向日葵抗列當育種研究進展

郭樹春 苗紅梅 李素萍 于海峰 聶 惠牟英男 溫馨雨 梁 晨 張海斌 邵 盈

（1河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，450002，河南鄭州；2內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，010031，內(nèi)蒙古呼和浩特；3內(nèi)蒙古烏蘭察布市察右中旗大灘鄉(xiāng)人民政府，013558，內(nèi)蒙古烏蘭察布）

向日葵（Heliauths annuus L.）起源于北美洲，屬菊科向日葵屬一年生草本植物，具有抗逆性強和適應(yīng)性廣的特點，是世界四大油料作物之一[1]。世界上有40多個國家種植向日葵，其中種植面積較大的國家有俄羅斯、烏克蘭、阿根廷、羅馬尼亞、中國等[2]。向日葵籽油是南美洲國家、俄羅斯、法國及部分東歐國家的主要食用油[3]。向日葵籽是東南亞國家主要休閑食品之一[4-5]，也是重要的工業(yè)原料，在東南亞的市場需求旺盛，其次籽粒還是一種優(yōu)質(zhì)的飼料原料。目前，向日葵籽在炒貨和籽仁市場中的消費量呈上升趨勢。在我國，向日葵是改良鹽堿地的先鋒作物，也是重要的經(jīng)濟作物，在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟結(jié)構(gòu)調(diào)整中具有不可替代的作用。

向日葵列當（Orobanche cumana Wallr.）屬列當科列當屬植物，寄生在向日葵等寄主根部引起植株莖稈低矮細弱，產(chǎn)量和品質(zhì)明顯降低，甚至整株死亡，對向日葵生產(chǎn)危害嚴重[6]。19世紀上半葉人們認為向日葵的寄主是蒿屬（Artemisia spp.）植物，Antonova[3]研究發(fā)現(xiàn)向日葵更合適列當寄生。此后，隨著不同國家和地區(qū)向日葵種植面積的擴大，向日葵列當?shù)陌l(fā)生及危害也愈漸嚴重[7]。向日葵列當具有很強的傳播和突變能力[8]。單株列當會產(chǎn)生數(shù)千個微小的種子，種子大小為200～300μm，且很容易被風(fēng)和其他媒介（包括向日葵種子和農(nóng)機具等）傳播[9]。列當種子從無限花序蒴果中釋放后，可在土壤中休眠長達數(shù)十年之久[10]，可在寄主植物根系分泌物的誘導(dǎo)下發(fā)芽[11]，開始新的寄生生活。

據(jù)估計，地中海和西亞地區(qū)有1600萬hm2的土地受到列當影響[12-13]。據(jù)統(tǒng)計[14-16]，在易感列當品種種植區(qū)，由列當侵染造成的損失超過50%，受侵染嚴重的田地可達100%。黃長權(quán)[17]研究表明，單株向日葵被5株列當寄生時，株高降低11.8%，莖粗降低15.2%；寄生40株時，株高和莖粗分別降低40.9%和39.2%。任文義等[18]研究發(fā)現(xiàn)，單株向日葵上列當寄生數(shù)為10～20株時，向日葵減產(chǎn)30%，寄生數(shù)為30株以上時，會造成80%的減產(chǎn)；寄生數(shù)量達到50株以上時其產(chǎn)量近乎絕收。在選用非抗性品種條件下，選用合理的管理和栽培方法，可以降低列當對其生產(chǎn)的不良影響。研究證明，使用化學(xué)方法控制列當是可行的，但高成本和污染環(huán)境問題限制了其推廣與應(yīng)用。使用抗列當品種是控制寄生性列當?shù)淖罴逊椒?。培育抗列當品種的基礎(chǔ)是挖掘有效抗源，然而，這是一項長久持續(xù)的工作，因為一旦發(fā)現(xiàn)對現(xiàn)有小種的抗源，列當就會進化出更具毒性的生理小種。向日葵抗列當基因有單基因和多基因遺傳抗性的報道[19]。目前，向日葵列當正在我國快速蔓延，對向日葵產(chǎn)業(yè)的影響日趨嚴重。

