豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒和塞內(nèi)卡病毒滅活二聯(lián)疫苗免疫效力實(shí)驗(yàn)

段衛(wèi)同，王海偉，孫明霞，王尚輝，王 剛，于 力，蔡雪輝，涂亞斌

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150069）

豬圓環(huán)病毒2 型（Porcine circovirus type 2，PCV2）感染可引起豬的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎腎病綜合征（PDNS）、豬呼吸道綜合征（PRDC）、仔豬先天性震顫（CT）、圓環(huán)病毒相關(guān)性腸炎等，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。PCV2主要侵害豬的免疫系統(tǒng)，降低免疫力，進(jìn)而產(chǎn)生免疫抑制，常與其他病原體混合感染[2]。目前針對(duì)豬PCV2 感染仍缺少行之有效的治療方案，疫苗免疫已被證明是最有效的防控手段。大量研究表明，PCV2 ORF2 基因編碼的Cap 蛋白包含重要的病毒中和抗原表位，其能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。此外，Cap 蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在體外能夠自組 裝 成 病 毒 樣 顆 粒（Virus-like particles，VLP）[3]。VLP 具有與天然病毒完全一致的形態(tài)結(jié)構(gòu)，由于缺乏DNA 或RNA 等遺傳物質(zhì)，因此不具有感染性，但其能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)[4]。目前，已有的商品化疫苗中由PCV2 Cap 蛋白自組裝而成的基因工程亞單位疫苗（PCV2-VLP）與PCV2 滅活疫苗相比，前者具有更好的免疫保護(hù)作用[5]。

塞內(nèi)卡病毒（Seneca valley virus，SVV）又被稱為A 型塞內(nèi)卡病毒（Seneca virus A，SVA）。 2002 年美國(guó)研究人員首次在污染的人胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞（PER.C6）中分離出該病毒，將其命名為SVV-001[6]。2015年，我國(guó)首次在廣東省某豬場(chǎng)檢測(cè)并分離到SVV，命名為CH-01-2015，此后陸續(xù)在湖北、遼寧、河南、上海、福建、黑龍江和甘肅等省份檢測(cè)到SVV[7]。SVV 感染引起的臨床癥狀與豬口蹄疫、豬水皰病以及水皰性口炎臨床癥狀極為相似，急性感染期主要表現(xiàn)為鼻鏡、口腔、舌、蹄冠等部位皮膚或者黏膜出現(xiàn)水皰，輕者表現(xiàn)為發(fā)熱、嗜睡、厭食等臨床癥狀，重者死亡[8]。目前， SVV 雖不像口蹄疫病毒（FMDV）一樣能夠引起公共衛(wèi)生危害和造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，但隨著對(duì)SVV 研究的不斷深入，其對(duì)宿主的致病性和流行的規(guī)模性已呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)[9]。但到目前為止我國(guó)臨床上尚無(wú)可用的商品化SVV 疫苗，這不利于我國(guó)對(duì)該病原感染的防控。

基于此，本研究將PCV2-VLP 亞單位疫苗和SVV滅活疫苗混合制成二聯(lián)疫苗，進(jìn)行仔豬的免疫保護(hù)試驗(yàn)，評(píng)價(jià)該二聯(lián)疫苗的免疫效力，為PCV2 和SVV二聯(lián)疫苗的研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料PCV2、SVV、PAM 細(xì)胞、BHK-21 細(xì)胞均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所鑒定、制備、保存；PCV2-VLP 及SVV 全病毒二聯(lián)滅活疫苗（批號(hào)為2020001）、PCV2-VLP 疫苗及SVV滅活疫苗均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所制備；PCV2-dCap-ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京金諾百泰生物技術(shù)有限公司；ISA201 佐劑購(gòu)自賽彼科（上海）特殊化學(xué)品有限公司。21 日齡～28 日齡健康仔豬（PCV2、SVV 抗原抗體陰性豬），由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將21 日齡～28 日齡健康仔豬35 頭，隨機(jī)分為7 組，每組5 頭，其中陰性對(duì)照組1 組；攻毒對(duì)照組兩組，分別感染PCV2、SVV；其他4 組為免疫攻毒組，各組仔豬采用相應(yīng)的疫苗按照1 mL/頭接種，14 d 后加強(qiáng)免疫一次，對(duì)照組接種滅菌生理鹽水，1 mL/頭。所有仔豬均于相同條件下隔離飼養(yǎng)（表1）。

