18S rRNA、cox1基因序列與GenBank 中呂氏泰勒蟲的相似度為98%～100%，從而確認(rèn)所獲序列均為目的基因序列。將湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲18S rRNA、cox1基因序列提交到NCBI，獲得18S rRNA 基因登錄號MW750496—MW750511，cox1基因登錄號MW937264—MW937279。

2.4 湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲18S rRNA、cox1基因序列的變異位點分析

基于上述的18S rRNA、cox1基因序列，分別對湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲18S rRNA、cox1及18S rRNA+cox1基因序列的變異位點進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。由表1 可知，在呂氏泰勒蟲18S rRNA（384 bp）基因序列中共含有9 個變異位點（轉(zhuǎn)換7 個，顛換2 個）；cox1（1 092 bp）基因序列中共存在2 個變異位點（轉(zhuǎn)換2 個，顛換0 個）；18S rRNA+cox1基因序列中，共包含11個變異位點（轉(zhuǎn)換9個，顛換2個）。

表1 湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲18S rRNA、cox1和18S rRNA+cox1變異位點Tab.1 The variable sites in 18S rRNA，cox1 and 18S rRNA+cox1 sequences of T.luwenshun from western Hunan

2.5 湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲單倍型多樣性分析

運用軟件DnaSP 5.0、Network 4.6 及Arlequin version 3.0 分別對湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲18S rRNA、cox1及18S rRNA+cox1基因序列的單倍型多樣性進(jìn)行分析（圖3）。由圖3 可知，湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲18S rRNA 基因序列含有7 個單倍型（h=7，A1—A7，Hd=0.775）；cox1基因序列共包含4 個單倍型（h=4，B1—B4，Hd=0.625）；18S rRNA+cox1基因序列共存在10個單倍型（h=10，C1—C10，Hd=0.925）。在A單倍型中，單倍型A1 共包含7 個序列，即XT7、XT10、XT11、XT13、XT14、XT15、XT16；單倍型A4包含4個序列，即XT1、XT2、XT3和XT4；而剩下的單倍型，每個單倍型只包含1 個序列。在B 單倍型中，單倍型B1 所包含的序列最多，共8 個，即XT1、XT2、XT4、XT5、XT11、XT12、XT13 和XT16；B2 包含2 個序列，即XT8 和XT10；B3 包含3 個序列（XT3、XT14、XT15）；B4 也包含3 個序列，即XT6、XT7 和XT9。在C 單倍型中，單倍型C1（XT1、XT2、XT4）、C8（XT10、XT14、XT15）和C9（XT11、XT13、XT16）均含3個序列，其余的單倍型僅含1個序列。此外，在A、B 及C 單倍型中，A1、A4、B1、B3、B4、C1、C8 與C9 均為古老單倍型，均分別包含呂氏泰勒蟲18S rRNA及cox1基因的古老序列。

圖3 湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲18S rRNA（A）、cox1（B）和18S rRNA+cox1（C）基因序列單倍型網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Network maps of 18S rRNA（A），cox1（B）and 18S rRNA+cox1（C）haplotypes of T.luwenshun from western Hunan

2.6 湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲的種系發(fā)育分析

湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲的種系發(fā)育分析結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，該系統(tǒng)發(fā)育樹共包含3個分支（CladeⅠ—Ⅲ），其中分枝CladeⅡ由16 株來自于湘西地區(qū)的羊源呂氏泰勒蟲與來源甘肅的呂氏泰勒蟲株Li2及Li6共同形成，而馬泰勒蟲則單獨形成系統(tǒng)發(fā)育樹的分支CladeⅠ，尤氏泰勒蟲與小泰勒蟲則共同形成該系統(tǒng)發(fā)育樹的分支Clade Ⅲ。此外，CladeⅡ與Clade Ⅲ位于系統(tǒng)發(fā)育樹的一大分支上，與CladeⅠ相分離。

圖4 湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲種系發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of T.luwenshun from western Hunan

3 結(jié)論與討論

變異位點分析結(jié)果顯示，湘西地區(qū)呂氏泰勒蟲cox1基因序列（1 092 bp）共包含2個變異位點，且均為轉(zhuǎn)換型，而在18S rRNA 基因序列（384 bp）中，共包含9個變異位點，7 個為轉(zhuǎn)換型，2 個為顛換型。兩者相比，發(fā)現(xiàn)cox1基因序列所包含的變異位點顯著低于18S rRNA基因序列，這與前人研究結(jié)果相一致[23，31]，也與核糖體基因具有高突變的特點相符合[32‐33]，表明cox1基因序列的保守性高于18S rRNA基因序列，暗示cox1基因序列更適合用于物種的遺傳變異分析，而18S rRNA因具有種內(nèi)差異大的特點不適于遺傳變異分析，這與林瑞慶等[34]認(rèn)為ITS 存在種內(nèi)差異大、不適合作為犬復(fù)孔絳蟲種的遺傳標(biāo)記相吻合。

根據(jù)呂氏泰勒蟲18S rRNA、cox1及18S rRNA+cox1基因序列的單倍型多樣性的分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)18S rRNA、cox1及18S rRNA+cox1基因序列的單倍型均未出現(xiàn)聚集成群的現(xiàn)象和單倍型多樣性的值均較低，且存在多個共同古老的單倍型（A1、A4、B1、B3、B4、C1、C8、C9），說明這16 株來源于湘西地區(qū)的羊源呂氏泰勒蟲單倍型之間關(guān)系較近，并擁有共同的祖先，存在呂氏泰勒蟲18S rRNA及cox1基因的古老序列，表明16株來源于湘西地區(qū)的羊源呂氏泰勒蟲之間雖有一定程度的基因變異和單倍型多樣性，但尚未出現(xiàn)遺傳分化的現(xiàn)象。

在系統(tǒng)發(fā)育樹中，來自湘西地區(qū)的16株羊源性呂氏泰勒蟲與Li2及Li6兩蟲株相互摻雜在一起，共同形成該系統(tǒng)發(fā)育樹的分枝Clade Ⅱ，這說明湘西地區(qū)的16株羊源呂氏泰勒蟲之間及與Li2、Li6兩蟲株之間的親緣關(guān)系較近；所選的尤氏泰勒蟲及小泰勒蟲則共同形成該系統(tǒng)發(fā)育樹的Clade Ⅲ，這說明尤氏泰勒蟲與小泰勒蟲之間的親緣關(guān)系近；而分支Clade Ⅱ雖與Clade Ⅲ相分離，但均位于該系統(tǒng)發(fā)育的一個大分支上；由馬泰勒蟲單獨所形成的分支Clade Ⅰ卻獨立位于系統(tǒng)發(fā)育樹的另一個大分支上，這表明呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲、小泰勒蟲的親緣關(guān)系較馬泰勒蟲近。以上結(jié)果表明，來自湘西地區(qū)的16 株羊源性呂氏泰勒蟲之間及與外域性蟲株的親緣關(guān)系近，無遺傳分化現(xiàn)象，與上述種內(nèi)差異和單倍型多樣性分析的結(jié)果相一致。此外，該結(jié)果也表明，呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲、小泰勒蟲的親緣關(guān)系近于馬泰勒蟲，且尤氏泰勒蟲與小泰勒蟲之間具有較近的親緣關(guān)系。

本研究中，來自湘西地區(qū)的16株羊源呂氏泰勒蟲之間雖存在一定程度的基因變異、遺傳多樣性及單倍型多樣性，但它們個體之間、單倍型之間及與外域性呂氏泰勒蟲株（Li2、Li6）之間存在較近的親緣關(guān)系，尚未出現(xiàn)遺傳分化的現(xiàn)象。