東北地區(qū)狐源大腸桿菌耐藥性、整合酶及整合子基因的檢測與相關(guān)分析

閆 爽，馮 濤，王東陽，李雪惠，薛 原

（東北林業(yè)大學(xué) 野生動物與自然保護(hù)地學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

大腸桿菌（Escherichia coli）是人與動物腸道中的一種常在共棲菌，屬于條件致病菌[1]，其在某些致病因素誘導(dǎo)下會使宿主出現(xiàn)腹瀉和敗血癥等癥狀，同時其還可能會隨著感染宿主排泄物進(jìn)入周圍環(huán)境而感染其他動物。狐的經(jīng)濟(jì)價值較高，毛皮十分珍貴，作為重要的經(jīng)濟(jì)動物，狐養(yǎng)殖業(yè)在中國得到了廣泛的發(fā)展，隨著東北地區(qū)狐養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，養(yǎng)殖場內(nèi)出現(xiàn)臨床抗生素藥物濫用的現(xiàn)象，導(dǎo)致狐源大腸桿菌耐藥性逐漸增強(qiáng)。耐藥性的產(chǎn)生會導(dǎo)致狐大腸桿菌病的診斷和治療越發(fā)困難[2-3]。隨著狐源耐藥菌株的不斷增加，多種抗生素耐藥菌（ARB）會導(dǎo)致狐的嚴(yán)重感染甚至大量死亡，阻礙養(yǎng)狐業(yè)的發(fā)展。

細(xì)菌菌株的耐藥性通常具有不同的轉(zhuǎn)移機(jī)制，并依賴質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等水平或垂直傳播[4]。整合子的共性是含有整合酶基因，并位于整合子的5'保守末端，屬于酪氨酸整合酶家族[5]。整合子位于可移動遺傳元件如接合性質(zhì)粒、噬菌體以及轉(zhuǎn)座子中，通過整合酶捕獲外源耐藥基因并可在上游啟動子的控制下調(diào)控這些耐藥基因的表達(dá)[6]，使細(xì)菌對抗生素表現(xiàn)出耐藥以及多重耐藥，并在相同或不同種屬細(xì)菌間轉(zhuǎn)移進(jìn)而傳播耐藥基因，這也是大腸桿菌耐藥性傳播的重要原因[7]。按照整合子編碼整合酶基因的序列差異可將其分為9 類，其中I、II、III 類整合子與細(xì)菌的耐藥性密切相關(guān)[8]，且I 類整合子在臨床耐藥菌株中占比最高[9]。整合子本身雖然不能轉(zhuǎn)移，但卻可以定位于質(zhì)?；蛉旧w中，或作為轉(zhuǎn)座子的組成而使耐藥基因水平傳播[10]。

為了解東北地區(qū)狐源大腸桿菌耐藥性，本實驗采用K-B 藥敏紙片法檢測2016 年～2020 年從東北地區(qū)10 個不同狐養(yǎng)殖場分離的330 株大腸桿菌的耐藥性，分別采用PCR 檢測I 類、II 類整合酶基因和I類、II 類整合子基因，并分析狐源大腸桿菌的耐藥性與整合子之間的相關(guān)性，為狐養(yǎng)殖場大腸桿菌病的臨床用藥及耐藥機(jī)制的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌 株大腸桿菌質(zhì)控菌株（ATCC25922），由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；接合試驗受體大腸桿菌NK5449 株，購自中國科學(xué)院微生物研究所，生化特征為不發(fā)酵乳糖，不含質(zhì)粒，對利福平耐藥。330 株狐源大腸桿菌，于2016 年～2020 年分離自東北地區(qū)10 個不同的狐養(yǎng)殖場。

1.2 主要試劑共6 類15 種藥敏片由杭州天和微生物試劑有限公司提供；質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA回收試劑盒，購自愛思進(jìn)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；10×Buffer、dNTP、Taq酶、DL2000 DNA Marker、pMD18-T Vector、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、Gold View 染色劑均購自TaKaRa 公司。

1.3 大腸桿菌的藥敏試驗及多重耐藥性分析采用美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）推薦的Kirby-Bauer 法對330 株狐源大腸桿菌進(jìn)行6 類15 種藥物的藥敏性試驗，按照藥敏紙片擴(kuò)散的抑菌環(huán)直徑確定不同菌株的耐藥性。