向日葵列當已成為研究重點，本文側(cè)重于通過育種手段提高向日葵對列當?shù)目剐裕绕涫峭ㄟ^分子育種得到對毒力更強的列當小種具有抗性的向日葵品種進行了綜述。同時還開展生理小種的結(jié)構(gòu)和分布、定性和定量抗性基因在提高向日葵抗性中應(yīng)用以及分子標記輔助選擇等方面的研究。此外，展望了在今后工作中要充分利用生物技術(shù)工具，如基因組學(xué)和基因編輯技術(shù)，以實現(xiàn)向日葵對列當?shù)某志每剐?，為向日葵抗列當育種研究提供理論依據(jù)，對我國向日葵生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展具有一定的應(yīng)用價值。

1 向日葵列當生理小種分布

向日葵列當具有宿主特異性，這一現(xiàn)象在寄生植物中很少見[20]。向日葵列當以自花授粉為主，因此其種群間遺傳多樣性很高[21]。向日葵列當基因組較小，易受環(huán)境影響而突變，其群體進化速度快，且存在生理小種分化的現(xiàn)象[22]。在列當屬植物中，一種向日葵列當生理小種類型（根據(jù)其毒力強弱，以A、B、C…小種順序表示）對應(yīng)一種特定的向日葵抗列當基因型，表現(xiàn)出明顯的種族結(jié)構(gòu)。目前已知的向日葵列當生理小種有8種（A～H）。

據(jù)文獻[2]記載，第一次發(fā)現(xiàn)了列當存在不同生理小種，鑒定出與之對應(yīng)的抗列當品種，并區(qū)分了2個向日葵列當生理小種，即A和B。后來，隨著新的生理小種C的出現(xiàn)，嚴重影響向日葵生產(chǎn)，A和B的遺傳抗性因此而變得無效[21]。研究發(fā)現(xiàn)，在一段時間內(nèi)新的抗列當向日葵種質(zhì)的引入可控制列當?shù)陌l(fā)生，但隨著環(huán)境壓力的增加，新的毒性更強的列當小種就會出現(xiàn)，并使原有的抗原失去效力。目前，向日葵列當存在的地區(qū)有所有南歐國家、黑海周邊地區(qū)、北非、以色列和中國[16]。據(jù)報道[23]，俄羅斯南部地區(qū)存在多種列當生理小種，已命名為F、G和H。繼F小種之后，在羅馬尼亞和西班牙相繼發(fā)現(xiàn)了致病力更高的G小種，該生理小種能夠在抗F小種的向日葵寄生[7,24]。2014年，Kaya[6]報道稱，在土耳其發(fā)現(xiàn)一種新的向日葵列當，其致病力比當時已發(fā)現(xiàn)的向日葵列當小種都高，并將其命名為生理小種H。2011年，Dicu等[25]在羅馬尼亞也發(fā)現(xiàn)了向日葵列當生理小種H。Hablak等[26]在烏克蘭東北部觀察到H小種的存在，以及毒力高于H小種的向日葵列當生理小種。摩爾多瓦向日葵列當不同生理小種的空間分布不均，在該國中部地區(qū)較低毒力的小種占主導(dǎo)地位，而在南部和北部地區(qū)高侵染性生理小種占主導(dǎo)地位，超過60%的列當樣本歸類為G和H小種[27]。羅馬尼亞2005年就出現(xiàn)了高毒力G小種[28-29]。

不同國家向日葵列當生理小種的組成情況有所不同。Shindrova[30]于2000-2004年間在保加利亞向日葵主產(chǎn)區(qū)采集列當種子，然后利用成套鑒別寄主對其生理小種進行鑒定，結(jié)果表明保加利亞存在D、E和F小種，其中E小種的分布區(qū)域最為廣泛，F(xiàn)小種存在于中北部的個別區(qū)域。Shindrova[30]于2012年對保加利亞116份向日葵列當進行了生理小種鑒定，發(fā)現(xiàn)有E、F、G和H生理小種，其中E和G小種的分布最為廣泛，F(xiàn)小種有零星分布，H小種為首次發(fā)現(xiàn)。Pacureanu-Joita等[31]對西班牙向日葵列當進行了生理小種鑒定，發(fā)現(xiàn)西班牙向日葵列當主要由E小種組成，但也有F小種的存在。Dedic等[32]對塞爾維亞伏伊伏丁那省向日葵列當致病力分化及分布進行了研究，發(fā)現(xiàn)B小種是該省南部主要的小種類型，而E小種則是該省北部地區(qū)主要的小種類型。Molinero-Ruiz等[33]在西班牙北部地區(qū)也發(fā)現(xiàn)了列當?shù)膫鞑?，其中生理小種F最具毒力。

