非洲豬瘟病毒A137R蛋白單克隆抗體的制備與表位鑒定

向志達，李長堯，張濤清，張元峰，黃 麗，楊玉瑩*，翁長江*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/基礎(chǔ)免疫創(chuàng)新團隊，黑龍江 哈爾濱 150069；2.長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由ASF 病毒（ASFV）感染家豬或野豬引起的一種急性、熱性和高度傳染性疾病[1]。根據(jù)ASF 的不同臨床表現(xiàn)和病理變化，可將其分為4 個階段：極急性期表現(xiàn)為高熱（體溫41 ℃～42 ℃）、食欲不振、呼吸急促和皮膚充血；急性期最常見，感染豬臨床表現(xiàn)為高熱、皮膚紅腫、淋巴結(jié)、腎臟和胃腸道黏膜明顯出血[2]；亞急性期的臨床癥狀不太明顯；慢性ASF 是由低毒力病毒感染引起的，以皮膚壞死性疾病和關(guān)節(jié)炎為特征。2018 年8 月，ASF 首次在中國遼寧省沈陽市出現(xiàn)，隨后迅速蔓延至全國各省[3]。

ASFV 是一類有囊膜的雙鏈DNA 病毒，為非洲豬瘟病毒科家族的唯一成員。根據(jù)其主要衣殼蛋白p72基因序列的差異性，可將病毒分為24 個基因型[4]；基于病毒血凝素CD2 樣蛋白質(zhì)（CD2v）和C 型凝集素，可將其分為8 種血清型[5]?；颌裥汀ⅱ蛐脱芯孔顬閺V泛，目前在中國出現(xiàn)的Pig/HLJ/18 株屬于強毒力基因Ⅱ型ASFV[6]。ASFV 基因組長度為170 kb～190 kb，編碼151～167 個開放閱讀框（ORFs）。ASFV粒子呈二十面體形態(tài)，由內(nèi)向外依次由核心、核殼、內(nèi)囊膜、衣殼和外囊膜組成[7]。研究表明，ASFV 的復(fù)制主要發(fā)生在細胞質(zhì)中，而病毒早期DNA 的合成是在細胞核中[8-9]。

