煙草鐮刀菌根腐病防治藥劑的篩選

姚晨虓，劉 暢，李小杰，白靜科，徐 敏，邱 睿，陳玉國，康業(yè)斌，李淑君

（1. 煙草行業(yè)黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點實驗室/河南省農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，河南 許昌 461000；2. 河南科技大學園藝與植物保護學院，河南 洛陽 471023；3. 中國煙草總公司河南省公司，河南 鄭州 450018）

我國煙草種植面積和總產(chǎn)量均位居全球第一，是全世界最大的煙草生產(chǎn)國與消費國。隨著煙草連作年限的增加，土傳病害的危害程度日益加重[1‐2]，以尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和茄病鐮刀菌（F. solani）[3]為主要致病菌的煙草鐮刀菌根腐病在我國大多數(shù)煙區(qū)發(fā)生嚴重危害，給煙葉生產(chǎn)帶來巨大的損失[4]。

化學防治仍是目前煙草根莖類病害最主要、最有效的防治措施，常用藥劑有75%甲基硫菌靈可濕性粉劑、50%福美雙可濕性粉劑[5]、25%甲霜靈可濕性粉劑[6]、25%甲霜靈可濕性粉劑與65%代森鋅可濕性粉劑的復(fù)配劑[7]等，通過噴施、灌根或蘸根處理可達到較好的防治效果，但化學防治所帶來的藥物殘留增加、病蟲害抗藥性增強以及對生物健康的威脅等問題也不容小覷[8‐9]。伴隨國家化肥農(nóng)藥“雙減”政策和對綠色煙葉、有機煙葉的提倡，安全、無毒、環(huán)境友好的生物防治逐漸成為研究熱點[10‐11]，微生物農(nóng)藥的使用不僅可以很好地防治田間病害的發(fā)生與流行，同時還可以達到一定的植物促生作用[12‐13]，但防治效果較慢，成本較高，且受人為、環(huán)境等多種因素的影響也較大，存在不穩(wěn)定的現(xiàn)象[14]。

為更好地防治煙草鐮刀菌根腐病，可通過篩選高效、低毒、低風險的化學殺菌劑和生物殺菌劑進行復(fù)配。采用不同作用機制的殺菌劑交替或復(fù)配使用，是阻止或延緩病原菌抗藥性進一步加劇的主要策略之一[15]。陳志敏[16]對福建煙區(qū)烤煙根莖類病害進行藥劑篩選和防治試驗，發(fā)現(xiàn)10%苯醚甲環(huán)唑EC 和12.5%腈菌唑EC 及其復(fù)配劑對煙草立枯絲核菌、煙草炭疽病菌、煙草根腐尖孢鐮刀菌均具有較強的抑制作用；王秋萍等[17]研究發(fā)現(xiàn)，甲霜·錳鋅和中生菌素與煙草專用肥混合施用對煙草病害具有較好的防治效果，并且可以提高煙葉產(chǎn)量。同時，包衣劑的開發(fā)和應(yīng)用也是盡可能從根源上預(yù)防和解決病害問題的主要方法之一，配合復(fù)配劑的使用可以極大程度地降低煙草病害在生產(chǎn)中帶來的損失。目前，關(guān)于煙草鐮刀菌根腐病的田間藥劑篩選報道較少，而且生物殺菌劑的篩選可為復(fù)配劑的開發(fā)提供供選藥劑。鑒于此，采用菌絲生長速率法測定20種殺菌劑對煙草尖孢鐮刀菌的毒力，并通過盆栽試驗驗證防效，為煙草鐮刀菌根腐病田間防治藥劑的篩選、輪換交替用藥及復(fù)配劑的相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

供試菌株為煙草行業(yè)黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點實驗室保存的煙草鐮刀菌根腐病主要致病菌尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）。