對中國列當小種結(jié)構(gòu)和分布分析，發(fā)現(xiàn)A～G小種在我國均有不同程度的存在[4]。1996年，董百春等[34]利用源自西班牙的5份向日葵列當國際鑒別寄主，采用人工接種方法對吉林省3個向日葵列當群體進行了生理小種鑒定，結(jié)果證明它們均屬于生理小種A。馬德甯等[35]于2014年對來自內(nèi)蒙古、新疆、甘肅、吉林和黑龍江等地的向日葵列當進行了生理小種鑒定，發(fā)現(xiàn)這些向日葵列當樣本中包含有生理小種A到F的全部類型。石必顯等[36]利用向日葵列當國際通用鑒別寄主，對我國不同省區(qū)29個地點的向日葵列當進行鑒定，發(fā)現(xiàn)向日葵列當生理小種A、D、E、F和G的存在，其中D小種是優(yōu)勢生理小種。

2 向日葵抗列當遺傳改良

2.1 向日葵抗列當品種選育

抗列當品種的成功選育很大程度上取決于相關(guān)性狀的遺傳變異[37]，抗性品種可阻礙列當在向日葵根部的寄生，從而達到防治的效果。由于栽培向日葵的遺傳多樣性相對狹窄，因此現(xiàn)有遺傳資源是非常寶貴的變異來源；通過引入重要農(nóng)藝基因，可提高向日葵栽培品種的抗性和品質(zhì)性狀。此外，野生向日葵和世界各地研究機構(gòu)開發(fā)的栽培向日葵的基因庫是向日葵列當抗性的重要來源，可通過自交與雜交等手段為特定品系引入列當抗性。

目前，通過種間雜交、自交和回交等手段可將向日葵野生種H.tuberosu的抗性基因?qū)朐耘嗖牧希⒁殉晒x育出抗生理小種E、F和G的向日葵新品種[38]。Joel[39]將向日葵野生種H.maximiliani Schrad，H.grosseserratus Mart和 H.divarticatus與常規(guī)栽培種交叉種植，培育出4個（BR1-BR4）抗小種F品種。陳燕芳等[40]從原有感列當“三道眉”群體中尋求抗源，采用連續(xù)自交選擇純化的方法成功選育出抗列當食葵新品種622。由此可見，現(xiàn)有栽培向日葵基因庫也是列當抗性的重要來源，這些基因庫由不同類型的種群和近交系組成。Joita等[7]從羅馬尼亞農(nóng)業(yè)研究與發(fā)展研究所的栽培向日葵基因庫中鑒定出對F和G小種有抗性的LC1093、LC009和AO-548品系，這些研究所開發(fā)和改良的向日葵抗列當材料極大地豐富了向日葵遺傳資源多樣性，為向日葵抗列當育種做出了巨大貢獻。

2.2 向日葵抗列當基因

抗性育種是一項持續(xù)性很強的工作，其中包括發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)制抗性基因。Vranceanu等[19]鑒定了5個抗列當單顯性基因（以O(shè)r1、Or2、Or3…表示），成功培育出抗E小種的自交系和雜交種，提高了歐洲和亞洲等區(qū)域的向日葵產(chǎn)量。通過培育抗性品種防治列當簡單易行，能夠有效控制列當蔓延，已成為向日葵抗列當育種的首選手段[41]。然而，由于該寄生性列當?shù)目焖龠M化，該類型抗性很容易被打破[37,42]，這主要是由不同列當生理小種的特異性導(dǎo)致，如由基因Or6控制的抗性基因?qū)及以下生理小種有效[43-44]。Goncharov[45]研究表明，向日葵列當G小種的致病力極強，其所對應(yīng)的抗性基因為Or7。

