不同鹽濃度脅迫對綠豆種子萌發(fā)及抗鹽性的影響研究

馬瑜蔓 牛思源 喬寧 蘇之涵 劉彩虹 任琴*

（集寧師范學(xué)院，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 012000）

1 前言

土壤鹽漬化是一個世界性的資源和生態(tài)問題。全球鹽堿地面積已達(dá) 9.5×108hm2（公頃）。中國鹽漬土總面積約 1 億公頃，其中現(xiàn)代鹽漬化土壤約 0.37 億公頃，殘余鹽漬化土壤約 0.45 億公頃，潛在鹽漬化土壤約 0.17 億公頃。據(jù)聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署（UNEP）的調(diào)查統(tǒng)計，在旱地土壤退化中，因土壤鹽漬化造成的土地荒漠化達(dá) 110 萬公頃以上，僅次于風(fēng)蝕和水蝕，居第三位。全世界可耕地面積的20%和灌溉面積的50%均受到不同程度次生鹽漬化的影響。土壤鹽漬化抑制種子的萌發(fā)及作物的生長，使栽培作物的產(chǎn)量和品質(zhì)下降[1]。土壤鹽漬化這一古老的生態(tài)災(zāi)難再一次向人類發(fā)出了嚴(yán)峻警告[2]。

上世紀(jì)80 年代以來，我國在改造鹽堿地，尤其在生物改良方面，各地均有許多成功的經(jīng)驗。如：內(nèi)蒙古河套黃河灌區(qū)向日葵產(chǎn)區(qū)，羊草和堿茅是鹽堿化草地上的優(yōu)勢植物，在松嫩平原上已得到應(yīng)用推廣。遼寧在重鹽漬化地區(qū)栽培細(xì)葉藜，為養(yǎng)豬提供了優(yōu)質(zhì)青飼料。天津農(nóng)科院耐鹽水稻試驗，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)在河北省曲周淺層咸水型鹽堿化低產(chǎn)區(qū)進(jìn)行了30 年的改良實驗，使當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)作物產(chǎn)量獲得了很大的提高。利用鹽生植物改造鹽堿地的效果也比較明顯，如東營鹽生植物園。本文通過對鹽脅迫下綠豆種子的發(fā)芽率、胚根長度及抗氧化酶活性的研究，旨在為植物的抗鹽性提供科學(xué)依據(jù)。

已有研究表明，植物的耐鹽性是由多基因控制的復(fù)合性狀，并且是一系列的整體適應(yīng)性，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物抗鹽性的研究已取得了一定的進(jìn)展，某些植物的抗鹽性得到了很大的提高[3]。在植物遭受生物和理化因子傷害時，膜上受體接受并傳遞脅迫信號，引發(fā)質(zhì)膜和細(xì)胞器的氧化猝發(fā)產(chǎn)生ROS，ROS 在傳送和放大信號的過程中會改變離子的分布和啟動核基因的表達(dá)，從而使植物耐受各種脅迫。同時過氧化氫酶通過清除作用ROS 保持一定的濃度范圍，過氧化氫酶的這種保護(hù)機制，也體現(xiàn)在植物各種抗逆反應(yīng)中[4]。

植物在脅迫條件下，為了保護(hù)自身，能夠產(chǎn)生許多抗性物質(zhì)，從而抵御逆境的危害，以獲得更好的生存環(huán)境。不同植物的抗氧化酶系統(tǒng)對鹽脅迫的響應(yīng)不同，雖然植物在受到脅迫時能夠啟動自身的酶系統(tǒng)來抵御不良環(huán)境，但也僅限于一定的脅迫范圍內(nèi)，當(dāng)鹽濃度過大時會對植物造成傷害，酶活性下降[5]。高昆等研究表明，不同濃度NaCl 處理錦燈籠后，其POD 活性隨著NaCl 濃度的升高呈先升后降的趨勢[6]。馮梅等研究表明，低濃度的鹽脅迫可增強POD、CAT 活性，以此減弱體內(nèi)有害物質(zhì)CAT 的活性，隨著鹽濃度的增加，CAT 活性逐漸減弱[7]。陳忠祥在NaCl 脅迫對不同貯藏期羅布麻種子萌發(fā)及幼苗生理的影響中指出，隨著NaCl 濃度增加，羅布麻幼苗期POD、CAT 酶活性均呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢[8]。然而系統(tǒng)研究鹽濃度脅迫對綠豆種子萌發(fā)、幼苗生長及抗氧化酶活性的影響報道甚少。本文以烏蘭察布雜糧綠豆種子為材料，探討不同鹽濃度對其種子萌發(fā)、幼苗生長及抗氧化酶活性的影響，篩選出最佳鹽濃度，旨在為作物抗鹽性提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

