豬鏈球菌3種毒力因子多細胞表位靶向DC重組蛋白DC3pep-SDZ的構(gòu)建及安全性檢測

于恩遠，潘晨浩，姜 軒，李 穎，趙瑞利*，張 欣，曾 君，榮睿璠，金天明，于曉雪

（1.天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院/天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300392；2.天津市動物疫病預(yù)防控制中心，天津 300402）

豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）是一種可引起人獸共患傳染病的革蘭氏陽性致病菌，通常引起病豬的腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥和支氣管肺炎等疾病，患病豬致死率高達80%[1-2]。SS 血清型眾多，目前主要流行且危害程度較大的有2 型（SS2）、3 型（SS3）、7 型（SS7）、9 型（SS9）等SS[3]。由于病豬常由多種不同血清型菌株混合感染，使得目前普遍的SS 滅活苗在型間的交叉保護效果并不理想。隨著近年來多種在不同型SS中保守存在的毒力因子不斷地被發(fā)現(xiàn)，針對這些保守毒力因子的免疫表位制備重組蛋白，為開發(fā)具有型間保護效果的亞單位疫苗提供了思路。

本研究選取了SS2、SS3 和SS9 中高度保守的分泌型DNA 核酸酶A（SsnA）、二氫硫辛酰胺脫氫酶（DLDH）、鋅轉(zhuǎn)運蛋白（ZnuA）3 種毒力因子作為保護性抗原。SsnA 是SS 與細胞互作時分泌的核酸內(nèi)切酶，它可以水解破壞中性粒細胞胞外陷阱（NETs）顆粒的形成，已有研究表明SsnA 與鋁膠佐劑配合后免疫小鼠，對不同型SS 的感染具有免疫保護作用[4]。DLDH 為丙酮酸脫氫酶系組分之一，參與細胞呼吸能量代謝[5]，孔里程等將DLDH 與磷酸-3-甘油醛脫氫酶（GAPDH）、溶菌酶釋放蛋白（MRP）的B 細胞表位串聯(lián)表達，證實了DLDH 具有作為保護性抗原的潛力[6]。ZnuA 在SS 的致病中起到了重要作用，韓明月等將SS2中克隆出的ZnuA 基因原核表達，免疫新西蘭兔后獲得了高效價的兔抗ZnuA 血清，驗證了ZnuA的免疫原性[7]。

樹突狀細胞（Dendritic cells，DC）是一類特殊的抗原遞呈細胞，它能識別并將捕獲得到的外源抗原提呈給并激活T 細胞，同時也能刺激B 細胞的分化而產(chǎn)生IgG[8]。12 聚體DC 靶向肽（DC3pep，一級序列FYPSYHSTPQRP）是一種由噬菌體篩選得到的可以和人類、小鼠、貓科、禽、豬、牛、馬等動物DC 相結(jié)合的短肽[9]。試驗表明將DC3pep 與豬繁殖呼吸綜合征病毒（PRRSV）GP5 蛋白中和性B 細胞表位融合展示于噬菌體表面，免疫小鼠后的血清中特異性抗體水平均高于無DC3pep 的重組噬菌體免疫組[8]。與DC3pep 融合禽流感病毒表面血凝素（HA）蛋白的重組乳酸桿菌也可以有效激活DC 并增強免疫原向T 細胞和B 淋巴細胞的遞呈能力[10]。

本研究以生物信息學軟件分析得到了SsnA、DLDH 和ZnuA 3 種保護性抗原的B 細胞與輔助T（Th）細胞優(yōu)勢抗原表位，并將這些優(yōu)勢B/Th 細胞表位與DC3pep 氨基酸序列串聯(lián)，構(gòu)建并制備了重組蛋白DC3pep-SDZ，檢測了其生物安全性，為后續(xù)SS 重組亞單位疫苗的免疫保護評價及開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株和細胞表達質(zhì)粒pET-28a 和大腸桿菌E. coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；豬腎細胞（PK15）、豬腸上皮細胞（IPEC-J2）由天津農(nóng)學院獸醫(yī)學實驗室保存。

1.2 主要試劑小鼠抗6×His 單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG-HRP 購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購自上海翌圣生物科技有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；DNA 限制性內(nèi)切酶、Ni-NTA 鎳柱購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；CCK-8 試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 生物信息學軟件篩選3 種毒力因子的優(yōu)勢抗原表位NCBI 登錄的SS 毒力因子ZnuA、SsnA 和DLDH蛋白的氨基酸序列ABP91052.1、 ABP90934.1 和AKG41058.1，序列長度分別為317aa、1059aa、586aa。

利用TMHMM 工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）及SignalP 工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分別在線分析3 種毒力因子蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)。利用TMHMM 工具分析蛋白跨膜區(qū)、SignalP 工具分析蛋白信號肽。

