抗菌肽LL-37體外抗豬鏈球菌活性的研究

金明潔，張會(huì)會(huì)，梁思宇，張躍靈，謝 芳*，劉思國(guó)*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物細(xì)菌病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江 哈爾濱 150069）

豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）是一種人獸共患病病原菌，革蘭氏染色陽性、兼性厭氧，其血清型眾多、抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜。SS 感染豬會(huì)導(dǎo)致敗血癥、腦膜炎、淋巴結(jié)膿腫[1]，感染人會(huì)引起敗血癥、腦膜炎甚至死亡，臨床表現(xiàn)會(huì)根據(jù)細(xì)菌侵入部位不同有所差異。豬鏈球菌病一般病程較快，死亡率高，帶菌和病死動(dòng)物為主要傳染源，會(huì)在豬群水平和垂直傳播。人感染SS 多發(fā)生在北歐和南亞這些養(yǎng)殖和食用豬肉的地區(qū)，主要與豬鏈球菌2 型（Streptococcus suistype 2，SS2）有關(guān)。我國(guó)曾發(fā)生兩起SS2 感染人的公共衛(wèi)生事件，患者表現(xiàn)為中毒性休克和多器官功能障礙，又稱豬鏈球菌中毒休克樣綜合征（STSLS）[2]。SS 給養(yǎng)豬業(yè)和人類健康帶來嚴(yán)重的威脅，因此研發(fā)有效的抗菌藥物以對(duì)抗SS 感染顯得尤為重要。

抗菌肽又稱宿主防御肽，是一類由12 aa～100 aa組成的小分子多肽，具有廣譜抗菌活性和免疫調(diào)控功能[3]。LL-37 是唯一的人源cathelicidin 家族抗菌肽，帶有6 個(gè)靜正電荷，分子呈雙親性螺旋結(jié)構(gòu)，具有抗細(xì)菌、抗病毒、抗真菌、抗腫瘤等多種功能。研究發(fā)現(xiàn)，LL-37 能破壞表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮抗菌作用[4]，被認(rèn)為是潛在的新型抗菌藥物。本研究測(cè)定了LL-37 對(duì)SS2 的抑菌活性和殺菌活性；借助顯微成像技術(shù)，證實(shí)LL-37 對(duì)SS2 細(xì)胞膜的損傷作用；檢測(cè)了其抗SS2 生物被膜（Bacterial biofilm，BF）形成的活性。本研究為豬鏈球菌病新藥的研發(fā)提供參考依據(jù)，為抗菌肽類藥物的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料抗菌肽LL-37（氨基酸序列：LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES）由吉爾生化（上海）有限公司經(jīng)固相化學(xué)合成法合成，通過反相高效液相色譜法純化，純度≥98%，經(jīng)蛋白質(zhì)譜儀檢測(cè)，分子質(zhì)量正確（4 493.74）；SS2 05ZYH33 株、449 株、S3 株、H6 株 均 為 臨 床 分 離株，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物細(xì)菌病研究團(tuán)隊(duì)保存。

Tryptical Soy Broth（TSB）培養(yǎng)基、Tryptical Soy Agar（TSA）培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)OXOID 公司；LIVE/DEADTMBacLight 細(xì)菌活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientifi 公司；戊二醛、鋨酸、丙酮、檸檬酸鉛均購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司；結(jié)晶紫購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；96 孔聚苯乙烯超細(xì)纖維板購(gòu)自美國(guó)Corning 公司。

1.2 LL-37 最小抑制濃度（MIC）的測(cè)定將SS2 05ZYH33 株、449 株、S3 株、H6 株在含10%馬血清的TSA 平板上劃線培養(yǎng)12 h，挑取單菌落，接種于TSB 液體培養(yǎng)基，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)至OD600nm為0.6，用培養(yǎng)基將菌液濃度調(diào)整至1×107cfu/mL。在無菌96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上用培養(yǎng)基2 倍倍比稀釋LL-37（16 μmol/L～1 μmol/L），每孔90 μL，再加入10 μL菌液，于37 ℃5%CO2孵育16 h，每組3 個(gè)重復(fù)。液體清亮的孔中最低濃度即為L(zhǎng)L-37 的MIC。

