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    低磁場(chǎng)冷凍對(duì)鰱魚(yú)肌原纖維蛋白的作用

    2022-07-06 08:09:05逯曉燕劉麗黃文哲叢?;?/span>李昊
    肉類(lèi)研究 2022年6期
    關(guān)鍵詞:鰱魚(yú)結(jié)構(gòu)

    逯曉燕 劉麗 黃文哲 叢?;? 李昊

    摘 要:采用2 mT低磁場(chǎng)(low magnetic field,LMF)冷凍、0 mT磁場(chǎng)(no magnetic field,NMF)冷凍和常規(guī)冷凍(conventional freezing,CF)技術(shù)對(duì)3 組鰱魚(yú)肌原纖維蛋白進(jìn)行為期28 d的冷凍實(shí)驗(yàn)。通過(guò)表面疏水性、巰基含量、溶解度、濁度、熱穩(wěn)定性、傅里葉變換紅外光譜、內(nèi)源性熒光光譜和紫外吸收光譜各項(xiàng)指標(biāo)考察蛋白的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)變化。結(jié)果表明:施加低磁場(chǎng)冷凍可以抑制蛋白聚集和內(nèi)部疏水基團(tuán)的暴露,且能抑制α-螺旋的展開(kāi),減弱α-螺旋向β-折疊轉(zhuǎn)變的能力,并維持良好的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性;CF組的蛋白總巰基含量、溶解度和濁度與NMF組相比無(wú)顯著差異,由于冷凍溫度較低,對(duì)蛋白聚集和內(nèi)部疏水基團(tuán)的暴露有一定的抑制作用,同時(shí)也使得蛋白結(jié)構(gòu)變得松散不穩(wěn)定;與CF組相比,LMF組同樣顯示出對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能有較好的保護(hù)和改善作用。總體來(lái)說(shuō),低磁場(chǎng)冷凍可以抑制肌原纖維蛋白變性并維持良好的結(jié)構(gòu)和功能,且與常規(guī)冷凍(-30 ℃)相比,低磁場(chǎng)冷凍(-20 ℃、2 mT)可以節(jié)約10 ℃的冷凍溫差,預(yù)測(cè)其具有一定的節(jié)能潛力。

    關(guān)鍵詞:低磁場(chǎng);冷凍;鰱魚(yú);肌原纖維蛋白;結(jié)構(gòu);功能性質(zhì)

    Effect of Low Magnetic Field Freezing on Structural and Functional Properties of Myofibrillar

    Proteins in Silver Carp Muscle

    LU Xiaoyan1,2, LIU Li3, HUANG Wenzhe4, CONG Haihua1,2,*, LI Hao5,*

    (1.College of Food Science and Engineering, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China; 2.Collaborative Innovation Center of Seafood Deep Processing, Dalian 116034, China; 3.College of Mechanical and Electronic Engineering,

    Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 4.INDUC Scientific Co. Ltd., Wuxi 214000, China;

    5.Changchun Haoyue Group, Changchun 130062, China)

    Abstract: In this study, 2 mT low magnetic field (LMF), 0 mT magnetic field (NMF), and conventional freezing (CF) were used to conduct a 28-day freezing experiment on myofibrillar proteins of silver carp muscle. Changes in the structure and functional properties of the proteins were investigated by measuring surface hydrophobicity, sulfhydryl content, solubility, turbidity, thermal stability, Fourier transform infrared (FTIR) spectra, endogenous fluorescence spectra, and ultraviolet (UV) absorption spectra. The results showed that the application of LMF freezing could inhibit protein aggregation, exposure of interior hydrophobic groups, and α-helix unfolding, weaken α-helix to β-sheet transition and maintain good secondary and tertiary structure stability. There was no significant difference in total sulfhydryl content, solubility, or turbidity between the CF and NMF groups. As it provided lower freezing temperatures, CF inhibited the aggregation of proteins and the exposure of interior hydrophobic groups, but simultaneously made the protein structure sparse and unstable. Compared with CF, LMF freezing could better protect and improve protein structure and function. Overall, LMF freezing can inhibit protein denaturation and maintain good protein structure and function. Compared with CF (?30 ℃), LMF freezing (?20 ℃, 2 mT) has the potential for energy saving.8BFDD439-A2BD-4533-B3C1-C12D320B438A