分別利用人工網(wǎng)絡(luò)神經(jīng)算法ABCpred（http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/ABC_submissi on.html）和基于氨基酸的親水性、柔韌性、可及性、極性、暴露表面、轉(zhuǎn)角和隱形馬爾可夫模型的BepiPred（http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/）在線預(yù)測3 種毒力因子的B 細胞表位，選取兩種方法預(yù)測的重疊部分；利用ProPred 程序預(yù)測3 種毒力因子的Th 細胞表位，分別選擇DRB1-0101、DRB1-0102、DRB1-0301 預(yù)測細胞表位類型[11]。

利用Protean 軟件分析3 種毒力因子的親水性和抗原性，及預(yù)測得到的B/Th 細胞表位是否均處于親水性與抗原性較好區(qū)段。最后利用SOPMA（https://npsa- prabi. ibcp.fr/cgi- bin/npsa_automat.pl?page=npsasopma.Html）方法分析所篩選的B/Th 細胞表位的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，判斷表位是否處于其毒力因子中無規(guī)則卷曲及轉(zhuǎn)角、易于產(chǎn)生抗體的暴露表面的位置[6]。

1.4 重組蛋白的設(shè)計及重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建重組蛋白的氨基酸序列設(shè)計，按蛋白N 端起始DC3pep～SsnA B 細胞表位～SsnA Th 細胞表位～DLDH B 細胞表位～DLDH Th 細胞表位～ZunA B 細胞表位～ZunA Th 細胞表位C 端結(jié)束的順序，將各個多肽氨基酸序列依次串聯(lián)，各多肽間接頭氨基酸采用4個甘氨酸（GGGG）的柔性短肽序列連接[11]，重組蛋白命名為DC3pep-SDZ。

將DC3pep-SDZ 氨基酸序列利用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）在線工具分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)后，將其轉(zhuǎn)化為核苷酸序列，并根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性對該核苷酸序列進行優(yōu)化，N 端和C 端添加酶切位點BamH I和XhoI，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-DC3pepSDZ。目的基因的合成及載體構(gòu)建均由上海捷瑞生物工程有限公司完成。將合成的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細胞，挑取單菌落進行PCR 鑒定，DC3pep-SDZ 蛋白編碼基因序列上游引物：5'-GGAT CCTTTTATCCGAGCTATCA-3'/下游引物：5'-CTCGAG CGGGGCATACAGG-3'。PCR 產(chǎn) 物 經(jīng)1% 瓊 脂 糖 凝 膠電泳檢測后，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.5 重組蛋白的表達及純化取1.4 鑒定為陽性的pET28a-DC3pepSDZ/BL21培養(yǎng)至菌液OD600nm值約為0.5時加入終濃度1 mmol/L的IPTG，6 h后收集菌液用PBS洗滌，重懸，冰浴超聲破碎，離心收集上清與沉淀，分別經(jīng)SDS-PAGE 后電轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，小鼠抗6×His 單克隆抗體為一抗（1∶5 000），孵育90 min，山羊抗小鼠IgG-HRP為二抗（1∶3 000），孵育60 min，ECL 發(fā)光顯色，western blot鑒定表達產(chǎn)物的可溶性。

將表達的可溶產(chǎn)物利用Ni-NTA 親和層析鎳柱純化，純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE 檢測后超濾濃縮，采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。

1.6 DC3pep-SDZ 蛋白體外溶血試驗取新鮮豬血10 mL，參考文獻[12,13]的方法制備2%的紅細胞混懸液，設(shè)樣品組終濃度分別為500 μg/mL、250 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL的DC3pep-SDZ 蛋白共7 組；陰性對照組為0.9%氯化鈉溶液與2%紅細胞的混懸液；陽性對照組為超純水混合2%紅細胞混懸液。各組輕輕混勻，37 ℃溫孵3 h，2 000 r/min 離心10 min，取上清液，分別測定各組OD450nm值，計算其溶血率：溶血率=（A 樣品組平均OD450nm-A 陰性組OD450nm）/（A陽性組OD450nm-A陰性組OD450nm）×100%。若溶血率＞5%，則判定為溶血。

1.7 DC3pep-SDZ 蛋白的細胞毒性檢測取對數(shù)生長期的PK15 與IPEC-J2 細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度至1×105/mL 時，以100 μL/孔接種至96 孔板，在細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。將DC3pep-SDZ 蛋白分別稀釋為500 μg/mL、250 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL 7 個實驗組，另設(shè)1 組無蛋白對照組，實驗組與對照組每組5 個復(fù)孔，100 μL/孔加入96 孔板，于細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h 后每孔加入10 μL CCK8 溶液，繼續(xù)孵育1 h，測定各孔OD450nm值，計算細胞相對增殖率（Relative growth rate，RGR）。RGR=（實驗組OD450nm平均值/對照組OD450nm平均值）×100%（平均值為棄掉最高值與最低值后余下3 個孔的均值）。