1.3 LL-37 對(duì)SS2 增殖的影響取過夜培養(yǎng)的SS2 05ZYH33 株，按1∶100（V∶V）轉(zhuǎn)接于10 mL TSB 液體培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加終濃度為1 μmol/L 的LL-37，對(duì)照組不添加LL-37，各組于37 ℃5% CO2靜置培養(yǎng)。每隔1 h 取樣檢測(cè)OD600nm值，每次3 個(gè)重復(fù)，計(jì)算每小時(shí)OD600nm平均值，繪制SS2 的生長(zhǎng)曲線，分析LL-37作用下SS2 的生長(zhǎng)情況。

1.4 LL-37 殺菌活性檢測(cè)將SS2 05ZYH33 株于TSB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以3 500 r/min離心5 min，棄上清，用10 μmol/L PBS（pH7.4）清洗3次，重懸菌體，調(diào)整菌液濃度至2×106cfu/mL。用PBS 在1.5 mL EP 管2 倍倍比稀釋LL-37（16 μmol/L～1 μmol/L），每管500 μL，再加入500 μL 菌液，以500 μL PBS 混合500 μL 菌液為對(duì)照組。37 ℃5%CO2靜置2 h 后，10 倍倍比稀釋為3 個(gè)濃度，涂板統(tǒng)計(jì)剩余活菌數(shù)，分析LL-37 的殺菌活性。

1.5 激光共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察LL-37 對(duì)SS2的殺傷作用將SS2 05ZYH33 株于TSB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，以3 500 r/min 離心5 min 收集菌體，PBS 清洗兩次，將菌液濃度調(diào)整至OD600nm約為0.2，按照LIVE/DEADTMBacLight 細(xì)菌活力檢測(cè)試劑盒操作說明處理菌液。實(shí)驗(yàn)組在共聚焦小皿中加入終濃度為2 μmol/L 的LL-37，對(duì)照組加等體積PBS，每個(gè)小皿加含染料的菌液1 mL，于37 ℃5%CO2靜置3 h 后，利用激光共聚焦掃描顯微鏡（Zesis 800 型）觀察并拍攝。

1.6 透射電鏡觀察LL-37 作用下SS2 的形態(tài)將SS2 05ZYH33 株單菌落接種于TSB 液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。3 500 r/min 離心5 min，棄上清，菌體用10 μmol/L PBS（pH7.4）洗3 次，調(diào)整菌液濃度為2×108cfu/mL。實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為2 μmol/L 的LL-37，對(duì)照組加入等體積PBS，在37 ℃孵育1 h。離心棄上清加2.5%戊二醛4 ℃過夜，100 μmol/L PBS（pH7.2）漂洗3 次，1%鋨酸4 ℃靜置2 h，0.1 mol/L PBS（pH7.2）漂洗3次。在4 ℃條件，分別用雙蒸水配置的50%、70%、90%、100%丙酮脫水，每次10 min，100%丙酮需重復(fù)脫水3 次。加入Epon812 樹脂，室溫包埋過夜后，將樣品置于70 ℃聚合48 h，再用UC6 超薄切片機(jī)制成65 nm～70 nm 厚的切片。用3%醋酸鈾和1%檸檬酸鉛染色，室溫干燥后在透射顯微鏡下觀察LL-37 作用下SS2 的形態(tài)。

1.7 LL-37 抑制SS2 BF 形成能力的測(cè)定SS2 05ZYH33株單菌落接種于含200 μL TSB 液體培養(yǎng)基的96 孔聚苯乙烯超細(xì)纖維板，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為1 μmol/L～8 μmol/L 的LL-37，對(duì)照組不加LL-37，空白對(duì)照為不加菌的TSB 液體培養(yǎng)基，上述各組于37 ℃5%CO2培養(yǎng)36 h 后，洗滌，加入200 μL 無水甲醇，固定15 min后棄去，置于37 ℃晾干。加入100 μL 0.2%結(jié)晶紫染色8 min，洗2 次。加100 μL 33%冰醋酸混勻，測(cè)定OD490nm數(shù)值，取3 次測(cè)定數(shù)值的平均值作為結(jié)果。分析LL-37 抑制SS2 BF 的形成能力。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和處理，用±s表示，利用GraphPad Prism 9軟件做圖。采用Student'st檢驗(yàn)方法分析各組之間的差異性，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 LL-37 對(duì)SS2 MIC 值的測(cè)定結(jié)果本研究采用96 孔板法檢測(cè)LL-37 對(duì)SS2 的MIC 值。結(jié)果顯示，當(dāng)LL-37 濃度為4 μmol/L 與8 μmol/L 時(shí)，培養(yǎng)基為淡黃色清亮液體，無渾濁無沉淀；而2 μmol/L 和不加LL-37 組的液體渾濁有沉淀。以肉眼觀察96 孔板上液體清亮、無渾濁和沉淀的最低藥物濃度即為L(zhǎng)L-37 的MIC，測(cè)得LL-37 對(duì)SS2 05ZYH33 株、449 株、S3 株的MIC 值 均 為4 μmol/L，對(duì)SS2 H6 株 的MIC 值 為8 μmol/L。表明，當(dāng)LL-37 濃度≥8 μmol/L 時(shí)，能夠完全抑制SS2 的生長(zhǎng)，且LL-37 對(duì)本試驗(yàn)中4 株SS2臨床分離株均有良好抑菌效果。