    Keywords: low magnetic field; freezing; silver carp; myofibrillary protein; structure; functional properties

    DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20220505-052

    中圖分類(lèi)號(hào):TS254.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1001-8123(2022)06-0001-08

    引文格式:

    逯曉燕, 劉麗, 黃文哲, 等. 低磁場(chǎng)冷凍對(duì)鰱魚(yú)肌原纖維蛋白的作用[J]. 肉類(lèi)研究, 2022, 36(6): 1-8. DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20220505-052.? ? http://www.rlyj.net.cn

    LU Xiaoyan, LIU Li, HUANG Wenzhe, et al. Effect of low magnetic field freezing on structural and functional properties of myofibrillar proteins in silver carp muscle[J]. Meat Research, 2022, 36(6): 1-8. DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20220505-052.? ? http://www.rlyj.net.cn

    鰱魚(yú)(Hypophthalmicthys molitrix)是一種廣泛養(yǎng)殖的淡水魚(yú),2021年產(chǎn)量達(dá)到381.29 萬(wàn)t[1],是新興的魚(yú)糜加工原料。鰱魚(yú)肌原纖維蛋白(myofibrillary protein,MP)

    是魚(yú)肉中最重要的蛋白質(zhì),約占總蛋白含量的50%~55%[2],在加工貯藏過(guò)程中,延緩MP變性很重要。冷凍和冷藏是長(zhǎng)期保存魚(yú)糜的重要方法[3],因?yàn)榈蜏貢?huì)抑制微生物生長(zhǎng),減緩酶的活性,并保留原始風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)成分[4]。而在實(shí)際的冷凍過(guò)程中形成的冰晶會(huì)刺穿細(xì)胞,導(dǎo)致品質(zhì)劣化,如持水力下降、汁液損失嚴(yán)重和蛋白變性等[5],這會(huì)對(duì)最終產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響,所以亟需新的冷凍方案來(lái)優(yōu)化。

    低磁場(chǎng)冷凍是近年來(lái)新興的冷凍方式,已經(jīng)逐漸應(yīng)用于果蔬、畜產(chǎn)品、微生物和醫(yī)學(xué)材料的冷凍,其作用方式是將小的水分子團(tuán)或單個(gè)分子轉(zhuǎn)變?yōu)槲⒈螒B(tài),并加速通過(guò)冷凍相變階段,保護(hù)細(xì)胞免受冰晶損傷[6]。磁場(chǎng)冷凍最初被用于保存生物細(xì)胞和器官等醫(yī)療用途,例如:0.01 mT磁場(chǎng)、15 min保持時(shí)間和-30 ℃冷凍溫度下,全牙細(xì)胞冷凍保存1 年后并未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞損傷[7];Lin Chunyen等[8]的研究小組在施加0.8 T的靜磁場(chǎng)下,先在-5 ℃條件下保持10 min,之后以1 ℃/min的速率連續(xù)冷卻到-55 ℃,最后在-80 ℃的冷凍機(jī)中貯藏24 h,結(jié)果發(fā)現(xiàn),可使凍融紅細(xì)胞的相對(duì)存活率提高20%。近幾年低磁場(chǎng)在食品冷凍領(lǐng)域被廣泛研究及應(yīng)用,例如:在冷凍過(guò)程中,對(duì)牛肉施加磁場(chǎng)使其發(fā)生共振干擾了水分子結(jié)晶,顯著降低了冰晶的增長(zhǎng)速率和肉品的解凍損失[9];施加2 mT的靜磁場(chǎng),在-20 ℃條件下冷凍48 h后進(jìn)行凍融實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)其可以顯著保護(hù)冷凍面團(tuán)免受冷凍損傷,使得谷蛋白結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定(解聚率降低24.26%)[10];使用15.98 mT的永久磁場(chǎng)處理MP,發(fā)現(xiàn)其成核溫度、相變時(shí)間和過(guò)冷時(shí)間分別降低2.79 ℃、1.76 min和0.80 min,這均證明了磁場(chǎng)有利于提高食品質(zhì)量和降低能耗[11]。