1.4 大腸桿菌I 類、II 類整合酶基因的PCR 擴(kuò)增按照文獻(xiàn)[11, 12] 設(shè)計并由吉林庫美生物科技有限公司合成大腸桿菌I 類、II 類整合酶基因（intI1和intI2）引物，采用煮沸法提取330 株狐源大腸桿菌基因組DNA 作為模板，采用上述intI1和intI2基因引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，根據(jù)PCR 擴(kuò)增結(jié)果分析整合酶基因intI1和intI2與大腸桿菌耐藥表型的相關(guān)性。

1.5 大腸桿菌I 類、II 類整合子基因的PCR 擴(kuò)增及序列的分析按照文獻(xiàn)[13,14]設(shè)計并由吉林庫美生物科技有限公司合成大腸桿菌I 類、II 類整合子基因以1.4 獲得的330 株狐源大腸桿菌基因組DNA 作為模板，采用上述整合子基因引物，經(jīng)PCR 擴(kuò)增大腸桿菌I 類、II 類整合子基因。PCR 產(chǎn)物回收純化后由吉林庫美生物科技有限公司測序，利用DNAStar 軟件對測序結(jié)果校正、拼接后，與GenBank 中登錄的大腸桿菌整合子基因序列比對，分析整合子中基因盒的組成。根據(jù)PCR 擴(kuò)增結(jié)果分析I 類、II 類整合子基因與大腸桿菌耐藥表型的相關(guān)性。

1.6 大腸桿菌整合子耐藥質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗及接合子中I 類整合酶和整合子基因的檢測將PCR 擴(kuò)增結(jié)果為整合子基因陽性的大腸桿菌作為供體菌，E. coliNK5449 株為受體菌，二者混合培養(yǎng)后均勻涂布在抗性（100 μg/mL 鏈霉素+100 μg/mL 利福平）MH板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，提取MH 板上接合子的質(zhì)粒DNA，測序后統(tǒng)計接合率。并參照1.4 和1.5，通過PCR 擴(kuò)增接合子中的整合酶和整合子基因。

2 結(jié)果與討論

2.1 狐源大腸桿菌藥敏試驗及多重耐藥性分析藥敏試驗結(jié)果顯示，330 株狐源大腸桿菌對β-內(nèi)酰胺類藥物和四環(huán)素類藥物耐藥性較高，其中對氨芐西林耐藥的菌株占87.88%（290/330），對四環(huán)素耐藥的菌株占93.64%（309/330）；其次是對氨基糖苷類藥物和磺胺類藥物，其中對卡那霉素耐藥的菌株占63.94%（211/330），對復(fù)方新諾明耐藥的菌株占72.12%（238/330）（圖1A）。推測由于 氨芐西林、四環(huán)素、卡那霉素、復(fù)方新諾明屬于常用獸用藥物，所以產(chǎn)生了對這些藥物的耐藥性。對β-內(nèi)酰胺類藥物亞胺培南、氨基糖苷類藥物阿米卡星相對敏感，敏感菌株分別占86.97%（287/330）和83.94%（277/330）（圖1A），對這兩種藥物敏感主要是由于其在狐養(yǎng)殖場使用較少所致。狐源大腸桿菌的多重耐藥性分析結(jié)果顯示，87.88%（290/330）的狐源大腸桿菌為多重耐藥性，其中耐3 種、4 種、5 種、6 種以上藥物的菌株分別占17.27%（57/330）、22.42%（74/330）、24.85%（82/330）、23.24%（77/330）（圖1B）。上述結(jié)果表明東北地區(qū)狐源大腸桿菌對四環(huán)素類、氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、磺胺類抗生素高度耐藥，且多數(shù)狐源大腸桿菌具有多重耐藥性。

圖1 330株狐源大腸桿菌的藥敏試驗（A）及多重耐藥（B）的統(tǒng)計結(jié)果Fig.1 Statistical analysis of drug resistance test(A)and multiple drug resistance(B)of 330 strains Escherichia coli isolated from foxes