2 結(jié) 果

2.1 優(yōu)勢抗原表位的篩選利用TMHMM與SignalP工具在線分析3 種毒力因子蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)。TMHMM預(yù)測結(jié)果顯示SsnA 跨膜區(qū)（以在氨基酸序列中的肽段位置表示）為aa28～aa50、aa1036～aa1053，胞內(nèi)片段位于N 端aa1～aa27、C 端aa1054～aa1059，其余均為胞外片段；DLDH 無跨膜區(qū)及胞內(nèi)片段，屬于胞外蛋白；ZunA 跨膜區(qū)為aa1～aa35，無胞內(nèi)片段，胞外片段位于aa36～aa317。SignalP 預(yù)測結(jié)果顯示SsnA 信號肽為aa1～aa56，DLDH 無信號肽，ZunA 信號肽為aa28～aa30。

選取ABCpred 與BepiPred 2 種方法預(yù)測結(jié)果重疊部分的B 細胞表位和利用ProPred 程序預(yù)測得到的Th細胞表位，利用Protean 軟件與SOPMA 工具分別驗證了它們的親疏水性、抗原性和二級結(jié)構(gòu)后，排除上述胞內(nèi)、跨膜區(qū)域和信號肽，最終獲得了3 種毒力因子B/Th 細胞線性表位短肽序列與表位所處毒力因子位置（表1）。

表1 篩選得到的B/Th細胞表位短肽序列與位置Table 1 The amino acid sequences of B/Th cell epitopes were screened

2.2 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建篩選得到的B/Th 細胞表位所處各自其毒力因子的位置作圖見圖1A，按1.4的方法連接DC3pep 短肽及表位，構(gòu)建DC3pep-SDZ蛋白（圖1B）。將設(shè)計得到的DC3pep-SDZ 蛋白氨基酸序列經(jīng)ProtParam 在線分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示DC3pep-SDZ 蛋白分子式為C1429H2209N429O517S2，分子質(zhì)量為44 ku，理論等電點（pI）為4.65，平均親水性（GRAVY）為-0.462，屬于親水性蛋白。

圖1 篩選得到的3種毒力因子抗原表位位置（A）及DC3pep與篩選得到的表位連接方式示意圖（B）Fig. 1 Schematic diagram screening epitopes in 3 virulence factors(A)and the mode of connecting DC3pep with screened epitopes(B)

氨基酸序列轉(zhuǎn)化為核苷酸序列后，將合成質(zhì)粒pET28a-DC3pepSDZ 轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細胞，菌落PCR 鑒定可見1 100 bp 目的基因條帶（圖2），測序結(jié)果經(jīng)BLAST 比對也與預(yù)先設(shè)計序列一致，表明重組表達載體構(gòu)建正確。

圖2 重組質(zhì)粒pET28a-DC3pep-SDZ的PCR鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET28a-DC3pep-SDZ by PCR

2.3 DC3pep-SDZ 蛋白的表達與純化取誘導(dǎo)后的pET28a-DC3pepSDZ/BL21（DE3）菌液，離心超聲破碎后分別收集上清和沉淀進行western blot 分析，結(jié)果顯示，重組蛋白主要以可溶性蛋白表達于上清，為可溶性蛋白，少量在沉淀中（圖3A）。

將破碎后上清液用0.45 μm 濾膜過濾后加至親和層析鎳柱中，以不同濃度咪唑洗脫目的蛋白，SDSPAGE 結(jié)果顯示200 mmol/L 咪唑溶液洗脫可得到高純度DC3pep-SDZ 蛋白（圖3B）。純化后的重組蛋白經(jīng)10 ku 超濾管濃縮，BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度為5.60 mg/mL。

圖3 DC3pep-SDZ蛋白可溶性western blot分析（A）及純化蛋白SDS-PAGE檢測（B）Fig.3 The solubility analysis of DC3pep-SDZ protein by western blot(A)and detection of purified protein by SDS-PAGE(B)

2.4 DC3pep-SDZ 蛋白體外溶血試驗結(jié)果通過制備2%豬紅細胞懸液，分別與濃度為500 μg/mL、250 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL的DC3pep-SDZ 蛋白37 ℃孵育3 h 后，樣品組與陰性組試管紅細胞全部下沉，上層液體無色澄清，而陽性組溶液呈現(xiàn)澄紅色，溶血現(xiàn)象明顯。溶血率計算結(jié)果顯示，各實驗組的溶血率均低于5%（表2）。表明5 μg/mL～500 μg/mL 濃度的DC3pep-SDZ蛋白不會對豬紅細胞產(chǎn)生溶血反應(yīng)。