2.2 LL-37對(duì)SS2生長(zhǎng)影響的測(cè)定結(jié)果以SS2培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌液OD600nm值為縱坐標(biāo)，繪制SS2 生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，SS2 在接種后0～4 h 為遲緩期，增殖較慢；4 h～8 h 為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，SS2 快速大量增殖；8 h后進(jìn)入平臺(tái)穩(wěn)定期，增殖減少。在1 μmol/L LL-37的作用下，在接種早期（0～4 h）SS2能夠正常生長(zhǎng)，但從接種5 h開始，添加LL-37的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，細(xì)菌數(shù)量減少，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢（圖1）。從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期到平臺(tái)期，實(shí)驗(yàn)組菌數(shù)均低于對(duì)照組菌數(shù)。表明LL-37在1 μmol/L濃度即對(duì)SS2的增殖有抑制作用。

圖1 SS2在LL-37作用下的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of SS2 after treated by LL-37

2.3 LL-37 對(duì)SS2 殺菌活性的測(cè)定結(jié)果為了進(jìn)一步探究LL-37在不同濃度下對(duì)SS2的殺菌效果，本研究將SS2分別在0～16 μmol/L LL-37條件下共孵育2 h后，10 倍倍比稀釋涂板，計(jì)算剩余存活菌數(shù)。結(jié)果顯示，SS2 在4 μmol/L～16 μmol/L LL-37 作用下均無菌落生長(zhǎng)，2 μmol/L 和1 μmol/L LL-37 與對(duì)照組相比，也表現(xiàn)出良好的殺菌效果，且差異極顯著（P＜0.001）（圖2）。表明4 μmol/L LL-37 能完全殺滅SS2，殺菌效果良好，是潛在的抗菌藥物。

圖2 LL-37對(duì)SS2的殺菌活性Fig.2 Bactericidal activity of LL-37 against SS2

2.4 CLSM 觀察LL-37 對(duì)SS2 的殺傷作用碘化丙啶（Propidium iodide，PI）是一種釋放紅色熒光的DNA染料，不能通過活細(xì)胞膜，因此只能穿過破損的細(xì)胞膜染死菌。綠菁（SYTO 9）是一種釋放綠色熒光的核酸染料，具有細(xì)胞膜通透性，常用于染活菌。本研究將LL-37 作用后的SS2 與上述兩種染料共孵育，通過CLSM 觀察可見，SS2 呈鏈狀排列，2 μmol/L LL-37 作用下SS2 被PI 染紅，而對(duì)照組僅被染綠（圖3）。表明LL-37 在2 μmol/L 濃度下能夠破壞 和殺傷SS2 的膜結(jié)構(gòu)。

圖3 LL-37作用SS2的CLSM圖像Fig.3 CLSM images of SS2 after treated by LL-37

2.5 透射電鏡觀察LL-37作用下的SS2形態(tài)為進(jìn)一步探究LL-37 對(duì)SS2 形態(tài)的影響，本研究用2 μmol/L LL-37 作用SS2，經(jīng)固定、脫水、包埋、聚合、切片、染色后，利用透射電鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果可見，LL-37作用后的SS2 失去了原有的橢圓形態(tài)，膜結(jié)構(gòu)破壞、內(nèi)容物流出，細(xì)胞崩解死亡（圖4）。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)LL-37對(duì)SS2的殺傷源自其對(duì)膜結(jié)構(gòu)的破壞。