本研究室前期利用ASF 康復(fù)豬陽性血清從ASFV編碼的170 種蛋白中篩選能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗體的免疫原性蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A137R 具有較強的免疫原性[10]。A137R 在病毒復(fù)制的晚期表達且定位在病毒的復(fù)制工廠，但目前還不清楚該蛋白是如何發(fā)揮功能的?；诖?，本研究利用原核表達系統(tǒng)表達并純化了重組A137R（rA137R），將其免疫BALB/c 小鼠，通過間接ELISA 方法篩選ASFV A137R 單克隆抗體（MAb），并對篩選的MAb 進行了一系列鑒定及初步的應(yīng)用研究，并鑒定了MAb 的表位。為ASFV A137R的功能研究及開發(fā)ASFV新型診斷試劑奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒、載體及實驗動物HEK293T 細胞和骨髓瘤細胞（SP2/0）、表達載體pET-21a（+）和pGEX-6P-1 均由本實驗室保存；豬肺泡巨噬細胞（PAMs）分離自30 日齡的SPF 豬；ASFV Pig/HLJ/18 株由哈爾濱獸醫(yī)研究所分離保存；大腸桿菌（E. coli）DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細胞均購 自TaKaRa 公司；pCAGGS-Flag-A137R 真核表達質(zhì)粒由金斯瑞生物科技有限公司合成；6 周齡～8 周齡雌性BALB/c 小鼠購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 主要試劑DMEM、RPMI 培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco 公司；HisTrap HP 親和層析柱購自GE 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司；IRDye 800CW 山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG 購自LI-COR Bioscience 公司；HRP 標記的山羊抗小鼠IgG（H+L）購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 594 標記的山羊抗小鼠IgG（H+L）、鼠源Flag MAb、4',6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）、低黃嘌呤-氨基嘌呤-胸腺嘧啶（HAT）、低黃嘌呤-胸苷（HT）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、Flag-Agarose 均購自Sigma 公司；鼠源ASFV p72 多克隆抗體、鼠源His MAb、鼠源GST MAb 由本實驗室制備；鼠源GAPDH MAb、兔源β-actin MAb 和鼠源Flag MAb 均購自Proteintech 公司；1%NP-40 細胞裂解液（50 mmol/L Tris-HCl，pH7.4；1 mmol/L EDTA；150 mmol/L NaCl；5 mmol/L MgCl；10%甘油；1%NP-40）由本實驗室配制；SBA Clonotyping System-HRP抗體亞類鑒定試劑盒購自SouthernBiotech 公司；用于抗原表位鑒定的一系列多肽由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 pET-21a-A137R 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建、蛋白的表達、純化與鑒定根據(jù)GenBank 登錄的ASFV Pig/HLJ/18 株A137R 基因序列（QBH90530.1）設(shè)計特異性引物（表1），并以提取的ASFV Pig/HLJ/18 株基因組DNA 為模板，利用A137R-F/A137R-R PCR 擴增A137R 全長基因并克隆至經(jīng)BamH I/XhoI 雙酶切后的pET-21a（+）載體中，構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET-21a-A137R，并經(jīng)測序鑒定。選擇測序正確的重組質(zhì)粒pET-21a-A137R 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，37 ℃、220 r/min 培養(yǎng)至OD600nm值為0.6～0.8，加入IPTG 至終濃度為1 mmol/L，在16 ℃、220 r/min 條件下誘導(dǎo)12 h～16 h；將誘導(dǎo)后的菌液離心，收集菌體沉淀，超聲破碎菌體后，以4 ℃，12 000 r/min 離心20 min，分別收集上清和沉淀，利用SDS-PAGE 檢測rA137R 的表達。大量誘導(dǎo)表達目的蛋白后，利用HisTrap HP 親和層析柱和凝膠過濾層析柱純化rA137R，利用BCA 蛋白定量試劑盒測定該蛋白的濃度，并經(jīng)SDS-PAGE 檢測后，以鼠源His MAb（1∶2 000）為一抗，分別以IRDye 800CW 山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG（1∶10 000）為二抗，經(jīng)western blot 鑒定重組蛋白的純化效果。

表1 ASFV A137R基因及其基因截短片段的PCR擴增引物Table 1 PCR amplification primer of ASFV A137R gene and its truncated fragment

1.4 MAb 的制備及純化將純化的rA137R 與等體積的弗氏完全佐劑乳化后經(jīng)腹部皮下注射免疫小鼠，每隔兩周采用相同的方式免疫，第二次和第三次免疫，蛋白均用弗氏不完全佐劑乳化，第三次免疫3 d～5 d 后采血分離血清，以純化的rpA137 作為包被抗原，以小鼠血清作為一抗（1∶1 000），以HRP 標記的山羊抗小鼠IgG（H+L）（1∶5 000）作為二抗，采用間接ELISA 方法檢測抗體效價。選取抗體效價較高的小鼠迫殺，將免疫的脾細胞與SP2/0 細胞融合并經(jīng)間接ELISA 方法[11]篩選穩(wěn)定分泌A137R MAb 的雜交瘤細胞株，并及時擴大培養(yǎng)并凍存。將弗氏不完全佐劑（200 μL/只）注射到8 周齡BALB/c 小鼠腹腔中致敏，3 d～7 d 后，將雜交瘤細胞懸液按105個/只注射于小鼠腹腔內(nèi)，5 d～7 d后收集腹水，利用Protein G親和層析介質(zhì)純化獲得小鼠腹水并經(jīng)SDS-PAGE 檢測。

1.5 MAb 的效價及亞類測定用碳酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH9.6）將純化的rpA137稀釋至2.5 μg/mL，用PBST 將制備的兩株MAb 10 倍倍比稀釋后作為一抗，以HRP 標記的羊抗鼠IgG（1∶5 000）為二抗，利用間接ELISA 方法[12]檢測MAb 效價。利用SBA Clonotyping System-HRP 抗體亞類試劑盒鑒定獲得的兩株MAb 的亞類。