    本研究主要通過(guò)測(cè)定表面疏水性、巰基含量、溶解度、濁度、熱穩(wěn)定性、傅里葉變換紅外光譜、內(nèi)源熒光光譜和紫外吸收光譜,研究低磁場(chǎng)冷凍對(duì)鰱魚(yú)MP功能和結(jié)構(gòu)變化的影響,為低磁場(chǎng)技術(shù)在食品冷凍和保鮮中的應(yīng)用、進(jìn)一步研究該技術(shù)與保鮮劑、抗凍劑等協(xié)同作用及相關(guān)產(chǎn)品的消化特性提供理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    鮮活白鰱魚(yú),購(gòu)于遼寧省大連市熟食品交易中心。

    三羥甲基氨基甲烷(tris-hydroxy-methy-lamino-methane,Tris) 青島捷世康生物科技有限公司;氯化鈉 遼寧泉瑞試劑有限公司;尿素、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;8-苯胺基-1-萘磺酸鈉(8-aniline-1-naphthalenesulfonic acid sodium,ANS)、5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(5,5-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB) 上海麥克林生化科技有限公司;乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetie acid,EDTA)

    天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;乙醇 天津北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司;溴化鉀(光譜純) 天津大茂化學(xué)試劑廠;以上試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    BL-310電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限

    公司;UV-9000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;MFl-F1磁場(chǎng)冷凍冷藏箱 英都斯特(無(wú)錫)感應(yīng)科技有限公司;TD5A-WS立式高速冷凍離心機(jī)

    湖南赫西儀器裝備有限公司;PHSJ-4F精密數(shù)顯pH計(jì) 山東晨拓科學(xué)儀器有限公司;Synergy H1/H1M酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司;F-2700熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司;SL-Ⅲ數(shù)控層析冷柜、Scientz-30D真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝科技股份有限公司;Q20差示掃描量熱儀 美國(guó)TA儀器公司;NEXUS670紅外光譜儀 美國(guó)PerkinElmer公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司; BCD-336WDPC冷藏箱 青島海爾股份有限公司。8BFDD439-A2BD-4533-B3C1-C12D320B438A

    1.3 方法

    1.3.1 鰱魚(yú)MP的提取

    參考李學(xué)鵬等[12]的方法進(jìn)一步修改。選取鰱魚(yú)背部白肉,加入4 倍體積10 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.2、4 ℃),均質(zhì)15 s后于5 000 r/min離心15 min,取沉淀加入4 倍體積10 mmol/L Tris-HCl緩沖液(含0.6 mol/L NaCl、pH 7.2、4 ℃)混勻,均質(zhì)10 s后于4 500 r/min離心20 min,取上清液用雙縮脲法測(cè)定MP質(zhì)量濃度。

    1.3.2 樣品冷凍處理

    將提取的鰱魚(yú)MP使用MFl-F1磁場(chǎng)冷凍冷藏箱采用2 mT低磁場(chǎng)(low magnetic field,LMF)結(jié)合-20 ℃冷凍,記為L(zhǎng)MF組,0 mT磁場(chǎng)(no magnetic field,NMF)結(jié)合-20 ℃冷凍,記為NMF組,作為空白對(duì)照,用BCD-336WDPC冷藏箱-30 ℃常規(guī)冷凍(conventional freezing,CF),記為CF組,作為陽(yáng)性對(duì)照,冷凍時(shí)間為28 d。表1為不同組別MP的凍藏條件。在測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)之前,樣品在4 ℃解凍過(guò)夜。

    1.3.3 表面疏水性和巰基含量測(cè)定

    表面疏水性的測(cè)定參考Shui Shanshan等[13]的方法進(jìn)一步修改。制備質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的MP溶液,取2 mL溶液與10 ?L ANS(含10 mmol/L ANS、20 mmol/L Tris,pH 7.5)充分混勻,避光冷藏(4 ℃)10 min。設(shè)置參數(shù):激發(fā)波長(zhǎng)375 nm,發(fā)射波長(zhǎng)485 nm,增益50。以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,斜率代表表面疏水性。

