豬德爾塔冠狀病毒M蛋白參與病毒誘導(dǎo)IL-8產(chǎn)生的研究

石照蓉，陳建飛，張洪玲，時洪艷，郭龍軍，馮 力

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150069）

豬德爾塔冠狀病毒（Porcine deltacoronavirus，PDCoV）是近年來新發(fā)現(xiàn)的豬腸道冠狀病毒，該病毒為冠狀病毒科δ 冠狀病毒屬成員[1]。與豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）和豬傳染病胃腸炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）感染類似，PDCoV 感染主要引起仔豬嘔吐、腹瀉、脫水等主要臨床癥狀，臨床上常與PEDV 和TGEV 混合感染，已成為影響豬場仔豬腹瀉的重要病原之一[2]。PDCoV 基因組約25.4 kb，編碼刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）4 種結(jié)構(gòu)蛋白以及15 種非結(jié)構(gòu)蛋白[3]。研究表明，冠狀病毒M 蛋白參與病毒復(fù)制整個周期，是病毒復(fù)制必不可少的組分[4-5]。病毒感染能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生許多炎性因子，誘導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而激活機(jī)體的先天性免疫應(yīng)答，使機(jī)體呈抗病毒狀態(tài)。IL-8 是趨化因子家族成員，由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞等分泌，是一種重要的中性粒細(xì)胞趨化因子，與腫瘤和癌癥的發(fā)生密切相關(guān)[6-7]。IL-8 作為重要的促炎因子，檢測其在體內(nèi)的表達(dá)水平有助于對疾病的嚴(yán)重程度進(jìn)行預(yù)判[7]。然而，PDCoV 感染誘導(dǎo)IL-8 產(chǎn)生的調(diào)控機(jī)制鮮有報道。鑒于IL-8 對病毒感染后的病理變化及炎癥反應(yīng)具有重要的指導(dǎo)意義，本研究旨在探究PDCoV 感染與宿主細(xì)胞IL-8 產(chǎn)生的關(guān)系，為深入闡明PDCoV 的致病機(jī)制提供研究方向。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料豬睪丸細(xì)胞（ST）、豬小腸上皮細(xì)胞（IPEC）、HEK 293T 細(xì) 胞、PDCoV NH 株（KT336560.1）、IL-8 啟動子質(zhì)粒、pRL-TK 質(zhì)粒由本實驗室保存；胎牛血清購自Gibco 公司；RNA 提取試劑盒、雙熒光素酶檢測試劑盒購自Axygen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green I 熒光定量試劑盒購自TaKaRa 公司；X-Treme GENETM轉(zhuǎn)染試劑購自Roche公司；鼠抗HA 標(biāo)簽抗體、山羊抗鼠IgG（H&L）-Dy800 購 自Sigma 公 司；FITC 標(biāo) 記 的 山 羊 抗 鼠IgG 購自Li-Cor Biosciences 公司；PDCoV M 基因PCR 擴(kuò)增引物和IL-8 mRNA 熒光定量PCR（qPCR）引物由吉林省庫美生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 IL-8 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的qPCR 檢測將PDCoV以MOI 0.1 和MOI 0.01分別感染單層IPEC細(xì)胞和ST細(xì)胞，感染后6 h、12 h、24 h 分別收集細(xì)胞樣品。按照Axygen 公司RNA 提取試劑盒提取總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后作為模板，按照TaKaRa 熒光定量試劑盒說明進(jìn)行qPCR 檢測。用于檢測IL-8 mRNA 的qPCR引物序列如下：F：CCACACCACACCACAACCCCAA A/R：TTGTTGCTTCTCAGTTCTCTTCA。