1.2 供試藥劑

20種供試殺菌劑的具體信息見表1。

表1 供試殺菌劑Tab.1 Test fungicides

續(xù)表1 供試殺菌劑Tab.1（Continued） Test fungicides

1.3 供試培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：將200 g去皮馬鈴薯、20 g 葡萄糖、15～20 g 瓊脂用蒸餾水熬煮定容至1 000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min。將病原菌接種于PDA 平板，在相對濕度70%、25 ℃、光周期12 h/12 h的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 d。

1.4 試驗方法

1.4.1 不同殺菌劑對煙草尖孢鐮刀菌的室內(nèi)生物活性測定 采用菌絲生長速率法[16]測定20 種殺菌劑對煙草鐮刀菌根腐病菌的室內(nèi)毒力。通過一系列預(yù)試驗，最終設(shè)定如表2 所示的各殺菌劑試驗濃度梯度。選用直徑為5 mm 的打孔器，打取培養(yǎng)6～8 d 的病原菌菌落邊緣制備菌餅，用挑針挑取菌餅分別接種于不同質(zhì)量濃度藥劑平板上，每組處理重復(fù)3次，25 ℃倒置培養(yǎng)6～8 d。利用十字交叉法測量菌落平均生長直徑，根據(jù)病原菌在不同質(zhì)量濃度藥劑平板上的線性生長速率，計算各質(zhì)量濃度藥劑對病原菌的菌絲生長抑制率，并求出各藥劑對病原菌的抑制中濃度（EC50）。

表2 20種殺菌劑的毒力測定濃度Tab.2 Concentrations of 20 fungicides used for determination of their toxicity to F.oxysporum

抑制率=[對照組菌絲生長直徑（mm）-處理組菌絲生長直徑（mm）]/[對照組菌絲生長直徑（mm）-菌餅直徑（mm）]×100%。

1.4.2 不同殺菌劑對煙草尖孢鐮刀菌室內(nèi)盆栽防效測定 盆栽藥效試驗參照文獻[18]略有改動。將培養(yǎng)好的帶菌麥粒[3]與滅菌基質(zhì)按體積比（1∶5）混勻，選取4～5葉期長勢一致的煙苗移栽，根據(jù)室內(nèi)藥劑篩選的EC50值設(shè)定盆栽藥劑施用濃度，將不同供試藥劑的稀釋液按每株20 mL 進行灌根，施足水后于28 ℃保濕培養(yǎng)，每處理10株，重復(fù)3次，以清水灌根為病原菌對照，以不接種病原菌僅清水灌根為空白對照。接種病原菌15 d 后以株為單位統(tǒng)計發(fā)病情況，按照煙草行業(yè)標準GB/T 23222—2008[19]進行病害調(diào)查和嚴重度分級，計算發(fā)病率、病情指數(shù)和相對防效。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用DPS 7.05 軟件對數(shù)據(jù)進行回歸分析，計算各處理質(zhì)量濃度的對數(shù)值（X）和菌絲生長抑制率概率值（Y），求出毒力回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r），得出殺菌劑的EC50，并得到95%置信區(qū)間。采用Excel 2010 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，計算各處理病情指數(shù)和防治效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 10種化學殺菌劑對煙草尖孢鐮刀菌的毒力

采用菌絲生長速率法測定了10 種高效、低毒、低風險化學殺菌劑對煙草尖孢鐮刀菌的毒力。結(jié)果（表3）顯示，10 種化學殺菌劑對煙草尖孢鐮刀菌均有不同程度的抑制作用，氟啶胺、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑和抑霉唑的抑菌效果較好，EC50分別為0.057 1、0.118 7、0.328 0μg/mL 和0.445 9μg/mL，其中以殺菌劑氟啶胺的平板抑制效果最好（圖1），可選取這4種殺菌劑進一步開展復(fù)配劑組合篩選和包衣劑開發(fā)研究。

