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    c-型鈉鈦對(duì)小鼠胚胎體外發(fā)育的影響

    2022-07-06 15:51:24楊詩雨施泓如王曉東劉瑞妍倪志翔佟英偉何長久
    黑龍江動(dòng)物繁殖 2022年3期
    關(guān)鍵詞:桑椹孵化率囊胚

    楊詩雨,施泓如,王曉東,劉瑞妍,倪志翔,佟英偉,劉 成,李 翔,何長久

    (華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家級(jí)國際聯(lián)合研究中心,武漢 430070)

    胚胎體外生產(chǎn)(IVP)既是人類輔助生殖的技術(shù)基礎(chǔ),也是畜牧業(yè)中提高母畜繁殖潛力、加快品種改良及種質(zhì)資源保存的重要手段。胚胎發(fā)育效率是制約IVP技術(shù)推廣的核心因素。早期胚胎比較脆弱,極易受培養(yǎng)環(huán)境的影響,如滲透壓、溫度、pH值的微小改變都會(huì)影響胚胎質(zhì)量,甚至造成胚胎發(fā)育阻滯。因此,改進(jìn)培養(yǎng)液配方是優(yōu)化IVP技術(shù)的主要手段。無論是在生殖醫(yī)學(xué)還是畜牧生產(chǎn)中,被移植的大多是在體外發(fā)育至囊胚階段的胚胎,因?yàn)橄啾雀珉A段的胚胎,囊胚移植妊娠率較高。正因?yàn)槿绱?,囊胚發(fā)育率、囊胚孵化率及囊胚細(xì)胞數(shù)是評(píng)價(jià)IVP技術(shù)先進(jìn)性的核心指標(biāo)。近20年以來,科學(xué)家們一直在致力于改進(jìn)胚胎培養(yǎng)液的成分以提高胚胎存活率和囊胚發(fā)育率。

    囊胚腔的形成是胚胎主動(dòng)攝入水分并儲(chǔ)存在內(nèi)部的結(jié)果。研究表明,桑椹胚細(xì)胞膜上的Na/K泵所營造的內(nèi)外滲透壓梯度差是胚胎攝入水分的主要?jiǎng)恿?。水分子通過自由擴(kuò)散或水通道蛋白介導(dǎo)的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)方式不斷進(jìn)入胚胎內(nèi)部,導(dǎo)致囊胚腔的形成與擴(kuò)張。c-型鈉鈦(CNP)是鈉鈦家族的主要成員,與心房鈉鈦和腦鈉肽具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)。研究表明,CNP不僅參與泌尿系統(tǒng)與循環(huán)系統(tǒng)的水鈉轉(zhuǎn)運(yùn),而且還能影響神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中水通道蛋白的表達(dá)。越來越多的證據(jù)表明,CNP還作為局部信號(hào)直接調(diào)控哺乳動(dòng)物生殖活動(dòng)。在雌性哺乳動(dòng)物中,CNP不僅可以維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯,而且還能促進(jìn)小鼠早期卵泡的發(fā)育。在雄性動(dòng)物中,CNP已被證實(shí)可以調(diào)節(jié)生精作用、精子運(yùn)動(dòng)和睪酮合成。有研究報(bào)道,CNP處理的牛卵母細(xì)胞,經(jīng)過體外受精或者孤雌激活,胚胎的囊胚率和質(zhì)量均得到了顯著提高。

    鑒于CNP在生殖活動(dòng)中廣泛的調(diào)節(jié)作用,研究者在體外成熟液中添加CNP,顯著提高了卵母細(xì)胞的質(zhì)量。然而,CNP對(duì)胚胎體外發(fā)育的影響鮮有報(bào)道。研究表明,在胚胎和胎盤中均能檢測(cè)到CNP信號(hào),并且妊娠期子宮中CNP基因表達(dá)水平比孕前會(huì)升高7倍左右。據(jù)此推測(cè)CNP可能參與了胚胎發(fā)育調(diào)控。為了驗(yàn)證這一推測(cè),本試驗(yàn)以小鼠為模型,分別在2細(xì)胞胚胎和囊胚腔形成階段添加CNP,統(tǒng)計(jì)CNP對(duì)4細(xì)胞率、囊胚率、囊胚成腔率、囊胚腔擴(kuò)張率、囊胚孵化率、囊胚腔直徑、囊胚腔面積占比及囊胚總細(xì)胞數(shù)的影響,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料

    1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

    3周齡雌性昆明近交系小鼠40只,購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,飼養(yǎng)期間保持12 h/12 h的明暗周期變化(08:00—20:00光照),動(dòng)物房溫度保持22~26℃,自由飲水,自由采食。