1.6 MAb 反應(yīng)原性的western blot 鑒定將真核表達質(zhì)粒pCAGGS-Flag-A137R 以不同劑量（0、0.5 μg、1 μg、2 μg）轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，置37 ℃5%CO2培養(yǎng)24 h 后 收 集 細 胞；將ASFV HLJ/18 株 以MOI 0.1 感染PAMs，分別在感染后不同時間（0、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h）后收集細胞。用含1% NP-40 裂解液裂解細胞，離心后取上清，加入4×loading buffer 煮沸10 min，SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜），分別以純化的MAb（根據(jù)MAb 效價的檢測結(jié)果選擇一株效價相對較高的MAb 用于該試驗及后續(xù)試驗）（1∶1 000）和鼠源ASFV p72 多克隆抗體（1∶1 000）為一抗，以IRDye 800CW 標記的山羊抗小鼠IgG（1∶10 000）為二抗，經(jīng)western blot 檢測MAb 與293T 細胞中過表達的Flag-A137R 和PAMs 中天然表達的A137R 的反應(yīng)原性。

1.7 MAb反應(yīng)原性的間接免疫熒光試驗（IFA）將真核表達質(zhì)粒pCAGGS-Flag-A137R以2 μg轉(zhuǎn)染293T細胞，同時設(shè)pCAGGS-Flag空載體轉(zhuǎn)染的293T細胞為陰性對照。36 h后用4%多聚甲醛固定細胞30 min，再經(jīng)通透、封閉后，以純化的MAb（1∶1 000）為一抗，以Alexa Fluor 488 標記的山羊抗小鼠IgG（H+L）（1∶2 000）為二抗，DAPI 染核30 min 后，經(jīng)IFA 進一步檢測MAb 與293T細胞中過表達的Flag-A137R的反應(yīng)原性。

1.8 MAb 用于鑒定A137R 細胞定位的激光共聚焦試驗將ASFV Pig/HLJ/18株以MOI 0.1 感染PAMs，在感染后不同時間（0、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h）收集細胞，以純化的MAb（1∶100）、兔β-actin MAb（1∶100）作為一抗，Alexa Fluor 488 標記的山羊抗小鼠IgG（H+L）（1∶2 000）和Alexa Fluor 594 標記的山羊抗兔IgG（H+L）（1∶2 000）分別作為二抗，DAPI 染核30 min 后，置激光共聚焦顯微鏡下觀察ASFV 感染PAMs 后A137R 的定位。

1.9 MAb 用于檢測293T 細胞中過表達A137R 的免疫共沉淀試驗（Co-IP）將真核表達質(zhì)粒pCAGGSFlag-A137R轉(zhuǎn)染293T細胞，同時設(shè)立pCAGGS-Flag空載體轉(zhuǎn)染的293T細胞作為陰性對照。24 h后收集細胞樣品，用100 μL 1%NP40裂解細胞離心后取上清并分為兩份，一份在25 μL上清中加4×loading buffer，煮沸10 min，常溫放置作為Input樣品；在剩余樣品中加入30 μL Flag-Agarose，4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育6 h，用1%NP-40洗滌Flag-Agarose 后，加入2×loading buffer，煮沸10 min作為IP樣品。兩份處理后的樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后分別以鼠源Flag MAb（1∶2 000）、純化的MAb（1∶1 000）和鼠源GAPDH MAb（1∶5 000）為一抗，以IRDye 800CW標記的山羊抗小鼠IgG（1∶10 000）為二抗，經(jīng)western blot 檢測外源過表達的Flag-A137R 與Flag-Agarose 結(jié)合后與MAb 的反應(yīng)性。