圖1 氟啶胺對煙草尖孢鐮刀菌的平板抑制效果Fig.1 The inhibitory effect of fluazinam on F.oxysporum

表3 10種化學殺菌劑對煙草尖孢鐮刀菌的毒力Tab.3 Toxicity of ten chemical fungicides to F.oxysporum

其次是嘧菌酯、異菌脲、甲基硫菌靈和啶酰菌胺，EC50依次為8.409 3、8.802 0、8.814 7 μg/mL 和12.483 8 μg/mL，四者可作為備選藥劑。抑制效果最差的是烯酰嗎啉和嘧霉胺，EC50分別高達133.738 5μg/mL 和228.613 6μg/mL，二者對病原菌的活性較低，因此生產(chǎn)上應(yīng)避免使用此類藥劑防治煙草鐮刀菌根腐病以及其他煙草根莖類病害。同時，在煙草種植區(qū)選擇時還需對前茬作物的用藥情況進行調(diào)查，避免因此類藥劑因連年施用、用藥量過大等產(chǎn)生病原菌抗藥性或藥害。

2.2 10種生物殺菌劑對煙草尖孢鐮刀菌的毒力

采用菌絲生長速率法測定10 種高效、無毒（或低毒）、低風險的生物殺菌劑對煙草鐮刀菌的毒力，結(jié)果（表4）顯示，7種生物殺菌劑對煙草尖孢鐮刀菌有較好的抑制作用，其中阿維菌素、香芹酚和蕓苔素內(nèi)酯的抑菌效果最好，EC50分別為10.387 0、18.873 2 μg/mL 和32.343 7 μg/mL。阿維菌素在市場上通常被作為殺蟲劑來使用，同時兼具殺菌作用，10種生物殺菌劑中以阿維菌素對煙草尖孢鐮刀菌的EC50值最低，平板抑菌效果最好（圖2）。其次是乙蒜素和赤霉酸，EC50依次為79.109 4 μg/mL 和87.413 2 μg/mL，二者可作為備選藥劑。大蒜油和氨基寡糖素的抑菌效果較差，EC50高達255.127 8μg/mL 和361.824 7 μg/mL。而小檗堿、井岡霉素和甲殼素在250 μg/mL 質(zhì)量濃度下抑制率分別為34.64%、16.80%、4.76%，抑制效果較差且不穩(wěn)定。

表4 7種生物殺菌劑對煙草尖孢鐮刀菌的毒力Tab.4 Toxicity of seven biological fungicides to F.oxysporum

圖2 阿維菌素對煙草尖孢鐮刀菌的平板抑制效果Fig.2 The inhibitory effect of avermectin on F.oxysporum

2.3 7種殺菌劑對煙草尖孢鐮刀菌的室內(nèi)防效

由表5可以看出，在殺菌劑室內(nèi)防效試驗中，除香芹酚外的其余6種殺菌劑均對煙草尖孢鐮刀菌有不同程度的防治效果。戊唑醇對鐮刀菌的相對防效最高，為75.75%，其次是苯醚甲環(huán)唑、蕓苔素內(nèi)酯和氟啶胺，相對防效分別為62.12%、62.12%和51.51%（圖3）。

圖3 部分藥劑對煙草尖孢鐮刀菌的盆栽防治效果Fig.3 Control effect of some pesticides on F.oxysporum in potted plants

表5 7種殺菌劑對煙草尖孢鐮刀菌的室內(nèi)防效Tab.5 Indoor control effect of seven fungicides against F.oxysporum in tobacco

