畜肉中匹莫林的測(cè)定

勇艷華

摘 要：本文建立了檢測(cè)畜肉中匹莫林的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。采用乙腈提取，正己烷脫脂，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，外標(biāo)法定量?？疾炝朔椒ǖ亩肯蕖?biāo)準(zhǔn)曲線線性、方法精密度等。結(jié)果表明，匹莫林濃度在1～200 μg/L線性良好，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6，定量限為2.0 μg/kg，3個(gè)加標(biāo)水平2.0 μg/kg、4.0 μg/kg、10.0 μg/kg，平均回收率為70.8%～85.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%～5.4%。本方法具有前處理簡(jiǎn)單、精密度高、定量限低等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿(mǎn)足畜肉中匹莫林的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：畜肉;匹莫林;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

Determination of Pimorin in Animal Meat

YONG Yanhua

（Dalian Center for Certification and Food and Drug Control， Dalian 116630， China）

Abstract： A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for determination of pimorin in meat was established. It is extracted by acetonitrile， degreased by n-hexane， determinated by liquid chromatography-tandem mass spectrometry， external standard method. The quantitative limit， linearity of standard curve and precision of the method were investigated. The results showed that the concentration of pimolin ranged from 1 to 200 μg/L has good linearity， the correlation coefficient is r=0.999 6， and the limit of quantitation is?2.0 μg/kg， 3 spiked levels were 2.0 μg/kg， 4.0 μg/kg， 10.0 μg/kg， the average recovery was 70.8%～85.3%， and the relative standard deviation was 3.0%～5.4%. The method has the advantages of simple pretreatment， high precision and low limit of quantitation， and can be used for the determination of pimolin in animal meat.

Keywords： animal meat; pimorelin; liquid chromatography-tandem mass spectrometry

匹莫林化學(xué)名稱(chēng)為2-亞氨基-5-苯基-4-惡唑烷酮，是一種中樞神經(jīng)興奮藥物。通過(guò)提高中樞去甲腎上腺素的含量達(dá)到中樞興奮的作用，其興奮作用為咖啡因的5倍。雖然農(nóng)業(yè)部176號(hào)公告《禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用的藥物品種目錄》中禁止匹莫林在飼料和動(dòng)物飲用水中使用，但仍有飼養(yǎng)者在牲畜飼養(yǎng)過(guò)程中違法使用匹莫林，導(dǎo)致匹莫林在畜肉中殘留，對(duì)人體健康產(chǎn)生危害。匹莫林的不良反應(yīng)主要包括對(duì)肝功能有損害，從肝酶無(wú)癥狀可逆性升高至肝炎、黃疸、肝功能衰竭;可引發(fā)再生障礙性貧血;對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有損傷;刺激胃腸道，導(dǎo)致惡心、胃痛;長(zhǎng)時(shí)間使用可抑制人體生長(zhǎng)[1]。因此，建立一種準(zhǔn)確快速檢測(cè)畜肉中匹莫林殘留的分析方法迫在眉睫，不僅可以打擊違法使用匹莫林的行為，還可為保護(hù)消費(fèi)者健康提供技術(shù)支撐。

目前，報(bào)道的興奮劑相關(guān)檢測(cè)方法有膠體金試紙條法[2]、酶聯(lián)免疫法[3-5]、化學(xué)發(fā)光免疫分析[6]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法[7]、毛細(xì)管電泳法[8]、高效液相色譜法[9-11]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[12-14]、氣相色譜法[15]、氣質(zhì)法[16-17]和高分辨質(zhì)譜法[18-19]，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是最常用的方法。文獻(xiàn)中檢測(cè)匹莫林的基質(zhì)為尿液和飼料，但畜肉中匹莫林的檢測(cè)暫無(wú)報(bào)道。本文采用乙腈提取，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，建立了畜肉中匹莫林的測(cè)定方法。該方法前處理簡(jiǎn)單，精密度高，定量限低，能滿(mǎn)足畜肉中匹莫林的測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)匹莫林（Pemoline），CAS登錄號(hào)2152-34-3，中國(guó)食品藥品檢定研究院生產(chǎn)的對(duì)照品;甲醇、乙腈、正己烷和甲酸，均為色譜純;氯化鈉，分析純;實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（1290/Agilent 6495，美國(guó)Agilent公司）;均質(zhì)機(jī)（IKA）;渦旋混合器（IKA）;超聲波清洗器（科導(dǎo)）;CR21N立式大容量高速離心機(jī)（日本Hiachi公司）;氮吹儀（安譜）賽多利斯全自動(dòng)超純水機(jī)（德國(guó)Sartorius公司）;Agilent poroshell 120 EC-C18色譜柱（50 mm×4.6 mm，2.7 μm，美國(guó)Agilent公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