    1.2 主要試劑

    孕馬血清促性腺激素(PMSG)、人絨毛膜促性腺激素(hCG),購自寧波第二激素廠;透明質(zhì)酸酶、KSOM培養(yǎng)液與石蠟油,購自Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司;DAPI、磷酸鹽緩沖液(PBS)、4%多聚甲醛與防熒光淬滅劑(DABCO),購自武漢塞維爾生物科技有限公司;CNP,購自Med Chem Express公司;卵母細(xì)胞操作液(M2液),購自北京邁晨科技公司。

    1.3 主要儀器、設(shè)備

    體視顯微鏡,NIKON公司產(chǎn)品;熒光正置顯微鏡,Olympus公司產(chǎn)品;CO細(xì)胞培養(yǎng)箱,Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品;超凈工作臺(tái),北京亞泰科隆儀器技術(shù)公司產(chǎn)品。以上儀器、設(shè)備均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

    2 方法

    2.1 小鼠超數(shù)排卵及配種

    雌性小鼠腹腔注射PMSG 5 IU以促進(jìn)卵泡發(fā)育,46 h后再注射hCG 5 IU。隨后將其與性成熟雄性小鼠進(jìn)行1∶1合籠,并于次日檢查陰道栓以確定交配情況,檢查發(fā)現(xiàn)見栓30只,將其隨機(jī)分成兩批,其中15只小鼠用于2細(xì)胞/4細(xì)胞轉(zhuǎn)變階段添加CNP試驗(yàn),另外15只用于桑椹胚階段添加CNP試驗(yàn)。

    2.2 體內(nèi)受精卵的獲取與處理

    在hCG注射22 h后,采用頸椎脫臼法處死見栓小鼠并分離輸卵管,在M2操作液中用注射器針頭扎破輸卵管膨大部以釋放受精卵。隨后使用0.3%透明質(zhì)酸酶溶液去除胚胎周圍多余卵丘細(xì)胞,將清洗完畢的受精卵轉(zhuǎn)移至KSOM 培養(yǎng)液中,并置于5%CO、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

    2.3 胚胎培養(yǎng)

    將CNP濃儲(chǔ)液按不同體積分別加到KSOM培養(yǎng)液中,最終CNP濃度為0(對(duì)照組)、100μg/L(1組)、200μg/L(2組)。采用微滴法進(jìn)行胚胎培養(yǎng),每滴培養(yǎng)液50μL,用石蠟油封閉。當(dāng)胚胎發(fā)育至2細(xì)胞階段時(shí),將2細(xì)胞隨機(jī)分配到對(duì)照組(17枚)、1組(20枚)、2組(21枚)微滴中繼續(xù)培養(yǎng),隨后統(tǒng)計(jì)4細(xì)胞率與囊胚率。當(dāng)胚胎發(fā)育至致密桑椹胚階段時(shí),將桑椹胚隨機(jī)分配到對(duì)照組(40枚)、1組(38枚)、2組(37枚)微滴中繼續(xù)培養(yǎng),隨后統(tǒng)計(jì)囊胚成腔率、擴(kuò)張率、孵化率以及囊胚細(xì)胞數(shù)等指標(biāo)。

    2.4 DAPI染色

    使用多聚甲醛固定囊胚,將固定后的囊胚轉(zhuǎn)移到DAPI染色液中,室溫孵育10 min。用PBS清洗3次后將囊胚轉(zhuǎn)移至含防熒光猝滅劑的載玻片上,并于熒光顯微鏡下觀察拍照。

    2.5 測(cè)定項(xiàng)目及數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

    為研究CNP對(duì)囊胚總細(xì)胞數(shù)的影響,對(duì)含不同濃度CNP的培養(yǎng)液中發(fā)育24 h的囊胚進(jìn)行DAPI染色,并拍照統(tǒng)計(jì)各組囊胚總細(xì)胞數(shù)。

    將2細(xì)胞在不同濃度CNP的培養(yǎng)液中培養(yǎng),24 h后統(tǒng)計(jì)4細(xì)胞率(4細(xì)胞數(shù)/2細(xì)胞數(shù)×100%);72 h后統(tǒng)計(jì)囊胚率(囊胚數(shù)/2細(xì)胞數(shù)×100%]。桑椹胚在不同濃度CNP的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計(jì)囊胚成腔率(囊胚數(shù)/桑椹胚數(shù))×100%]、囊胚擴(kuò)張率(擴(kuò)張囊胚數(shù)/桑椹胚數(shù)×100%)、囊胚腔面積占比(囊胚腔面積/囊胚總面積×100%)和囊胚腔直徑;48 h后統(tǒng)計(jì)孵化率(孵化囊胚數(shù)/桑葚胚數(shù)×100%)。