3 結(jié)論與討論

隨著煙草鐮刀菌根腐病危害的逐年加重，其受重視程度也開始逐漸增加，目前有關(guān)煙草鐮刀菌根腐病的藥劑篩選報道仍較少。陳志敏[16]測定了4 種藥劑對煙草尖孢鐮刀菌的毒力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10%苯醚甲環(huán)唑EC 的EC50為0.370 0 μg/mL，抑制效果最好，與本研究測定的苯醚甲環(huán)唑的EC50值（0.328 0μg/mL）基本一致，并且本研究篩選的氟啶胺和戊唑醇的抑制效果（EC50分別為0.057 1、0.118 7 μg/mL）均好于苯醚甲環(huán)唑∶腈菌唑（1∶4）復(fù)配劑的抑制效果（EC50為0.410 0 μg/mL）。郭敬等[20]報道，烯酰嗎啉對煙草疫霉的抑制效果較好，可抑制菌絲生長和孢子囊萌發(fā)；但胡燕等[21]研究發(fā)現(xiàn)，烯酰嗎啉對煙草疫霉敏感菌株繼代培養(yǎng)物的抑菌率明顯降低，可能形成了高水平的抗性菌株，證明煙草疫霉對烯酰嗎啉存在較大的抗性風險。本研究發(fā)現(xiàn)，煙草尖孢鐮刀菌對烯酰嗎啉的敏感性較低，因此，在田間用藥時必須注意合理使用，預(yù)防煙草主要病原菌高抗水平的產(chǎn)生。

生物殺菌劑的防效相對化學殺菌劑較低，藥效較慢，但是有些生物農(nóng)藥具有誘導(dǎo)植物體產(chǎn)生抗性并促進植物生長調(diào)節(jié)的作用，對環(huán)境友好，極具生產(chǎn)、開發(fā)潛力[22‐23]。黃闊等[24]研究發(fā)現(xiàn)，阿維菌素對煙草根結(jié)線蟲病的控制效果較好，盆栽防效可達82.97%。本研究發(fā)現(xiàn)，阿維菌素具有較好的抑菌能力，開發(fā)潛力大。有研究報道，乙蒜素對煙草野火病菌[25]、煙草青枯病菌[26]均有一定的抑制效果。本研究也發(fā)現(xiàn)，乙蒜素對煙草尖孢鐮刀菌的抑制效果較好，應(yīng)該提高乙蒜素在煙草病害防治研究與應(yīng)用中的重視程度。小檗堿對煙草赤星病菌的抑制效果較差[25]，同時會造成煙草細胞變形和質(zhì)壁分離，線粒體和細胞壁等降解[27]；井岡霉素對煙草赤星病菌的EC50為10 556.58 μg/mL，抑菌能力差[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿和井岡霉素對煙草尖孢鐮刀菌的抑菌效果較差，應(yīng)該注意此類藥劑的田間使用。雖然生物源殺菌劑的用藥風險低、安全系數(shù)高，但是生產(chǎn)上也應(yīng)該嚴格規(guī)范使用。

由于鐮刀菌經(jīng)常發(fā)生形態(tài)學性狀和致病性方面的變異[28]，所以對于室內(nèi)盆栽防效試驗的穩(wěn)定性會產(chǎn)生較大影響。本次盆栽試驗篩選的殺菌劑，平板抑菌效果均較好，但盆栽試驗中發(fā)病率整體較高，對試驗的相對防效產(chǎn)生了一定的影響，尤其是香芹酚的防效有待進一步驗證，同時需對病原菌接種量、藥劑施用量和施用次數(shù)進行深入細化研究。而且，盆栽防效結(jié)果并不能完全代表田間實際防效，藥劑在田間的防效還會受到寄主植物、多種病菌及復(fù)雜環(huán)境條件的綜合影響[29]。

本研究結(jié)果表明，氟啶胺、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑和蕓苔素內(nèi)酯對煙草鐮刀菌根腐病主要致病菌的抑制作用較強，室內(nèi)盆栽防效較好，對于煙草鐮刀菌根腐病田間防治的藥劑應(yīng)用和輪換交替用藥具有理論指導(dǎo)意義。同時，為進一步選定藥劑進行兩元復(fù)配、三元復(fù)配、化學藥劑與生物源藥劑或生物菌劑的復(fù)配奠定基礎(chǔ)，也為包衣劑的開發(fā)提供新的理論參考，對生產(chǎn)上綜合防控煙草鐮刀菌根腐病和其他根莖類病害具有重要的實踐指導(dǎo)意義和研究價值。