    總巰基含量的測(cè)定參考Zhang Bin等[14]的方法進(jìn)一步修改。取5 mg/mL的MP溶液0.5 mL,加入4.5 mL緩沖液(含0.2 mol/L Tris、8 mol/L尿素、2 g/100 mL SDS,10 mmol/L EDTA,pH 6.8),取4 mL混合液與0.4 mL DTNB溶液混合,將溶液40 ℃水浴25 min后在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

    活性巰基含量的測(cè)定參考Hu Xin等[15]的方法進(jìn)一步修改。取0.5 mL 5 mg/mL MP溶液與4.5 mL緩沖液(含0.2 mol/L Tris、10 mmol/L EDTA,pH 6.8)混合,取2.5 mL混合液加入0.25 mL DTNB溶液,1 h避光反應(yīng)(4 ℃)后在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。總巰基含量、活性巰基含量和二硫鍵含量分別按式(1)~(2)[16]計(jì)算。

    (1)

    (2)

    式中:A為除去空白試劑后樣品于412 nm波長(zhǎng)處吸光度;n為稀釋倍數(shù);ρ為MP質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

    1.3.4 溶解度和濁度測(cè)定

    參考Amiri等[17]的方法,取0.5 mL 5 mg/mL的MP溶液,用雙縮脲法測(cè)定5 500 r/min、15 min離心前后的質(zhì)量濃度。溶解度按式(3)計(jì)算。

    (3)

    式中:ρ0為離心后上清液MP質(zhì)量濃度/(mg/mL);ρ1為離心前MP質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

    參考嚴(yán)紅波等[18]的方法進(jìn)一步修改。將1 mg/mL的MP溶液混勻,靜置20 min,在340 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度表示濁度。

    1.3.5 熱穩(wěn)定性測(cè)定

    參考Liu Shulai等[19]的方法進(jìn)一步修改。取

    10 mg/mL的MP溶液,置于鋁制坩堝進(jìn)行稱(chēng)量(樣品稱(chēng)量范圍為12.0~18.0 mg),后壓蓋密封,以空坩堝為空白,在40~80 ℃溫度掃描范圍下,以10 ℃/min的升溫速率進(jìn)行掃描。

    1.3.6 傅里葉變換紅外光譜測(cè)定

    參考藍(lán)蔚青等[20]的方法進(jìn)一步修改。將0.002 g凍干樣品與0.1 g干燥后的固體溴化鉀混合。設(shè)置參數(shù):分辨率4 cm-1,掃描范圍500~4 000 cm-1,掃描次數(shù)40 次。對(duì)混合物進(jìn)行光譜分析,用Peakfit軟件對(duì)酰胺Ⅰ帶(1 600~1 700 cm-1)進(jìn)行擬合,計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量。

    1.3.7 內(nèi)源性熒光光譜和紫外吸收光譜測(cè)定

    參考Niu Jianzhen等[21]的方法進(jìn)一步修改。使用熒光分光光度計(jì)對(duì)1 mg/mL MP溶液進(jìn)行掃描,設(shè)置參數(shù):激發(fā)波長(zhǎng)295 nm,掃描范圍300~450 nm。

    參考Qiu Chunjiang等[22]的方法進(jìn)一步修改。使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)1 mg/mL MP溶液進(jìn)行掃描,以

    Tris-HCl緩沖液(含0.6 mol/L NaCl,pH 7.2)作為對(duì)照,掃描范圍190~700 nm。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    所有指標(biāo)數(shù)據(jù)均進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn),結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用Origin 2021軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)繪圖。采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,用Duncans法分析數(shù)據(jù)間差異顯著性,P<0.05表示差異顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同冷凍處理對(duì)MP表面疏水性和巰基含量的影響