張召興等于2016 年對秦皇島狐源大腸桿菌藥敏試驗結(jié)果顯示，檢測的狐源大腸桿菌均對四環(huán)素類抗生素高度耐藥[15]，與本試驗結(jié)果相似；朱利霞等于2019 年對河北地區(qū)狐肺炎大腸桿菌的研究結(jié)果顯示[16]，81 株狐源大腸桿菌對磺胺類抗生素復(fù)方新諾明（SXT）耐藥菌株占63.75%（51/81），與本試驗結(jié)果相似；高光平等于2019 年對秦皇島昌黎縣的狐源大腸桿菌的藥敏試驗結(jié)果顯示，這些大腸桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素和四環(huán)素類抗生素的耐藥性高于對其他類型的抗菌藥物[17]，也與本試驗結(jié)果相似。

2.2 狐源大腸桿菌I 類、II 類整合酶基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果對330 株狐源大腸桿菌的整合酶基因經(jīng)PCR 擴(kuò)增并統(tǒng)計結(jié)果顯示，I 類整合酶基因intI1和II類整合酶基因intI2的檢出率分別為63.64%（210/330）和15.45%（51/330），且共有36 株狐源大腸桿菌同時攜帶intI1和intI2兩種整合酶基因。整合酶基因intI1和intI2與氨基糖苷類和磺胺類耐藥基因顯著相關(guān)，整合酶基因通過捕獲上述外源耐藥基因，在上游啟動子的控制下調(diào)控這些耐藥基因的表達(dá)[6]。因此，其與大腸桿菌對氨基糖苷類和磺胺類抗生素的耐藥表型相關(guān)[18]。本研究中狐源大腸桿菌對氨基糖苷類抗生素卡那霉素耐藥的菌株占62.42%（206/330），對磺胺類抗生素復(fù)方新諾明耐藥的菌株占72.12%（238/330）。表明狐源大腸桿菌對上述藥物的耐藥表型主要由這兩類整合酶基因介導(dǎo)。

2.3 狐源大腸桿菌I 類、II 類整合子基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果及其攜帶基因盒的組成方式分析I 類、II 類整合子基因的PCR 檢測并統(tǒng)計結(jié)果顯示，330 株狐源大腸桿菌I 類整合子基因檢出率為62.86%（207/330），其中有33.81%（70/207）攜帶基因盒，其余未攜帶基因盒；330 株狐源大腸桿菌中未檢出II 類整合子基因。70 個攜帶基因盒的I 類整合子基因測序后與GenBank中登錄的大腸桿菌整合子的基因序列比對并分析I 類整合子中基因盒的組成方式，結(jié)果顯示，共檢測出10 種基因盒，分別是dfrA17、aadA5、dfrA27、aadA2、aadA22、dfrA5、dfrA1、aadA1、dfrA12、orfF，且主要以甲氧芐啶和氨基糖苷類藥物耐藥性的dfrA和aadA類耐藥基因為主，分別占51.43%（36/70）與98.57%（69/70）。氨基糖苷類耐藥基因家族aadA及甲氧芐啶類耐藥基因家族dfr與整合子關(guān)系最密切，是整合子介導(dǎo)的最常見的耐藥基因型[10]?；蚝杏? 種不同的組成方式，分別是：dfrA17-aadA5（8.57%，6/70）、dfrA27-aadA2（1.43%，1/70）、aadA22（48.57%，34/70）、dfrA5（1.43%，1/70）、dfrA1-aadA1（38.57%，27/70）、dfrA12-orfF-aadA2（1.43%，1/70），其片段大小依次為1 664 bp、1 571 bp、1 009 bp、721 bp、1 585 bp 和1 913 bp。在I 類整合子中檢測到的 耐 藥 基 因aadA1、aadA2、aadA5、aadA22與 氨基糖苷類抗生素的耐藥性相關(guān)，而dfrA1、dfrA5、dfrA12、dfrA15、dfrA17則與甲氧芐啶類抗生素的耐藥性相關(guān)[10]。甲氧芐啶屬于二氨基嘧啶類藥物，常與磺胺類藥物一同使用，以達(dá)到抗菌增效的效果，所以又稱為磺胺增效劑[19]。本研究并未檢測狐源大腸桿菌對該類藥物的耐藥表型[2]，所以，整合子是否會致狐源大腸桿菌對甲氧芐啶類藥物耐藥并不清楚；orfF為功能未知的開放閱讀框，這些耐藥基因可以獨立存在，也可與其他耐藥基因相互結(jié)合存在于狐源大腸桿菌中。其中aadA22類型的基因盒所占數(shù)量最多，達(dá)48.57%（34/70），是本研究中狐源大腸桿菌最主要的基因盒組成方式，與狐源大腸桿菌對氨基糖苷類抗生素卡那霉素（K）的耐藥性較強(qiáng)有關(guān)，且其與整合酶基因共同介導(dǎo)了大腸桿菌對該類抗生素的耐藥表型。挪威肉類和肉類產(chǎn)品大腸桿菌中最流行的基因盒組成方式為dfrA1-aadA1[5]；在中國寧夏地區(qū)牛源大腸桿菌中基因盒dfrA17-aadA5的流行最普遍[20]，上述結(jié)果均與本試驗結(jié)果相似。中國華南東江流域地表水中的大腸桿菌中檢測出最常見的基因盒是1.9 kb 的dfrA12-orfF-aadA2[21]，本研究中也檢測到該基因盒，但并不普遍，表明aadA氨基糖苷類耐藥基因盒在東北地區(qū)狐源養(yǎng)殖場中可以穩(wěn)定存在。本研究中的330 株狐源大腸桿菌對β-內(nèi)酰胺類藥物和四環(huán)素類藥物的耐藥性也較高，但本研究并未在整合子的基因盒中檢測到該類耐藥基因，這主要是由于大腸桿菌耐藥機(jī)制很復(fù)雜，其還存在其他的耐藥機(jī)制介導(dǎo)狐源大腸桿菌對上述藥物的耐藥表型。