除了對向日葵列當?shù)拇怪笨剐匝芯客?，人們從分子遺傳水平揭示向日葵列當抗性的復(fù)雜性，對向日葵列當不同生理小種特異性抗性的數(shù)量位點已有報道[44,46-48]，利用不同的定位群體，在不同遺傳區(qū)域定位了一個控制列當抗性的QTL。QTL基因定位法的主要優(yōu)點是，除可以定位主效QTL外，還可對列當抗性影響較小的互補QTL定位，并可作為標記輔助選擇的有效標記。Pérez-Vich等[44]研究表明，QTL對列當抗性并不總是與抗性親本的等位基因相對應(yīng)，在某些情況下，它是由易感親本的等位基因賦予的。向日葵抗列當育種的主要目的是培育攜帶所需目的基因的高產(chǎn)向日葵資源。由此可見，對高毒力小種有抗性的向日葵基因型是稀缺抗性基因的來源，并可用于區(qū)分高級別列當小種。此外，獲得抗特定列當生理小種的基因序列信息，能夠?qū)ο蛉湛剐院土挟斝》N進行更加準確的區(qū)分。

2.3 向日葵抗列當遺傳多樣性分子標記

擁有單一列當抗性的基因型往往在很短的時間內(nèi)就會失去抗性。例如，當攜帶Or5基因的向日葵遇到毒性更強的小種時，就會失去抗性，因此，要培育持續(xù)抗列當品種，需要采取新的策略，如主效基因聚合或垂直抗性與水平抗性聚合等[19]。將1個以上的基因和QTL聚合于1個材料，迫使列當克服2個或更多基因的抗性，達到持續(xù)抗列當目的。但傳統(tǒng)育種手段很難實現(xiàn)上述目標，因此，通過MAS進行基因聚合是快速遺傳改良的有效方法。與表型選擇育種相比，分子標記輔助選擇是一種簡單、高效、準確的方法，在抗病育種中更為方便[49]。由于栽培向日葵對列當?shù)目剐孕枰氩煌瑏碓床牧系目剐曰?，可利用不同類型的分子標記定位和鑒定抗性基因的位置和序列信息，從而聚合多個抗性基因。隨著更復(fù)雜的向日葵抗列當數(shù)量遺傳信息的出現(xiàn)，分析和鑒定抗列當基因?qū)⒆兊酶攥F(xiàn)實意義和挑戰(zhàn)性。

到目前為止，已經(jīng)明確了一些向日葵抗列當分子標記或基因。張明等[50]利用抗F小種列當材料和高感材料，根據(jù)BSA法建立了抗、感池，對分布在17個向日葵連鎖群上的409對SSR引物進行篩選，共篩選到77個多態(tài)性SSR引物，從這些引物中篩選到4對可將抗—感單株、抗—感混池明確區(qū)分開的引物，它們可能是抗F小種通用分子標記引物。Tang等[51]定位了一個抗列當E小種的單基因Or5所連鎖的SSR分子標記，發(fā)現(xiàn)該基因定位在LG3的頂端，距離最近的標記是CRT392，為5.6cM。此外，Pérez-Vich等[44]在第7條染色體上檢測到5個抗E小種的QTL和6個抗F小種的QTL，研究確定E小種抗性表型變異主要由第3染色體上與抗性或易感性狀相關(guān)的主效QTL產(chǎn)生。Imerovski等[52]通過SSR標記得到抗列當F小種的基因僅在LG3上顯示多態(tài)性，與該基因最接近的標記為Orabvl-8，暫命名為ORS683，遺傳距離為1.5cM。雖然該基因與Or5在同一條染色體上，但這2個抗性基因是不同的。Or5基因位于第3染色體上端，最近的公共標記ORS1036位于下游7.5cM處，而Orabvl-8定位于第3染色體下端。Imerovski等[48]在第3染色體上定位了2個抗列當主要QTL，分別命名為QTL or3.1和QTL or3.2，前者定位于Or5的基因組區(qū)域，后者首次定位于同一染色體的下游區(qū)域，并發(fā)現(xiàn)第3染色體存在抗性QTL，根據(jù)雜交結(jié)果，在向日葵基因組中定位了2～23個顯著QTL，并在距SSR標記ht0464-ca約3cM處的LG4位點上推測了列當小種H的抗性位點，2個SNP標記（HT0183和HT090）被鑒定為潛在的重要標記。Louarn等[47]鑒定了2個生理小種（F小種來自西班牙，G小種來自土耳其）在向日葵3個發(fā)育階段的不同QTL，并在9條染色體上定位了17個QTL，其中只有1個QTL在2個小種的抗性上共定位。最近研究[53]發(fā)現(xiàn)基因HaOr7已被定位到第7條染色體上。