表2 各組蛋白溶血率計算結(jié)果Table 2 The results of the protein hemolysis rate calculation

2.5 DC3pep-SDZ 蛋白細胞毒性檢測結(jié)果濃度為500 μg/mL、250 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL的重組蛋白分別作用于PK15 與IPEC-J2 細胞24 h 后，進行CCK8 細胞增殖試驗，結(jié)果顯示，各實驗組細胞與對照組細胞生長狀況均一致且良好，500 μg/mL 最高蛋白濃度實驗組細胞也與對照組細胞形態(tài)均一致，生長旺盛、排列密集、規(guī)則（圖4A），按照1.7中細胞RGR 公式計算得出，最高蛋白濃度500 μg/mL時PK15與IPEC-J2細胞RGR可達到98.5%、99.6%。實驗組與對照組RGR 相比均無顯著差異（P＞0.05）（圖4B），表明5 μg/mL～500 μg/mL濃度的DC3pep-SDZ蛋白不會對細胞產(chǎn)生毒性作用。

圖4 PK15和IPEC-J2細胞形態(tài)（A）及細胞RGR（B）Fig.4 PK15 and IPEC-J2 cell morphology(A)and cell RGR(B)

3 討 論

梁陽秋等在構(gòu)建斑馬魚SS 感染模型進行GAPDH、MRP 和DLDH 蛋白的免疫保護實驗時發(fā)現(xiàn)，若將2 種及以上的純免疫原性蛋白串聯(lián)融合表達，其重組蛋白的免疫保護效力要遠大于單抗原的免疫效果[14]。在此基礎(chǔ)上，孔里程等又將GAPDH、MRP、DLDH 的B 細胞表位串聯(lián)，構(gòu)建了多表位蛋白疫苗[6]。多表位串聯(lián)相較于全蛋白疫苗可以使抗原免疫單位有效優(yōu)化和集中，保證了抗原結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的同時還增加了免疫應(yīng)答的廣譜度，能夠更有效地提高免疫應(yīng)答的特異性，由此在設(shè)計蛋白序列時，本研究選取了DLDH、SsnA 和ZnuA 蛋白優(yōu)勢的B/Th 細胞表位加以串聯(lián)。

為了提升免疫保護過程中抗原表位的遞呈能力、高效地激發(fā)細胞免疫應(yīng)答，本研究將表位與DC3-pep 串聯(lián)以期達到靶向DC 的目的。DC 是目前所發(fā)現(xiàn)最強的抗原遞呈細胞，其在未成熟及成熟時均具備抗原遞呈能力，除此之外，DC 本身的遷移能力也是啟動機體保護性促炎癥反映和致耐受性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵，疫苗中靶向DC 的策略已屢見不鮮[10]。在連接各表位與DC3-pep 時，各短肽間的“橋梁”采用了GGGG 柔性序列，該序列不僅能使各肽段間相對獨立、減少各表位間的相互影響，還能使各肽段保持相應(yīng)的分子剛性[15]。

表位的篩選借助生物信息學軟件及相關(guān)工具可同時對抗原的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進行精確的分析，本研究B 細胞表位預(yù)測用到的BepiPred 方法主要是根據(jù)氨基酸的理化性質(zhì)和隱形馬爾可夫模型進行表位預(yù)測，全方位的分析可以提高表位的準確性；ABCpred 方法是依據(jù)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，對于表位選擇的準確率較高。B 細胞表位的分析采用該兩種方法預(yù)測后取之重疊部分，能進一步提高牢固優(yōu)勢B細胞表位的精準性。Th 表位是與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合的短肽，可活化Th細胞，以輔助B細胞產(chǎn)生抗體。本研究Th 細胞表位采用的Propred 預(yù)測程序是根據(jù)可以與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合槽結(jié)合的Th 細胞表位肽段匯總所建立的數(shù)據(jù)庫，通過MHC-Ⅱ類分子結(jié)合肽預(yù)測，是預(yù)測優(yōu)勢Th細胞表位的工具之一，結(jié)果較為準確。

綜上，本研究利用生物信息學軟件篩選了2、3、9 型SS 共有的毒力因子SsnA、DLDH、ZnuA 優(yōu)勢B/Th 細胞表位，結(jié)合DC 細胞靶向策略，首次設(shè)計出重組蛋白DC3pep-SDZ 并原核表達，經(jīng)2%豬紅細胞體外溶血試驗及CCK8 細胞增殖試驗證明了DC3pep-SDZ 重組蛋白具有生物安全性，可進行后期的免疫保護效果評價。本研究為開發(fā)安全有效的2、3、9型SS 候選三價亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。