2.4 狐源大腸桿菌整合子耐藥質(zhì)粒接合試驗及接合子I 類整合酶基因和整合子基因的檢測結(jié)果細(xì)菌耐藥質(zhì)粒分為兩種，一種是可發(fā)生轉(zhuǎn)移的接合性質(zhì)粒，另一種是不能發(fā)生移動的非接合性質(zhì)粒，研究發(fā)現(xiàn)，整合子基因大多位于接合性質(zhì)粒上，質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移是細(xì)菌耐藥性和耐藥基因水平傳播的主要方式之一[22]。因此，可以利用接合試驗分析330 株狐源耐藥大腸桿菌耐藥基因的水平傳播情況。本研究以70 株攜帶基因盒的I 類整合子的狐源大腸桿菌為供體菌，E. coliNK5449 株為受體菌進(jìn)行整合子質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移試驗，并通過PCR 擴(kuò)增接合子的整合酶基因和整合子基因。結(jié)果顯示，23 株供體菌將攜帶整合子基因的耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體菌E. coliNK5449中，接合率為32.86%（23/70），其中I 類整合酶基因檢出率為34.78%（8/23），I 類整合子基因檢出率為43.48%（10/23），表明耐藥基因具有水平轉(zhuǎn)移的能力，但并不能將全部的耐藥基因轉(zhuǎn)移到受體菌中。

本實驗從東北地區(qū)10 個狐場分離的330 株大腸桿菌中檢測出I 類、II 類整合酶基因及I 類整合子基因，由于大腸桿菌耐藥機(jī)制的復(fù)雜性，大腸桿菌攜帶的整合酶、整合子基因及其攜帶的相關(guān)基因盒并不能完全解釋這些分離菌株的所有耐藥表型。整合子—基因盒雖然是大腸桿菌出現(xiàn)多重耐藥菌株的重要原因之一，但其還存在其他耐藥機(jī)制，如轉(zhuǎn)座子或質(zhì)粒所攜帶的耐藥基因等，這些耐藥機(jī)制共同導(dǎo)致了細(xì)菌的多重耐藥性。今后的研究中應(yīng)加強(qiáng)對東北地區(qū)狐養(yǎng)殖場大腸桿菌耐藥性及其整合子系統(tǒng)的監(jiān)測，控制整合子的流行趨勢，為臨床控制大腸桿菌多重耐藥菌株的傳播提供參考依據(jù)。