1.10 MAb 抗原表位的鑒定分別以提取的ASFV Pig/HLJ/18 株基因組DNA 為模板，利用表1 中的各截短片段的擴增引物經(jīng)PCR擴增A137R全長和各該基因的截短片段并克隆至pGEX-6P-1載體中，構(gòu)建的所有的質(zhì)粒均經(jīng)測序鑒定。將上述重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后分別以純化的MAb（1∶1 000）和鼠源GST MAb（1∶2 000）為一抗，以IRDye 800CW標記的山羊抗小鼠IgG（1∶10 000）為二抗，利用western blot 初步鑒定兩株MAb 的表位；為進一步確定抗原表位的精確區(qū)域，根據(jù)western blot結(jié)果，以前后各1 個氨基酸為步移合成一系列多肽作為包被抗原，并分別以表達的rpA137R 及表達的GST作為陽性對照和陰性對照，以獲得的MAb（1∶2 000）為一抗，以HRP 標記的山羊抗小鼠IgG（H+L）（1∶5 000）為二抗，經(jīng)間接ELISA 精確鑒定MAb 3D1 識別的抗原表位；同樣根據(jù)western blot結(jié)果，將MAb識別的片段再逐步截短表達后再經(jīng)western blot 精確鑒定MAb 2C3識別的抗原表位。為了進一步驗證篩選出的抗原表位的正確性，將兩株MAb識別的抗原表位的基因分別克隆至pGEX-6P-1載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，陽性和陰性對照與上述同，將上述質(zhì)粒原核表達后以獲得的MAb（1∶2 000）為一抗，以IRDye 800CW 標記的山羊抗小鼠IgG（1∶10 000）為二抗，經(jīng)western blot 檢測MAb 與抗原表位的反應(yīng)性。

2 結(jié) 果

2.1 rA137R的表達、純化及其反應(yīng)性鑒定結(jié)果將從ASFV Pig/HLJ/18株擴增得到的A137R基因克隆至原核表達載體pET-21a中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-21a-A137R。經(jīng)測序鑒定正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），IPTG誘導(dǎo)后經(jīng)SDS-PAGE檢測。結(jié)果顯示，出現(xiàn)一條約15 ku的目的條帶，與預(yù)期大小一致（圖1）。部分重組蛋白以包涵體的形式表達，但大部分在細菌裂解液上清中表達（圖1）。大量誘導(dǎo)表達重組蛋白并經(jīng)HisTrap HP親和層析柱和凝膠過濾層析柱純化，SDS-PAGE 結(jié)果顯示，在約15 ku處出現(xiàn)單一目的條帶，且該蛋白與His MAb 反應(yīng)后在約15 ku 處出現(xiàn)一條特異性條帶（圖1）。BCA蛋白定量試劑盒測得該蛋白濃度為5.0 mg/mL。表明獲得了純度較高的rA137R，可以用于后續(xù)免疫小鼠。

圖1 rpA137R表達、純化的SDS-PAGE及其反應(yīng)性的western blot鑒定Fig.1 SDS-PAGE of rpA137R expression,purification and its reactivity identification by western blot

2.2 MAb 的制備及純化結(jié)果免疫后的小鼠脾細胞與SP/20 細胞融合后，經(jīng)間接ELISA 檢測，最終篩選到了兩株能夠穩(wěn)定分泌A137R MAb 的雜交瘤細胞株，分別命名3D1 和2C3。獲得的小鼠腹水通過Protein G 親和層析介質(zhì)純化，SDS-PAGE 結(jié)果顯示，在55 ku（重鏈）和25 ku（輕鏈）處各出現(xiàn)一條蛋白條帶（圖2），表明制備的MAb 純化效果良好。

圖2 MAb純化的SDS-PAGE鑒定Fig.2 Identification of purified MAb by SDS-PAGE

2.3 MAb 效價及亞類的測定結(jié)果經(jīng)間接ELISA 方法檢測，MAb 3D1 和2C3 的效價分別為1∶218和1∶217，所以選擇3D1 用于后續(xù)鑒定試驗。SBA Clonotyping System-HRP 抗體亞類試劑盒鑒定結(jié)果顯示，MAb 3D1 和2C3 重鏈均為IgG1，輕鏈均為Kappa 鏈。