2.4 向日葵抗列當基因信息

近年來，隨著植物全基因組、蛋白質(zhì)組和代謝組取得進展，可在全基因組水平挖掘和鑒定抗性基因和蛋白。最近公開的向日葵基因組序列為向日葵基因組的開發(fā)奠定了堅實的基礎(chǔ)[53]。Duriez等[54]結(jié)合基因組學(xué)和圖譜克隆技術(shù)，定位和鑒定了HaOr7基因?qū)α挟擣小種的抗性功能。該基因位于一個約55kb的窗口。為了獲得親本基因組序列，從易感株系和抗性株系中建立并篩選了2個BAC文庫。通過比較發(fā)現(xiàn)HaOr7基因起源于野生向日葵。將該序列與XRQ易感F小種的參考序列進行比較，發(fā)現(xiàn)HaOr7基因編碼了一個完整的LRR蛋白激酶，而在易感向日葵品系中，該蛋白無跨膜和激酶結(jié)構(gòu)域。HaOr7阻止了向日葵根與維管系統(tǒng)的連接，其在列當早期發(fā)生階段起作用。Imerovski等[48]分析了3個不同的雜交組合，在3號染色體上發(fā)現(xiàn)了QTL峰顯著的區(qū)域。在主效QTL or3.1（31.9～38.48Mb）共鑒定出123個基因，選出HanXRQChr03g0065701（RPS2抗病蛋白）和HanXRQChr03g0065841（TMV抗病蛋白）基因。在該QTL or3.2共鑒定出71個基因，分布在97.13～100.85Mb，其中包括1個防御基因HanXRQChr03g0076321?？紤]到QTL or3.1附近區(qū)域之前已鑒定為攜帶對E小種具有完全抗性和對F小種具有部分抗性的Or5基因[43,51]，推測QTL or3.1可能是Or5基因，詳見表1。

表1 向日葵抗列當抗性基因及其序列信息Table 1 Sunflower resistance gene and its sequence information

3 展望

列當是影響向日葵產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一。目前，仍未培育出持續(xù)抗列當?shù)钠贩N。最近，向日葵基因組測序結(jié)果的公布為列當小種無毒力鑒定、向日葵抗性基因定位和基因間調(diào)控關(guān)系明確奠定了基礎(chǔ)，可以更好地理清向日葵抗列當機制以及挖掘新的抗性基因?；蚓庉嫾夹g(shù)的發(fā)展有助于更快地設(shè)計出優(yōu)異的列當抗性基因類型，促進聚合抗性的產(chǎn)生，但由于向日葵再生出苗困難和轉(zhuǎn)化率低等難點，致使基因編輯技術(shù)和基因沉默技術(shù)難以應(yīng)用于向日葵育種。因此，使用現(xiàn)代基因編輯技術(shù)的第一步需要建立完善的向日葵再生、轉(zhuǎn)化體系，此外，將垂直抗性研究與水平抗性研究結(jié)合，開展分子標記輔助育種、轉(zhuǎn)基因技術(shù)育種和多基因聚合分子育種等多種育種方式，培育持續(xù)抗列當向日葵新品種，是現(xiàn)代向日葵育種家的目標之一。