圖4 LL-37作用后SS2的透射電鏡圖像Fig.4 TEM images of SS2 after treated by LL-37

2.6 LL-37 抑制SS2 BF 形成的檢測(cè)結(jié)果本研究通過不同濃度LL-37 作用SS2 BF，結(jié)晶紫染色后冰醋酸溶解，檢測(cè)OD490nm值。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，2 μmol/L LL-37 能夠顯著降低SS2 BF 的形成（P＜0.05），4 μmol/L～8 μmol/L LL-37 能夠極顯著降低SS2 BF 的形成（P＜0.001）（圖5），表明LL-37 能夠抑制SS2 BF 的形成，抑制效果隨其劑量的增加而增強(qiáng)，呈劑量依賴性。

圖5 LL-37對(duì)SS2 BF形成能力影響的測(cè)定結(jié)果Fig.5 The biofilm formation of SS2 under LL-37

3 討 論

SS 經(jīng)由上呼吸道感染，會(huì)在鼻腔、扁桃體定植，這給防范該菌感染造成一定的難度?，F(xiàn)臨床已有SS 疫苗，但SS 血清型多達(dá)33 種[5]，不同血清型之間沒有交叉保護(hù)性。即使同一血清型的SS，其毒力差異也較大：目前普遍認(rèn)為胞外因子（Extracellular factor protein，EF）和溶菌酶釋放蛋白（Muramidase released protein，MRP）是SS 重要的毒力因子，但加拿大分離的SS2 致病株大多為MRP-和EF-表型[6]。SS眾多的血清型和毒力因子分布的差異性往往會(huì)影響SS 疫苗的免疫保護(hù)效力。因此，能有效對(duì)抗SS 的新型藥物研發(fā)十分必要。本實(shí)驗(yàn)探究了抗菌肽LL-37對(duì)SS2 的體外抑菌作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LL-37 具有良好的殺菌活性，4 μmol/L 的濃度就可以有效地抑制和殺滅SS，并且1 μmol/L 濃度也會(huì)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，是一種潛在的抗SS 藥物。

抗生素的作用靶點(diǎn)單一，如β-內(nèi)酰胺類藥物特異性結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞膜上的青霉素結(jié)合蛋白（Penicillin-binding proteins，PBPs），從而阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁的合成[7]。一旦靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)或位置發(fā)生變化，藥物與細(xì)菌親和力降低，便喪失了其抗菌效能。不合理地使用抗生素或長(zhǎng)期藥物刺激，極易造成細(xì)菌耐藥性。在一項(xiàng)150 株SS 臨床分離株對(duì)8 種常見藥物耐藥性的實(shí)驗(yàn)中，檢出29 株耐青霉素的SS，16 株為8 重耐藥菌[8]。而抗菌肽的抗菌作用是憑借其攜帶的正電荷特異性吸附帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞膜，從而改變膜的通透性使細(xì)菌內(nèi)容物流出，導(dǎo)致細(xì)菌崩解死亡。相較于抗生素的“靶點(diǎn)”變“把柄”，抗菌肽更不易產(chǎn)生耐藥性[9]。本研究通過CLSM和透射電鏡觀察，證實(shí)了抗菌肽LL-37 對(duì)SS2 的殺傷源自其對(duì)細(xì)胞膜的破壞。

BF 是一種包裹在細(xì)菌產(chǎn)生的胞外聚合物基質(zhì)中的微生物聚集體，其成分復(fù)雜且表面致密光滑，不易被機(jī)體吞噬細(xì)胞攝取和殺滅[10-12]。臨床上常用青霉素類、頭孢類抗生素對(duì)抗SS 感染，但上述藥物均屬于增殖期殺菌劑，而形成BF 的細(xì)菌氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)受限，生長(zhǎng)增殖緩慢，抗生素不能表現(xiàn)出良好的殺菌效果。本研究進(jìn)行了LL-37 抗SS2 BF 形成的試驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)LL-37 能夠抑制SS2 BF 的形成，進(jìn)一步展現(xiàn)抗菌肽治療SS 感染的優(yōu)越性。

本研究系統(tǒng)評(píng)價(jià)了抗菌肽LL-37 對(duì)SS2 的體外抗菌作用；初步闡明了LL-37 的殺菌機(jī)制是破壞SS2 細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)菌內(nèi)容物流出，導(dǎo)致菌體崩解死亡；并證明了LL-37 的抗BF 作用。本研究為抗菌肽類藥物的臨床應(yīng)用和抗SS 藥物的研發(fā)提供參考。