    表面疏水性是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)變性的一個(gè)重要指標(biāo),可以反映蛋白質(zhì)中疏水氨基酸殘基含量[23]。由圖1A可知:LMF組的表面疏水性顯著低于NMF組(P<0.05),說(shuō)明凍藏期間施加低磁場(chǎng)可以顯著抑制蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)的暴露,其原因可能是磁場(chǎng)條件下,水分子傾向于重新定向和有序排列,從而在冷凍過(guò)程中實(shí)現(xiàn)固定傳熱,形成細(xì)小、均勻、光滑的冰晶,保護(hù)細(xì)胞免受破壞,從而使疏水基團(tuán)的暴露減少[10,24];CF組的表面疏水性顯著低于NMF組(P<0.05),說(shuō)明相同冷凍條件下,冷凍溫度越低,抑制蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)暴露的能力越大,這一發(fā)現(xiàn)與李學(xué)鵬等[12]的研究相似,在-80 ℃凍藏條件下,大黃魚(yú)的表面疏水性緩慢增加,且比-18 ℃的上升幅度小;LMF組(-20 ℃)與CF組(-30 ℃)并無(wú)顯著差異,說(shuō)明針對(duì)MP的表面疏水性,2 mT的低磁場(chǎng)作用可以節(jié)約10 ℃的冷凍溫差,達(dá)到減少能源消耗的目的,這可能是由于低磁場(chǎng)能夠加速樣品冷凍降溫過(guò)程導(dǎo)致的[25]。8BFDD439-A2BD-4533-B3C1-C12D320B438A

    小寫(xiě)字母不同,表示不同組間差異顯著(P<0.05)。圖2~4同。

    巰基被認(rèn)為是蛋白質(zhì)中最具活性的官能團(tuán)之一。隨著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開(kāi),埋入蛋白質(zhì)中的巰基可能暴露在表面,并被氧化成二硫鍵,導(dǎo)致巰基含量降低[26]。由圖1B可知,LMF組的總巰基和二硫鍵含量顯著高于NMF組(P<0.05),分別提高21.3%和24.4%,活性巰基含量差異不顯著。Wu Di等[27]發(fā)現(xiàn),3 mT直流磁場(chǎng)可以使低鹽MP凝膠的總巰基含量從1.58 μmol/g顯著增加到3.21 μmol/g

    (P<0.05),其原因是低磁場(chǎng)破壞了蛋白質(zhì)分子中原有的二硫鍵,分子間二硫鍵的斷裂使一些碎片分子聚集和重排,最后使得總巰基含量增加。最初埋藏在MP中的活性巰基在磁場(chǎng)作用下逐漸暴露到MP表面,導(dǎo)致活性巰基含量升高,然而也不排除分子間二硫鍵斷裂的可能性[28];NMF組的總巰基含量略低于CF組,活性巰基含量顯著高于CF組(P<0.05),二硫鍵含量顯著降低

    (P<0.05),說(shuō)明常規(guī)冷凍處理可以使得大量的活性巰基被氧化轉(zhuǎn)變?yōu)槎蜴I,這是因?yàn)榈蜏乩鋬鲆鸬牡鞍踪|(zhì)濃縮效應(yīng)增加了分子間二硫鍵的交換反應(yīng),最終使得蛋白質(zhì)變性[29];LMF組的總巰基和活性巰基含量顯著高于CF組(P<0.05),二硫鍵含量明顯高于CF組,說(shuō)明低磁場(chǎng)可以減緩活性巰基向二硫鍵轉(zhuǎn)變,延緩MP變性??傊?,低磁場(chǎng)會(huì)減小MP活性巰基含量的下降程度,從而抑制氧化,減少二硫鍵生成,使得MP變性程度減小。

    2.2 不同冷凍處理對(duì)MP溶解度和濁度的影響

    溶解度是蛋白質(zhì)重要的功能性質(zhì)之一,蛋白質(zhì)的變性和聚集會(huì)影響其溶解度的大小[30]。由圖2A可知:LMF組的MP溶解度顯著高于NMF組(P<0.05),說(shuō)明低磁場(chǎng)冷凍延緩了MP溶解度的降低,改善了MP的功能性質(zhì);CF組略高于NMF組,這與Badii等[31]的研究結(jié)果一致:低溫可以使蛋白質(zhì)溶解度下降速率減慢;LMF組與CF組相比,溶解度顯著增加1.04%(P<0.05),說(shuō)明低磁場(chǎng)會(huì)促進(jìn)MP溶解,這一結(jié)果與表面疏水性的結(jié)果一致。總的來(lái)說(shuō),低磁場(chǎng)冷凍會(huì)抑制MP中的疏水基團(tuán)從內(nèi)部暴露,增加了表面疏水性,減緩其變性程度,從而使得MP溶解度升高[32]。