1.3 重組M蛋白的表達(dá)、鑒定及其誘導(dǎo)IL-8 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的qPCR 檢測參照GenBank PDCoV 序列（KT336560.1）設(shè)計PDCoV M 基因PCR 擴(kuò)增引物，MF：CGGCTAGCATGAGCGATGGGAGAAT/M-R：CGTC TAGACATATATTTATCAGGGCG。以IPEC 細(xì)胞基因組DNA 為模板，經(jīng)PCR 擴(kuò)增M 基因并克隆至pCAGGSHA 載體構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-M。用X-Treme GENETM轉(zhuǎn)染試劑將pCAGGS-M 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，培養(yǎng)30 h收集細(xì)胞樣品，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，以鼠源抗HA 抗體（1∶1 000）為一抗，以山羊抗鼠IgG（H&L）-Dy800（1∶500）為二抗，通過western blot 分析M 蛋白表達(dá)情況。將HEK 293T 細(xì)胞接種于12 孔板，培養(yǎng)過夜后轉(zhuǎn)染pCAGGSM 質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后24 h，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，利用33%丙酮固定30 min，甲醇透膜30 min，5% 脫脂乳封閉1.5 h，以鼠源抗HA 標(biāo)簽抗體（1∶1 000）為一抗，以FITC 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 為熒光二抗（1∶500），通過間接免疫熒光試驗（IFA）檢測M 蛋白表達(dá)情況。通過上述試驗證實pCAGGS-M 質(zhì)粒在細(xì)胞中可正確表達(dá)M 蛋白后，將2.0 μg pCAGGS-M 質(zhì)粒和pCAGGS-HA空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染IPEC 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h 后收集細(xì)胞樣品，RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄方法見1.2，并通過qPCR檢測IL-8 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平。

1.4 M 蛋白誘導(dǎo)IL-8 轉(zhuǎn)錄水平的雙熒光素酶活性分析將IL-8 啟動子質(zhì)粒、pRL-TK 質(zhì)粒和不同劑量pCAGGS-M 質(zhì)粒（10 ng、100 ng 和200 ng）共轉(zhuǎn)染HEK 293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pCAGGS-HA 空載體作為對照。轉(zhuǎn)染后24 h，棄掉細(xì)胞上清，按照Axygen 公司雙熒光素酶檢測試劑盒操作說明，每孔加入60 μL PLB裂解液，置于搖床室溫裂解20 min。將20 μL 裂解液樣品轉(zhuǎn)入酶標(biāo)板，加入50 μL LARII 試劑檢測螢火蟲熒光素酶活性。然后加入50 μL 終止液，檢測海腎熒光素酶活性，將螢火蟲熒光素酶活性值和海腎螢火蟲熒光素酶活性值的比值作為IL-8 啟動子的相對活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 IL-8 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的qPCR 檢測結(jié)果將PDCoV以MOI 0.1 和MOI 0.01 分別感染IPEC 細(xì)胞和ST 細(xì)胞，感染后不同時間（6 h、12 h 和24 h）收集細(xì)胞樣品，提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過熒光定量PCR 方法檢測細(xì)胞IL-8 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，與未感染組相比，PDCoV 感染IPEC 細(xì)胞6 h、12 h 和24 h 誘導(dǎo)IL-8 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平分別上調(diào)3 倍、37 倍和173 倍（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01）（圖1A），PDCoV感染ST細(xì)胞后不同時間IL-8 mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別上調(diào)20倍、19 000倍和48 000倍（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）（圖1 B）。炎癥因子在病毒感染的早期產(chǎn)生，機(jī)體炎癥水平異常會刺激機(jī)體相關(guān)調(diào)控機(jī)制，本研究選取了病毒感染后6 h、12 h 和24 h 測定IL-8 mRNA 轉(zhuǎn)錄情況，發(fā)現(xiàn)IL-8 mRNA 水平與感染時間呈現(xiàn)正相關(guān)。結(jié)果表明PDCoV 感染能夠顯著誘導(dǎo)宿主細(xì)胞IL-8 mRNA 水平的上調(diào)。

圖1 qPCR檢測PDCoV感染IPEC細(xì)胞（A）和ST細(xì)胞（B）IL-8 mRNA轉(zhuǎn)錄水平Fig.1 Detection of the transcription level of IL-8 mRNA in IPEC cells(A)and ST cells(B)infected with PDCoV by qPCR