表1 免疫接種試驗(yàn)方案Table 1 Immunization program

1.3 各組豬血清PCV2抗體的ELISA檢測(cè)在首免后14 d、21 d、28 d、35 d分別對(duì)各實(shí)驗(yàn)組仔豬采血，分離血清，采用PCV2抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組仔豬血清中PCV2 抗體水平。實(shí)驗(yàn)有效性判定標(biāo)準(zhǔn)為：陽(yáng)性對(duì)照OD450nm平均值＞0.4，陰性對(duì)照OD450nm平均值＜0.3。判定標(biāo)準(zhǔn)：S/P值≥0.4判為陽(yáng)性；S/P值＜0.4判為陰性；0.3≤S/P值＜0.4判為可疑。S/P=[（樣品OD450nm值-陰性O(shè)D450nm均值）/（陽(yáng)性O(shè)D450nm均值-陰性O(shè)D450nm均值）]。

1.4 各組豬血清SVV 中和抗體檢測(cè)在首免后7 d、14 d、21 d、28 d 分別對(duì)各實(shí)驗(yàn)組仔豬采血，分離血清并作2倍倍比稀釋（21～28）后，分別與等量200 TCID50的SVV 孵育。選用BHK-21 細(xì)胞為感染細(xì)胞，采用Reed 和Muench 兩氏法計(jì)算細(xì)胞病變（CPE）數(shù)，以50%細(xì)胞孔不產(chǎn)生CPE 的血清稀釋度為該份血清的中和抗體效價(jià)。

1.5 PCV2 攻毒試驗(yàn)二免后14 d（首免后28 d），1、3、5 組仔豬用PCV2 強(qiáng)毒攻毒，每頭滴鼻2 mL，肌肉注射2 mL（105TCID50/mL）。攻毒后連續(xù)觀察28 d后迫殺，采集肺臟，以鼠抗PCV2-Cap 蛋白（1∶10）為一抗，HRB 標(biāo)記的兔抗鼠IgG（1∶10）為二抗，采用免疫組織化學(xué)（IHC）檢測(cè)PCV2 抗原，根據(jù)體溫、平均日增重和IHC PCV2 抗原檢測(cè)結(jié)果綜合判定結(jié)果。仔豬發(fā)病判定指標(biāo)如下：a、體溫升高（≥40 ℃），持續(xù)3 d以上；b、免疫組仔豬平均日增重高于攻毒對(duì)照組（P＜0.05），日增重=（攻毒后第28 d體重-攻毒首日體重）/28，免疫組與陰性對(duì)照組間平均日增重差異顯著即判為發(fā)病；c、IHC檢測(cè)肺部PCV2抗原；上述3項(xiàng)指標(biāo)符合任意2 項(xiàng)即判定為發(fā)病。陰性對(duì)照組仔豬應(yīng)全部正常、攻毒對(duì)照組仔豬至少4 頭發(fā)病、疫苗免疫仔豬至少4頭正常，即可以認(rèn)為實(shí)驗(yàn)結(jié)果合理可靠。

1.6 SVV攻毒試驗(yàn)二免后14 d（首免后28 d），第2、4、6 組仔豬用SVV 強(qiáng)毒攻毒，每頭滴鼻2 mL，肌肉注射2 mL（109.5TCID50/mL）。攻毒后每天觀察臨床癥狀，以鼻鏡、口腔、舌、蹄冠等部位皮膚或者黏膜出現(xiàn)典型的水皰癥狀即判為發(fā)病。陰性對(duì)照組仔豬應(yīng)全部正常、攻毒對(duì)照組仔豬至少4 頭發(fā)病、疫苗免疫組仔豬至少4 頭正常，即可以認(rèn)為實(shí)驗(yàn)結(jié)果合理可靠。