    濁度是衡量MP聚集程度的指標(biāo)[18]。由圖2B可知:LMF組的濁度顯著低于NMF組(P<0.05),降低4.44%,說(shuō)明低磁場(chǎng)可以延緩MP氧化,延緩聚集的形成;CF組和NMF組的濁度差異不顯著,但CF組的濁度更大,冷凍引起的MP氧化會(huì)導(dǎo)致MP中的官能團(tuán)融合,從而形成聚集,使得濁度增加[33],說(shuō)明-30 ℃的低溫加劇了MP的聚集反應(yīng);與CF組(-30 ℃)相比,LMF組(-20 ℃)的濁度顯著降低(P<0.05),這一結(jié)果與溶解度結(jié)果一致,說(shuō)明低磁場(chǎng)可以促進(jìn)MP溶解,延緩MP的聚集,且效果非常明顯。

    2.3 不同冷凍處理對(duì)MP熱穩(wěn)定性的影響

    Td和ΔH是蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的重要指標(biāo)[34]。由表2可知,LMF組的Td顯著高于NMF組和CF組(P<0.05),分別增加20.13%和32.61%,說(shuō)明低磁場(chǎng)可以顯著提高M(jìn)P的熱穩(wěn)定性(P<0.05)。由于施加低磁場(chǎng)會(huì)使分子內(nèi)氫鍵受到影響,水團(tuán)破碎,從而造成自由水簇的減小,增加非凍結(jié)合水含量,從而保持其良好的熱穩(wěn)定性[35-36]。NMF組的Td顯著高于CF組(P<0.05),這與Qian Shuyi等[37]的研究相反,其認(rèn)為冷凍溫度越低,Td越高,原因可能是設(shè)備不同所造成的誤差,還需進(jìn)一步研究。此外,ΔH也可表示蛋白質(zhì)變性所需的能量[34]。NMF組的ΔH顯著高于LMF和CF組(P<0.05),說(shuō)明NMF組的抗變性能力較強(qiáng),所需的能量較少;LMF組和CF組的ΔH無(wú)顯著差異,表明低磁場(chǎng)冷凍和常規(guī)冷凍在誘導(dǎo)蛋白變性時(shí)需要相似的能量,而在這2 種冷凍方式下,LMF會(huì)節(jié)省10 ℃的冷凍溫差,從而減少能源消耗,因此,選擇低磁場(chǎng)更符合當(dāng)下市場(chǎng)的要求。

    2.4 不同冷凍處理對(duì)MP傅里葉變換紅外光譜的影響

    傅里葉變換紅外光譜是觀察蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的重要方法[38]。蛋白質(zhì)的酰胺鍵有幾種不同的振動(dòng)模式,其中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲)主要由酰胺Ⅰ帶(1 600~1 700 cm-1)引起C=O伸縮振動(dòng)[39]。鰱魚(yú)MP在500~4 000 cm-1的紅外光譜如圖3A所示。對(duì)不同冷凍處理的MP紅外光譜進(jìn)行擬合,根據(jù)α-螺旋(1 650~1 660 cm-1)、β-折疊(1 600~1 640 cm-1)、β-轉(zhuǎn)角(1 660~1 700 cm-1)和無(wú)規(guī)卷曲(1 640~1 650 cm-1)的特征峰[20]識(shí)別MP經(jīng)冷凍后的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量,結(jié)果如圖3B所示。已有文獻(xiàn)報(bào)道,α-螺旋結(jié)構(gòu)主要由多肽鏈的羰基氧(-CO)和氨基氫(-NH)之間的氫鍵維持[40],這些氫鍵會(huì)受到冷凍過(guò)程中物理效應(yīng)(水分遷移、蛋白質(zhì)的機(jī)械損傷和冰結(jié)晶)的影響而被干擾或破壞,使得蛋白質(zhì)構(gòu)象不穩(wěn)定[41]。