試驗所用綠豆購自烏蘭察布市集寧區(qū)農(nóng)貿(mào)市場。

2.2 方法

2.2.1 鹽脅迫下綠豆種子的發(fā)芽率及胚根長度測定

（1）選取大小均勻的綠豆種子450 粒。每個培養(yǎng)皿中分別放入兩層濾紙。取干凈的15 個培養(yǎng)皿編號為1～15，其中1～3 號培養(yǎng)皿中倒入濃度為0.0 mmol/L 氯化鈉溶液，4～6 號倒入濃度為100 mmol/L 氯化鈉溶液，以此類推，每個處理重復(fù)3 次。每個培養(yǎng)皿放入30 粒綠豆種子，蓋上紗布，注意保持紗布的濕潤，放入恒溫培養(yǎng)箱中。

（2）于1、3、5、7、9 天觀察其發(fā)芽率并測量胚根長度。

2.2.2 抗氧化酶活性的測定

（1）抗氧化物酶粗酶液的提取

從上述各培養(yǎng)皿中隨機挑選出綠豆，稱取其樣品重量加以記錄，分別加入磷酸緩沖溶液（20 mmol/L，pH 值為6.0）研磨成勻漿狀，定容至5 mL，于4000 r/min 離心15 min，上清液即為粗酶提取液。

（2）過氧化物酶活性的測定

采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶活性。具體為，吸取1 mL 提取液于試管中，加入3 mL 反應(yīng)混合液（50 mL 磷酸緩沖溶液，加入愈創(chuàng)木酚28 μL，30%過氧化氫19 μL），以磷酸緩沖溶液為空白對照，立即測定每30 s（秒），470 nm 波長下光OD 值，共測2 min。

過氧化物酶活性（OD/g*FW）=[OD470 值/樣品鮮重（g）]

（3）過氧化氫酶活性的測定

取上述各處理中的粗酶提取液0.2 mL 于試管中，加入2.8 mL 反應(yīng)混合液（pH 值為7.8 磷酸緩沖溶液1.5 mL，加入100 mmol/L 30%過氧化氫0.3 L 和1 mL 蒸餾水），以蒸餾水為空白對照，立即測定每分鐘240 nm 波長下光OD 值，共測4 min。

過氧化氫酶活性（μ/(g*FWmin)）=（ΔA240*Vt）/（W*Vs*0.01*t）

式中，Vt 為提取酶液總體積（mL）； W 為綠豆鮮重（g）； Vs 為測定時取用酶液體積（mL）；t 為反應(yīng)時間（min）。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同鹽濃度脅迫對綠豆種子發(fā)芽率的影響

圖1 為不同鹽濃度脅迫對綠豆種子發(fā)芽率的影響。結(jié)果表明，處理濃度為0 mmol/L、100 mmol/L的條件下，各組內(nèi)綠豆發(fā)芽率均為100%。處理濃度為200 mmol/L、300 mmol/L 條件下，各組內(nèi)綠豆發(fā)芽率隨培養(yǎng)時間延長，發(fā)芽率明顯上升。鹽濃度為200 mmol/L 處理條件下，第9 天種子發(fā)芽率

圖1 不同鹽濃度脅迫對綠豆種子發(fā)芽率的影響

雖有所下降，但方差分析結(jié)果顯示，與對照無顯著差異。同一處理天數(shù)不同濃度對綠豆種子萌發(fā)影響不同。與對照0 mmol/L 相比，100 mmol/L 處理與對照組無顯著差異。當(dāng)鹽濃度為200 mmol/L 時，第1 天和第3 天綠豆種子發(fā)芽率顯著低于同天對照，但5—7 天發(fā)芽率提高，與對照無顯著差異。當(dāng)鹽濃度為300 mmol/L 和400 mmol/L 時，綠豆種子發(fā)芽率顯著低于同天對照發(fā)芽率。