稱(chēng)取2.5 g（精確到0.01 g）混合均勻的樣品于50 mL離心管中，加入2 mL水，均質(zhì)1 min，加入5 mL乙腈，渦旋混勻1 min，超聲提取20 min，加入2 mL正己烷，加入1 g NaCl，渦旋混勻1 min，12 000 r/min離心5 min，移取2 mL上層提取液氮吹至近干，準(zhǔn)確加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為10%乙腈溶解，渦旋混勻1 min，過(guò)0.22 μm濾膜，待液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱(chēng)取匹莫林對(duì)照品約10 mg（精確至0.1 mg）于小燒杯中，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，得到濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃冷凍保存。準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL于100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到濃度為1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于4 ℃冷藏保存。準(zhǔn)確移取10 μL、100 μL、500 μL、1 000 μL和2 000 μL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別置于10 mL容量瓶中，10%乙腈定容至刻度，得到濃度為1 μg/L、10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L和200 μg/L匹莫林系列標(biāo)準(zhǔn)上機(jī)溶液。

1.3.3 添加回收實(shí)驗(yàn)

以不含匹莫林的空白畜肉為基質(zhì)，添加適量濃度為1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，渦旋混勻1 min，靜置1 h，按1.3.1樣品前處理方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：Agilent poroshell 120 EC-C18（50 mm×4.6 mm，2.7 μm）;柱溫：35 ℃;流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水（體積分?jǐn)?shù)），B為0.1%甲酸乙腈（體積分?jǐn)?shù)）;梯度洗脫程序：0～1.0 min，90%A，1.0～4.0 min，90%～0%A;4.0～5.0 min，0%A;5.1～7.0 min，90%A。流速：0.3 mL/min;進(jìn)樣體積：2 μL。

（2）質(zhì)譜條件。電噴霧離子源（ESI）;掃描方式：正離子掃描;毛細(xì)管電壓：4 000 V;監(jiān)測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple Reaction Monitoring，MRM）;離子源溫度：200 ℃;去溶劑氣溫度：250 ℃;去溶劑氣：氮?dú)?2 L/min;錐孔氣：氮?dú)?1 L/min。其他參數(shù)詳見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取試劑的選擇

匹莫林難溶于水、乙醚、氯仿、丙酮、苯和稀鹽酸，溶于無(wú)水乙醇、丙二醇、甲醇和丙酮，易溶于堿性溶液。本實(shí)驗(yàn)考察甲醇和乙腈提取效果，由于畜肉中含有大量蛋白質(zhì)和脂肪，用甲醇提取還需進(jìn)一步用固相萃取小柱凈化，前處理相對(duì)煩瑣;但乙腈對(duì)蛋白有沉淀作用，用乙腈作為提取試劑，正己烷除脂肪，前處理步驟簡(jiǎn)單，除蛋白和脂肪效果較好，因此選擇乙腈作為提取試劑。

2.2 儀器條件的建立

匹莫林的結(jié)構(gòu)決定了可以在反相色譜上獲得分離，故采用C18色譜柱進(jìn)行分離，流動(dòng)相乙腈-水-甲酸混合梯度洗脫。優(yōu)化了質(zhì)譜檢測(cè)中碰撞能量、脫溶劑氣流速和溫度、錐孔氣流速等參數(shù)，確定靈敏度最高、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性最好的選擇性提取離子作為定量離子，次之的作為定性離子。

2.3 線性范圍及檢出限

匹莫林標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在1～200 μg/L濃度與峰面積呈線性相關(guān)。匹莫林線性方程為Y=5 594.264 692X-

5 371.773 294，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6。以豬肉、牛肉、羊肉為基質(zhì)，定量向其中添加匹莫林標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.1樣品前處理方法提取測(cè)定后，質(zhì)譜峰信噪比≥10

時(shí)的添加量確定為本方法的定量限，定量限為2.0 μg/kg。

2.4 回收率和精密度

以不含匹莫林的豬肉、牛肉、羊肉為空白基質(zhì)，將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按2.0 μg/kg、4.0 μg /kg和10.0 μg /kg

3個(gè)添加濃度加入空白基質(zhì)中，考察平均回收率

及6次平行實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果如表2所示。平均回收率為70.8%～85.3%，RSD≤5.4%。對(duì)豬、牛、羊肉按照本方法進(jìn)行測(cè)試，未發(fā)現(xiàn)有本底干擾。

3 結(jié)論

本文建立了檢測(cè)畜肉中匹莫林殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，匹莫林濃度在1～200 μg/L線性良好，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6，定量限為2.0 μg/kg，3個(gè)加標(biāo)水平2.0 μg/kg、4.0 μg/kg、10.0 μg/kg，平均回收率為70.8%～85.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%～5.4%，此方法快速、高效、準(zhǔn)確且便于操作，可用于畜肉中匹莫林殘留的日常檢測(cè)。

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