    由圖3A可知:1 645 cm-1附近的特征吸收峰是酰胺Ⅰ帶C=O的伸縮振動(dòng),1 548 cm-1附近的特征吸收峰是酰胺Ⅱ帶C-N的伸縮和C-H的彎曲[42];對(duì)比NMF組的紅外譜圖,經(jīng)低磁場(chǎng)處理后的MP紅外光譜中特征峰明顯增強(qiáng),表明低磁場(chǎng)可以保護(hù)MP結(jié)構(gòu)免受破壞并抑制二級(jí)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化。由圖3B可知:與NMF組相比,LMF組的α-螺旋含量相對(duì)較高,而β-折疊含量較低,且

    β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲含量相同。這與Zhou Hongling等[10]研究的直流磁場(chǎng)冷凍對(duì)面團(tuán)中谷蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果相似,證明低磁場(chǎng)能夠抑制蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)的展開(kāi),從而減弱其轉(zhuǎn)換成β-折疊結(jié)構(gòu)的作用,保持MP在冷凍期間的二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。NMF組的α-螺旋含量高于CF組,提高22%;CF組的β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲含量總體上高于LMF組,并且這2 種結(jié)構(gòu)含量代表著蛋白質(zhì)的聚集程度[43],說(shuō)明經(jīng)常規(guī)冷凍處理后,MP結(jié)構(gòu)變得松散且不穩(wěn)定,而低磁場(chǎng)冷凍可以更好維持MP二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。這些結(jié)果表明,使用低磁場(chǎng)對(duì)MP進(jìn)行冷凍處理,可以減少M(fèi)P的損傷,抑制α-螺旋結(jié)構(gòu)的展開(kāi),8BFDD439-A2BD-4533-B3C1-C12D320B438A

    證明MP變性程度更小,構(gòu)象更穩(wěn)定。且經(jīng)過(guò)低磁場(chǎng)冷凍處理的MP氧化程度降低,活性巰基含量的變化同樣證實(shí)了這一點(diǎn)。猜測(cè)由于低磁場(chǎng)改變了冰晶的形態(tài),抑制了冰晶的生長(zhǎng)[25],減少了冷凍過(guò)程中冰結(jié)晶的干擾破壞[41],維持一定的二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,但還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

    2.5 不同冷凍處理對(duì)MP內(nèi)源性熒光和紫外吸收光譜的影響

    熒光強(qiáng)度通常受熒光能量照射影響,主要通過(guò)芳香族氨基酸(主要是色氨酸)的照射量來(lái)確定MP的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化[44]。有研究[45]報(bào)道,鹽溶性MP的冷凍變性是因其分子間共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵的形成而導(dǎo)致的聚集變性。

    由圖4A可知,NMF、LMF和CF組的最大發(fā)射波長(zhǎng)并沒(méi)有發(fā)生移動(dòng),說(shuō)明在不同的冷凍方式下,色氨酸所處的極性環(huán)境并不會(huì)發(fā)生變化。由圖4B可知:NMF、LMF和CF組的最大熒光強(qiáng)度分別為211.93、210.6和285.67;LMF組的最大熒光強(qiáng)度與NMF組并無(wú)顯著差異,說(shuō)明無(wú)論低磁場(chǎng)是否存在都顯示出較低的熒光強(qiáng)度;與CF組相比,LMF和NMF組的熒光強(qiáng)度顯著降低(P<0.05),分別下降35.6%和34.8%,說(shuō)明不同的冷凍溫度和低磁場(chǎng)冷凍均可延緩MP的聚集變性,但低磁場(chǎng)的效果更明顯。

    色氨酸和酪氨酸的殘基側(cè)鏈可以在紫外吸收光譜中產(chǎn)生相應(yīng)的吸收峰[46]。由圖4C可知:MP在270~280 nm附近有特征吸收峰出現(xiàn),LMF組和NMF組的吸收強(qiáng)度并無(wú)明顯差異;與CF組相比,LMF組和NMF組的吸收強(qiáng)度均降低,一方面是由于冷凍溫度所引起的,冷凍過(guò)程中MP聚集體的形成使暴露在外面的顯色氨基酸基團(tuán)再次被隱藏,導(dǎo)致NMF組的紫外吸收強(qiáng)度明顯降低[46],且有研究表明,冷凍產(chǎn)生的冰晶會(huì)破壞蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu),將部分埋藏的氨基酸殘基暴露[47],導(dǎo)致吸收強(qiáng)度升高,因此,猜測(cè)另一方面的原因可能是磁場(chǎng)冷凍導(dǎo)致水分子傾向于重新有序排列,形成的冰晶可以減少對(duì)細(xì)胞的