3.2 不同鹽濃度脅迫對綠豆胚根長度的影響

圖2 為不同鹽濃度對綠豆種子胚根長度的影響。結(jié)果表明，同一鹽濃度對綠豆種子發(fā)芽率影響不同，隨著胚根生長天數(shù)增加。0 mmol/L 和100 mmol/L 鹽濃度條件下，綠豆種子胚根長度顯著增加。處理濃度為200 mmol/L 和300 mmol/L 鹽脅迫條件下，胚根長度在第1、3、5 天不斷增加，5天后長度基本不再增加。鹽濃度為400 mmol/L 時，綠豆胚根基本不長。不同濃度同一時間，綠豆胚根長度變化不同。與對照相比，同一天中100 mmol/L 和200 mmol/L 處理均顯著降低了胚根長度。

圖2 不同鹽濃度脅迫對綠豆胚根長度的影響

鹽濃度大于300 mmol/L 時，胚根幾乎不長。

3.3 不同鹽濃度脅迫對綠豆抗氧化酶活性的影響

不同鹽濃度對POD 活性的影響如圖3。結(jié)果表明：當(dāng)鹽濃度在0～200 mmol/L 時，POD 均在處理第7 天達(dá)到最高，鹽濃度為300～400 mmol/L 時，POD 活性在第3 天達(dá)到最高，但總體各時間點酶活性升高較慢。不同濃度同一天處理下，POD 活性在0 mmol/L、100 mmol/L 脅迫下變化趨勢基本相同，當(dāng)鹽濃度為200 mmol/L 時，POD 活性變化變小。300 mmol/L 后基本無變化。

圖3 不同鹽濃度脅迫對綠豆過氧化物酶活性的影響

不同鹽濃度對CAT 活性的影響如圖4。結(jié)果表明：不同天數(shù)相同鹽濃度中CAT 活性變化除400 mmol/L 外，其余濃度組內(nèi)均呈波浪式下降上升，而處理濃度為400 mmol/L 條件下，過氧化氫酶活性組內(nèi)呈先上升后下降趨勢。在處理濃度為0 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L 條件下脅迫3 天后，綠豆種子內(nèi)過氧化氫酶活性與1 天相比下降，方差分析結(jié)果顯示差異不顯著；脅迫5 天，綠豆種子內(nèi)過氧化氫酶活性與脅迫1 天相比顯著升高。

圖4 不同鹽濃度脅迫對綠豆過氧化氫酶活性的影響

4 結(jié)論與討論

與對照組相比，當(dāng)鹽濃度為100 mmol/L 時，種子發(fā)芽率與對照組相同，達(dá)到100%，胚根長度隨培養(yǎng)天數(shù)延長而增加，但低于對照組。過氧化物酶活性在第7 天達(dá)到最高，過氧化氫酶活性在第5 天達(dá)到最高。當(dāng)鹽濃度達(dá)到200 mmol/L 時，與對照組相比，種子發(fā)芽率隨培養(yǎng)天數(shù)增加而增長，低于對照組，最高為93.75%，胚根長度有所增加，但增長幅度很小，CAT 活性在5 天達(dá)到最高。當(dāng)鹽濃度達(dá)到300 mmol/L 時，發(fā)芽率隨時間的延長而不斷降低，最高僅為32.50%，CAT 活性在第5天達(dá)到最高。當(dāng)鹽濃度為400 mmol/L 時，種子基本不發(fā)芽，發(fā)芽率僅為1.25%，胚根生長停滯，CAT活性在第3 天達(dá)到最高，此后天數(shù)中逐漸降低。