    采用Image J軟件測(cè)量擴(kuò)張囊胚的直徑和囊胚腔面積,用IBM SPSSStatistics 24軟件對(duì)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析,用GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖。多組數(shù)據(jù)間的顯著性比較采用單因素方差分析,百分率數(shù)據(jù)采用卡方檢驗(yàn)及Bonferroni方法進(jìn)行分析,<0.05視為兩個(gè)數(shù)據(jù)間差異顯著。

    3 結(jié)果與分析

    試驗(yàn)首先確定了胚胎發(fā)育至各階段所需的時(shí)間。受精卵在體外培養(yǎng)24 h后發(fā)育至2細(xì)胞(見圖1A);48 h后發(fā)育至4細(xì)胞(見圖1B);72 h后發(fā)育至桑椹胚(見圖1C);96 h后發(fā)育至囊胚(見圖1D),此刻可觀察到擴(kuò)張囊胚,即囊胚腔擴(kuò)張至囊胚總面積的1/2以上;120 h后發(fā)育至孵化囊胚(見圖1E)。

    圖1 早期胚胎發(fā)育不同階段代表性圖片F(xiàn)ig.1 Representative images of different stages of early embryonic development

    3.1 早期胚胎體外發(fā)育各階段的觀察

    3.2 2/4細(xì)胞轉(zhuǎn)變階段添加CNP對(duì)胚胎發(fā)育的影響

    將2細(xì)胞隨機(jī)分配到含CNP濃度為0,100,200μg/L的微滴中培養(yǎng),24 h后統(tǒng)計(jì)4細(xì)胞發(fā)育率(2細(xì)胞在不同濃度CNP的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后的代表性圖片見圖2),72 h后統(tǒng)計(jì)囊胚率。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,1組4細(xì)胞率無顯著差異(52.50% vs 68.42%,>0.05),2組4細(xì) 胞 率 顯 著 降 低(33.3% vs 68.42%,<0.05),見圖3A。1組和2組的胚胎均無法繼續(xù)發(fā)育至囊胚階段,見圖3B。

    圖2 2細(xì)胞在不同濃度CNP的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后的代表性圖片F(xiàn)ig.2 Representative images of 2-cell cultured in different doses of CNP medium for 24 hours

    圖3 2細(xì)胞/4細(xì)胞轉(zhuǎn)變階段添加CNP對(duì)胚胎發(fā)育的影響Fig.3 Effects of adding CNP on embryonic development at the transition stage from 2-cell to 4-cell

    3.3 CNP對(duì)小鼠囊胚的成腔與擴(kuò)張的影響

    桑椹胚在不同濃度CNP的培養(yǎng)液中培養(yǎng)的代表性圖片見圖4。與對(duì)照組相比,1組囊胚成腔率(83.10% vs 90.28%)、囊胚腔擴(kuò)張率(56.34% vs 66.67%)、孵化率(15.49% vs 15.28%)、囊胚腔面積占比(50.77% vs 51.99%)和囊胚腔直徑[(86.42±2.76)μm vs(95.29±4.13)μm]均無顯著差異(>0.05);而2組囊胚成腔率(43.78% vs 90.28%)、囊胚腔擴(kuò)張率(17.91% vs 66.67%)、孵化 率(4.48% vs 15.28%)、囊 胚 腔 面 積 占 比(38.15% vs 51.99%)和囊胚腔直徑[(73.30±3.22)μm vs(95.29±4.13)μm]均顯著降低(<0.05),見圖5。

    圖4 桑椹胚在不同濃度CNP的培養(yǎng)液中培養(yǎng)的代表性圖片F(xiàn)ig.4 Representative images of morula cultured in different doses of CNP medium

    圖5 CNP對(duì)小鼠囊胚成腔與擴(kuò)張的影響Fig.5 Effects of CNP on the cavity formation and expansion of blastocysts in mouse

    3.4 CNP對(duì)囊胚總細(xì)胞數(shù)的影響

    DAPI染色代表性圖片見圖6。經(jīng)統(tǒng)計(jì),1組(41.38±2.71 vs 55.12±3.06)和2組(38.29±2.47 vs 55.12±3.06)囊胚總細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比均顯著下降(<0.05),見圖7。

    圖6 DAPI染色代表性圖片(標(biāo)尺=50μm)Fig.6 Representative images of DAPI staining(scale bar=50μm)

    圖7 桑椹胚在CNP培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h時(shí)囊胚總細(xì)胞數(shù)Fig.7 The total number of blastocyst cells of morula cultured in CNP medium for 24 hours