    破壞[10,24],使氨基酸基團(tuán)減少暴露,導(dǎo)致LMF組的吸收強(qiáng)度降低,表面疏水性的結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。此外,LMF組的下降幅度較小,說(shuō)明低磁場(chǎng)冷凍能維持MP三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,氧化過(guò)程中巰基含量的降低也證明了低磁場(chǎng)可以維持三級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性。

    3 結(jié) 論

    研究低磁場(chǎng)冷凍對(duì)鰱魚(yú)MP的影響,發(fā)現(xiàn)低磁場(chǎng)(-20 ℃、2 mT)處理可抑制MP內(nèi)部殘基的暴露和重排,并對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)有一定的保護(hù)作用。結(jié)果表明:與0 mT磁場(chǎng)冷凍相比,低磁場(chǎng)冷凍處理可以延緩表面疏水性升高,抑制疏水基團(tuán)的暴露,也可以減緩活性巰基氧化成二硫鍵,保持結(jié)構(gòu)的完整性,溶解度和濁度的結(jié)果同樣證明了低磁場(chǎng)冷凍可以抑制MP的聚集,使MP具有良好的功能特性,低磁場(chǎng)冷凍還可以保持較高的熱穩(wěn)定性和二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性;常規(guī)冷凍處理同樣也使得表面疏水性、活性巰基含量和熱穩(wěn)定性顯著降低,而總巰基含量、溶解度和濁度無(wú)顯著差異,且有更多的α-螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊,使得MP結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定;而0 mT磁場(chǎng)冷凍和常規(guī)冷凍處理之間內(nèi)源性熒光光譜、紫外吸收光譜指標(biāo)并無(wú)顯著差異,說(shuō)明0 mT磁場(chǎng)冷凍可以節(jié)約10 ℃的冷凍溫差,減少能源損耗,以上結(jié)果可以說(shuō)明低磁場(chǎng)冷凍比常規(guī)冷凍更適合用于MP冷凍,且是一種環(huán)保、減能的冷凍技術(shù)。

    低磁場(chǎng)冷凍(2 mT)對(duì)同等條件下0 mT磁場(chǎng)冷凍的MP熒光強(qiáng)度和紫外吸收強(qiáng)度的影響并不顯著,有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。低磁場(chǎng)冷凍可以減少M(fèi)P的氧化、聚集和變性,使MP的構(gòu)象更穩(wěn)定,并為低磁場(chǎng)冷凍工業(yè)化提供了基礎(chǔ)依據(jù),也為進(jìn)一步研究該技術(shù)與保鮮劑、抗凍劑等協(xié)同作用及相關(guān)產(chǎn)品的消化特性提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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    收稿日期:2022-05-05

    基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31701630);遼寧省教育廳2021年度高等學(xué)校基本科研項(xiàng)目(LJKZ0715);

    遼寧省自然基金資助計(jì)劃項(xiàng)目(2019-MS-032);大連市高層次人才創(chuàng)新支持計(jì)劃項(xiàng)目(2018RQ67);

    農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目(NYJG201502);大連海洋大學(xué)蔚藍(lán)英才工程項(xiàng)目(2018WLYC14)

    第一作者簡(jiǎn)介:逯曉燕(1998—)(ORCID: 0000-0002-5057-1181),女,碩士研究生,研究方向?yàn)樗a(chǎn)品保鮮。

    E-mail: lxyan0514@163.com

    *通信作者簡(jiǎn)介:叢海花(1983—)(ORCID: 0000-0002-8449-6060),女,副教授,博士,研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工。

    E-mail: 287669592@qq.com

    李昊(1987—)(ORCID: 0000-0002-8879-2764),男,高級(jí)工程師,博士,研究方向?yàn)槿庵破芳庸ぜ皠?dòng)物蛋白應(yīng)用。E-mail: 674131438@qq.com8BFDD439-A2BD-4533-B3C1-C12D320B438A

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