王建科等研究得出，同種鹽脅迫下隨著鹽濃度升高，種子萌發(fā)受到顯著抑制[9]。劉順平在研究不同濃度NaCl 處理對綠豆種子萌發(fā)的影響顯示，種子在萌發(fā)過程中出芽階段表現(xiàn)出較強的耐鹽性，在50～200 mmol/L 的NaCl 鹽脅迫下對其發(fā)芽率影響不明顯，但顯著抑制幼苗生長，隨處理濃度的升高，其萌發(fā)、幼苗生長受到抑制的程度不斷增大，綠豆種子萌發(fā)能忍耐的NaCl 處理濃度為200 mmol/L以下[10]。這與本實驗基本一致。但王麗艷研究表明，除低濃度的NaCl（50 mmol/L）對綠豆種子萌發(fā)和幼苗的生長有一定的促進(jìn)作用，所有種類所有濃度的鹽脅迫對綠豆種子的萌發(fā)和幼苗的生長均有不同程度的抑制作用[11]。而本實驗中綠豆可適應(yīng)100 mmol/L NaCl 鹽脅迫，這可能是由于試驗所選用綠豆種子種類不同，也可能是由于50～100 mmol/L 間濃度變化不大，因而導(dǎo)致結(jié)果不同。劉微等在研究NaCl 脅迫對辣椒種子萌發(fā)及幼苗生長的影響表明，隨著NaCl 濃度的升高，3 個辣椒品種的發(fā)芽率、胚根長度均呈現(xiàn)下降趨勢，在萌發(fā)過程中辣椒種子僅可適應(yīng)低于200 mmol/L NaCl 的鹽脅迫[12]。這與本實驗的研究結(jié)果具有一致性。但鑒于二者研究種類不同，因此綠豆種子萌發(fā)及幼苗生長所適應(yīng)的脅迫濃度有待進(jìn)一步研究。

本研究中，POD酶活性在100 mmol/L內(nèi)，7天達(dá)到最高，CAT酶活性1天即達(dá)到最高。而李志萍研究得出，CAT活性在NaCl脅迫下呈現(xiàn)先降低后升高趨勢，NaCl處理在400 mmol/L時達(dá)到最大值[13]。這與本研究略有不同，可能與試驗品種有關(guān)，亦或是試驗時測定CAT酶活性時間不同。周玉梅等用NaCl模擬鹽害環(huán)境，研究苦豆子種子萌發(fā)過程中對鹽脅迫響應(yīng)的生理特性變化規(guī)律，得出低濃度的鹽溶液引起POD與CAT活性極顯著或顯著上升，中度鹽脅迫（100 mmol/L＜NaCl溶液≤200 mmol/L）下，POD活性顯著下降，重度鹽脅迫（NaCl溶液＞200 mmol/L）下，CAT酶活性顯著上升，同時在重度鹽脅迫下POD酶活性已降至最低值，只有CAT酶還保持比較高的活性[14]，這與本實驗結(jié)果基本一致。宋玉偉等人研究發(fā)現(xiàn)綠豆幼苗隨著鹽脅迫濃度的增加和時間延長，POD、CAT的活性都呈上升趨勢[15]。劉建霞等人研究發(fā)現(xiàn)，單鹽脅迫處理使POD活性下降，明顯低于對照組[16]。而本實驗研究也表明，低濃度下POD活性隨濃度增加和時間延長而升高，同時濃度為100 mmol/L下POD活性于第1天活性下降，此結(jié)果與宋玉偉、劉建霞的研究具有一致性。但本實驗結(jié)果同時表明在濃度為200 mmol/L下，第3天CAT活性明顯低于第1天，此結(jié)果因為兩組結(jié)果時間不同而有待驗證。

本研究結(jié)果表明，綠豆可適應(yīng)的鹽濃度為100 mmol/L，當(dāng)鹽濃度高于100 mmol/L時綠豆種子的發(fā)芽率逐漸降低，胚根長度生長隨鹽脅迫增加而生長緩慢，鹽濃度大于300 mmol/L時胚根幾乎不長?？寡趸溉邕^氧化物酶、過氧化氫酶在鹽脅迫中發(fā)揮重要作用，隨鹽濃度的升高，POD活性逐漸降低，但總體各時間點酶活性升高，速度較慢；CAT活性保持較高活性。本實驗為作物抗鹽性研究提供一定的理論依據(jù)，然而綠豆對鹽脅迫響應(yīng)的生理機制尚未明確，因此本研究在今后的實驗中將通過代謝組學(xué)深入研究。