    4 討論與結(jié)論

    小鼠胚胎早期發(fā)育過程中,合子基因組激活發(fā)生在2細(xì)胞階段,若合子基因組激活失敗,就會(huì)出現(xiàn)胚胎發(fā)育阻滯的現(xiàn)象。本試驗(yàn)中,CNP的添加導(dǎo)致2細(xì)胞向4細(xì)胞胚胎轉(zhuǎn)變的效率顯著下降,并且CNP組少數(shù)發(fā)育至4細(xì)胞的胚胎也無法完成后續(xù)發(fā)育。說明CNP對(duì)早期胚胎的卵裂可能具有廣泛的抑制作用,但CNP發(fā)揮上述抑制作用的機(jī)制尚不清楚。

    囊胚腔形成的關(guān)鍵在于水分在胚胎內(nèi)部的積累,水分積累效率越高囊胚發(fā)育越快。因此,囊胚率、囊胚腔擴(kuò)張率、囊胚擴(kuò)張等級(jí)及囊胚孵化率可以作為囊胚質(zhì)量評(píng)估的形態(tài)學(xué)指標(biāo)。當(dāng)CNP濃度為100μg/L時(shí),與CNP濃度為0相比,囊胚成腔率、囊胚腔擴(kuò)張率、囊胚腔面積占比和直徑均呈下降的趨勢(shì),但是差異不顯著(>0.05);當(dāng)CNP濃度繼續(xù)升高至200μg/L時(shí),囊胚成腔率、囊胚擴(kuò)張率、孵化率、囊胚腔直徑和囊胚腔面積占比繼續(xù)明顯下降,與CNP濃度為0相比差異顯著(<0.05)。這說明在胚胎培養(yǎng)液中添加CNP對(duì)囊胚腔的形成也有抑制作用。相比于體外囊胚,體內(nèi)囊胚的總細(xì)胞數(shù)明顯更多。細(xì)胞數(shù)是評(píng)價(jià)胚胎細(xì)胞周期進(jìn)展能力和發(fā)育潛能的關(guān)鍵指標(biāo),研究表明,發(fā)育潛能、著床率、活產(chǎn)率都隨著細(xì)胞數(shù)的增加而增加。細(xì)胞數(shù)降低的原因之一可能是發(fā)育停滯或遲緩導(dǎo)致細(xì)胞周期延長的結(jié)果。本試驗(yàn)中,添加CNP顯著降低囊胚總細(xì)胞數(shù),這說明CNP對(duì)早期胚胎發(fā)育潛力具有抑制作用。

    50年前,用于胚胎體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基問世,經(jīng)過幾十年的探究,目前已經(jīng)具有比較成熟的胚胎培養(yǎng)系統(tǒng),培養(yǎng)液能夠提供胚胎生長所必需的碳水化合物、氨基酸、無機(jī)鹽等營養(yǎng)物質(zhì)和滲透壓維持因子。有研究發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)液中添加生長因子或多肽有助于提高胚胎發(fā)育的質(zhì)量,比如添加表皮生長因子、類胰島素一號(hào)生長因子等能夠增加囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)數(shù)量,提高囊胚率。CNP不僅具有調(diào)節(jié)水鈉轉(zhuǎn)運(yùn)的功能,而且還能調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)中水通道蛋白的表達(dá)。在小鼠妊娠過程中,在子宮中能檢測(cè)到CNP特異性的高表達(dá)。鑒于囊胚形成依賴于水分轉(zhuǎn)運(yùn),因此筆者推測(cè)CNP可能影響囊胚腔的形成。最終的試驗(yàn)結(jié)果顯示CNP對(duì)胚胎體外發(fā)育表現(xiàn)為廣泛的抑制作用,并且主要體現(xiàn)在對(duì)卵裂的抑制上。但本研究尚不能排除CNP具有促進(jìn)囊胚成腔的可能性,因?yàn)镃NP對(duì)卵裂的抑制作用足以掩蓋CNP對(duì)囊胚腔形成的促進(jìn)作用。盡管CNP不具有提高胚胎體外發(fā)育效率的潛力,但本研究的意義在于闡明了CNP在早期胚胎發(fā)育過程中的作用,它可以作為一種有效的胚胎發(fā)育抑制劑。需要指出的是,本研究是采用外源添加的方式來評(píng)估CNP對(duì)體外胚胎發(fā)育的影響,并不清楚CNP信號(hào)缺失后胚胎所受到的影響。這一問題有待在未來的研究中借助基因編輯技術(shù)進(jìn)行深入探討。

    本研究證實(shí)CNP不僅阻礙小鼠2細(xì)胞向4細(xì)胞胚胎的轉(zhuǎn)變,還抑制囊胚腔的形成與擴(kuò)張,降低囊胚質(zhì)量。說明CNP是一種早期胚胎發(fā)育的有效抑制分子。

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