2 結(jié) 果

2.1 PCV2 特異性抗體檢測(cè)結(jié)果將二聯(lián)疫苗和PCV2 單苗免疫仔豬后每周采血分離血清，利用間接ELISA檢測(cè)仔豬血清中PCV2 Cap蛋白特異性抗體，結(jié)果顯示：首免后14 d，PCV2-VLP 單苗及二聯(lián)疫苗免疫組仔豬均能檢測(cè)到PCV2 特異性抗體；首免后21 d這兩組豬的抗體均為陽(yáng)性，并且隨著免疫時(shí)間延長(zhǎng)抗體效價(jià)持續(xù)上升，35 d 達(dá)到最高值（OD450nm=1.52）；單苗免疫組PCV2 特異性抗體高于二聯(lián)疫苗免疫組，但二者無(wú)顯著差異（P＞0.05）；陰性對(duì)照組仔豬PCV2 特異性抗體無(wú)明顯上升趨勢(shì)，全部為陰性（圖1）。表明二聯(lián)疫苗及PCV2-VLP 單苗均能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的PCV2特異性抗體。

圖1 免疫仔豬血清PCV2抗體檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The results of PCV2 antibody detection in serum

2.2 SVV 中和抗體的測(cè)定結(jié)果將二聯(lián)疫苗和SVV單苗免疫仔豬后每周采血分離血清，檢測(cè)免疫后仔豬血清中的SVV 中和抗體。結(jié)果顯示：二聯(lián)疫苗免疫組與SVV單苗免疫組仔豬SVV中和抗體效價(jià)相當(dāng)，首免后14 d各免疫組仔豬SVV中和抗體效價(jià)達(dá)到1∶50以上，并且隨著免疫時(shí)間延長(zhǎng)中和抗體效價(jià)持續(xù)上升，28 d 達(dá)到峰值（1∶204）；單苗免疫組SVV 中和性抗體高于二聯(lián)疫苗免疫組，但二者無(wú)顯著差異（P＞0.05）；PBS 對(duì)照組仔豬SVV 中和抗體檢測(cè)結(jié)果均為陰性（圖2）。表明二聯(lián)疫苗在刺激機(jī)體產(chǎn)生SVV 中和抗體能力方面與SVV 單苗相當(dāng)。

圖2 免疫仔豬血清SVV中和抗體測(cè)定結(jié)果Fig.2 The results of SVV neutralizing antibody detection

2.3 PCV2 攻毒試驗(yàn)結(jié)果首免后28 d 對(duì)1、3、5組PCV2 攻毒后仔豬體溫、平均日增重和PCV2 抗原進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示二聯(lián)疫苗組和PCV2 單苗組均有1 頭仔豬連續(xù)3 d 以上體溫≥40 ℃，并且IHC 結(jié)果為陽(yáng)性；PCV2 攻毒對(duì)照組有4 頭仔豬連續(xù)3 d 以上體溫≥40 ℃，并且IHC 結(jié)果為陽(yáng)性；PCV2 單苗免疫組平均日增重與陰性對(duì)照組相當(dāng)，但顯著高于二聯(lián)疫苗組和PCV2 攻毒對(duì)照組（P＜0.05）。二聯(lián)疫苗組和PCV2 單苗組對(duì)仔豬的免疫保護(hù)率均為80%，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表2。表明二聯(lián)疫苗與PCV2-VLP 單苗對(duì)仔豬PCV2 感染均能夠提供相同效果的免疫保護(hù)。