2.2 重組M 蛋白的表達(dá)、鑒定及其誘導(dǎo)IPEC 細(xì)胞IL-8 轉(zhuǎn)錄水平的qPCR 結(jié)果PDCoV 感染后，病毒核酸由宿主模式識別受體（PRR）感知，最終激活宿主的抗病毒反應(yīng)?？共《镜难装Y反應(yīng)對于宿主防御病毒感染至關(guān)重要。PDCoV M 蛋白參與病毒復(fù)制的整個周期，是病毒復(fù)制必不可少的組分[5]。為了進(jìn)一步探究PDCoV 編碼的M 蛋白是否能夠誘導(dǎo)IL-8 產(chǎn)生，本實驗構(gòu)建pCAGGS-M 真核表達(dá)質(zhì)粒，利用IFA（圖2A）以及western blot方法（圖2B）均證明M重組蛋白可在細(xì)胞中正確表達(dá)。將1.5 μg pCAGGS-HA 質(zhì)粒和pCAGGS-M質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染IPEC細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h通過qPCR方法檢測IL-8 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空載體組相比，轉(zhuǎn)染pCAGGS-M能夠明顯誘導(dǎo)細(xì)胞中IL-8 轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)（約4.3倍，P＜0.05）（圖2C）。以上結(jié)果表明，PDCoV M蛋白能夠誘導(dǎo)細(xì)胞IL-8的產(chǎn)生。

圖2 Western blot和IFA檢測M蛋白表達(dá)及qPCR檢測M蛋白誘導(dǎo)IL-8 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平Fig.2 Detection of the M protein expression by western blot and IFA and the transcription level of IL-8 mRNA induced by M protein by qPCR

2.3 M 蛋白誘導(dǎo)IL-8 轉(zhuǎn)錄水平的雙熒光素酶活性分析為進(jìn)一步探究PDCoV M 蛋白對IL-8 的調(diào)控作用，分別將不同劑量pCAGGS-M 質(zhì)粒（10 ng、100 ng和200 ng）、IL-8 啟動子質(zhì)粒、pRL-TK 質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK 293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pCAGGS-HA 質(zhì)粒為對照，轉(zhuǎn)染后24 h 后通過雙熒光素酶活性分析試驗測定PDCoV M 蛋白不同轉(zhuǎn)染劑量對IL-8 啟動子的誘導(dǎo)活性。結(jié)果顯示，與空載體轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染10 ng、100 ng 和200 ng pCAGGS-M 質(zhì)粒的相對熒光素酶活性分別上調(diào)了1.9倍、3.8倍和5.7倍（P＜0.05）（圖3）。表明隨著PDCoV M 蛋白轉(zhuǎn)染劑量增大對IL-8 轉(zhuǎn)錄水平的促進(jìn)作用更加顯著。

圖3 雙熒光素酶活性分析試驗測定M蛋白對IL-8轉(zhuǎn)錄活性的分析Fig.3 Iuciferase assay for the transcriptional activity of M protein on IL-8

先天性免疫系統(tǒng)是機(jī)體防御病原體侵入的第一道防線。宿主利用不同的PRR 識別不同的病原微生物并誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號網(wǎng)絡(luò)，引起炎癥的發(fā)生并以此消滅病原體[8]。趨化因子是一種可以使細(xì)胞發(fā)生定向遷移的信號蛋白或小分子多肽，可以使白細(xì)胞遷移到受損位置引發(fā)炎癥。IL-8 作為重要的中性粒細(xì)胞趨化因子，在機(jī)體感染后，能夠誘導(dǎo)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，利于機(jī)體消滅病原[7]。本研究表明，PDCoV 感染能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞IL-8 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PDCoV M 蛋白能夠誘導(dǎo)IL-8 的轉(zhuǎn)錄，本研究揭示了PDCoV M 蛋白促進(jìn)病毒誘導(dǎo)宿主細(xì)胞IL-8 的轉(zhuǎn)錄并參與宿主細(xì)胞IL-8 的產(chǎn)生，為深入解析PDCoV 致病機(jī)制提供參考依據(jù)。