表2 PCV2攻毒試驗(yàn)結(jié)果Table 2 PCV2 challenge protection efficacy

2.4 SVV 攻毒試驗(yàn)結(jié)果首免后28 d 對(duì)第2、4、6組仔豬進(jìn)行SVV 強(qiáng)毒攻毒，觀察各組仔豬臨床癥狀，結(jié)果顯示，攻毒對(duì)照組在攻毒后7 d 所有仔豬蹄部均出現(xiàn)典型的水泡樣癥狀，攻毒14 d 后攻毒對(duì)照組仔豬蹄部損傷部位出現(xiàn)結(jié)痂；二聯(lián)疫苗免疫組及SVV 單苗疫苗免疫組攻毒后所有仔豬蹄部均無(wú)任何病變（圖3）。表明二聯(lián)疫苗及SVV 單苗免疫仔豬均能對(duì)SVV 感染提供良好的免疫保護(hù)效力。

圖3 SVV攻毒試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 SVV challenge protection efficacy

3 討 論

目前針對(duì)PCV2 的VLP 疫苗免疫效果已在臨床中得到了驗(yàn)證[10]。有研究表明，PCV2 Cap 蛋白自組裝而成的基因工程亞單位疫苗（PCV2-VLP）與PCV2滅活疫苗相比，前者具有更好的免疫保護(hù)作用[5]。SVV 是近年在多個(gè)國(guó)家出現(xiàn)的一種跨境傳播病毒，可導(dǎo)致典型的水皰型臨床癥狀，已對(duì)多國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了不同程度的影響。本研究首次研制了PCV2-VLP和SVV 全病毒滅活二聯(lián)疫苗，仔豬免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，該二聯(lián)疫苗可以有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)這兩種病原體的抗體，為二聯(lián)疫苗研發(fā)提供參考依據(jù)。

為了在仔豬上評(píng)價(jià)PCV2-VLP 和SVV 全病毒滅活二聯(lián)疫苗免疫效果，本研究通過(guò)篩選獲得PCV2 抗體、SVV 抗體、PCV2 抗原和SVV 抗原均為陰性的健康仔豬，在排除可能影響疫苗免疫效果的外源病原干擾的情況下進(jìn)行二聯(lián)疫苗免疫效果評(píng)價(jià)。

本研究中PCV2-VLP 的免疫原性通過(guò)檢測(cè)PCV2特異性抗體水平進(jìn)行評(píng)價(jià)，SVV 滅活苗的免疫原性通過(guò)檢測(cè)SVV 中和抗體效價(jià)進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示免疫14 d 后即可檢測(cè)到PCV2 特異性抗體和SVV 中和抗體，并且隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng)，PCV2 特異性抗體及SVV 中和抗體水平持續(xù)上升，而且二聯(lián)疫苗免疫組中無(wú)論P(yáng)CV2 特異性抗體還是SVV 中和抗體水平均與各自單苗組相當(dāng)。Koinig 等通過(guò)對(duì)PCV2-VLP 免疫動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，其免疫動(dòng)物后不僅能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，還能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ 和TNF-α 的T細(xì)胞反應(yīng)，免疫效果優(yōu)于滅活疫苗[11]。本研究利用PCV2-VLP 制備的二聯(lián)疫苗具有良好的免疫原性，并且刺激仔豬產(chǎn)生PCV2 特異性抗體及SVV 中和抗體能力與單獨(dú)使用PCV2-VLP 疫苗和SVV 全病毒滅活疫苗免疫效果相當(dāng)。

本研究采用攻毒方法評(píng)價(jià)PCV2-VLP 和SVV 全病毒滅活二聯(lián)疫苗的免疫效力，該二聯(lián)疫苗與PCV2-VLP 疫苗和SVV 全病毒滅活疫苗免疫保護(hù)效力相當(dāng)，對(duì)PCV2 的感染達(dá)到80%的保護(hù)率，對(duì)SVV 的感染達(dá)到100%的保護(hù)率，這與相關(guān)研究一致[12]。

綜上所述，本研究首次制備的PCV2-VLP 和SVV全病毒滅活二聯(lián)疫苗效果顯著，具有良好的免疫保護(hù)作用，為二聯(lián)疫苗的設(shè)計(jì)和研發(fā)提供了新思路。