2.4 MAb 3D1 與不同來源A137R 反應(yīng)性的western blot 鑒定結(jié)果將真核表達質(zhì)粒pCAGGS-Flag-A137R 以不同劑量轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞24 h 后收集細胞；將ASFV Pig/HLJ/18 株以MOI 0.1 感染PAMs，在感染后不同時間收集細胞。將收集的2 種細胞常規(guī)處理后采用western blot 檢測MAb 3D1的反應(yīng)性。結(jié)果顯示，HEK293T 細胞出現(xiàn)了約15 ku 的特異性條帶，且隨著轉(zhuǎn)染質(zhì)粒濃度的增加，蛋白表達量也隨之增加。未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的293T 細胞中無該條帶（圖3A）；以純化的MAb 3D1 為一抗時，在感染ASFV Pig/HLJ/18株后8 h 的PAMs 中出現(xiàn)了約15 ku 的特異性條帶，且隨著感染時間的延長，蛋白表達量也隨之增加。以鼠ASFV p72 多克隆抗體為一抗時，在感染該株病毒后8 h 的PAMs 中出現(xiàn)了約73 ku 的特異性條帶。p72蛋白為ASFV 編碼的衣殼蛋白，檢測該蛋白是為了證明病毒在細胞中獲得復(fù)制且隨著感染時間的增加其復(fù)制水平增加（圖3B）。上述結(jié)果表明，制備的MAb 既能夠與293T 細胞中過表達的A137R 也能夠與ASFV感染的PAMs中天然表達的A137R反應(yīng)，反應(yīng)性較強，且ASFV感染PAMs約8 h后表達A137R。

圖3 MAb 3D1分別與293T細胞中過表達的pA137R（A）及ASFV感染的PAMs中天然表達的pA137R（B）反應(yīng)性的western blot鑒定結(jié)果Fig.3 Western blot identification of the reactivity of MAb 3D1 with pA137R overexpressed in 293T cells(A)and pA137R naturally expressed in PAMs after ASFV infection(B)

2.5 MAb 與293T 細胞中過表達的A137R 反應(yīng)性的IFA鑒定結(jié)果真核表達質(zhì)粒pCAGGS-Flag-A137R轉(zhuǎn)染HEK293T細胞36 h后采用IFA檢測MAb 3D1與過表達的A137R 的反應(yīng)性。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pCAGGSFlag-A137R 的293T 細胞出現(xiàn)綠色熒光，而轉(zhuǎn)染空載體的293T 細胞無任何熒光（圖4）。進一步表明制備的MAb 3D1能夠與293T細胞中過表達的A137R反應(yīng)。

圖4 MAb 3D1與293T細胞中過表達pA137R反應(yīng)性的IFA鑒定結(jié)果Fig.4 IFA identification of MAb 3D1 reactivity with overexpressed pA137R in 293T cells

2.6 MAb 3D1 用于鑒定A137R 細胞定位的激光共聚焦試驗結(jié)果將ASFV Pig/HLJ/18 株以MOI 0.1 感染PAMs，感染后不同時間點固定細胞，經(jīng)相應(yīng)一抗二抗作用后通過激光共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果顯示，ASFV 感染PAMs 6 h 后出現(xiàn)綠色熒光，且熒光主要在細胞質(zhì)中，隨著感染時間的延長，綠色熒光逐漸增多增強（圖5）。進一步表明純化的MAb 能夠與病毒感染PAMs 后天然表達的A137R 反應(yīng)，且A137R定位于細胞質(zhì)中。

圖5 pA137R細胞定位的激光共聚焦試驗結(jié)果Fig.5 Results of confocal laser localization of pA137R cells

2.7 MAb 3D1用于檢測293T細胞中過表達A137R的Co-IP 試驗結(jié)果將pCAGGS-Flag-A137R 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T 細胞，24 h 后收集細胞樣品，裂解取上清并分為兩份，一份上清樣品煮沸后常溫放置；另一份上清樣品加入Flag-Agarose 6 h后洗滌、煮沸。兩份上清樣品通過SDS-PAGE 并轉(zhuǎn)膜、封閉，加入相應(yīng)的一抗二抗后，經(jīng)western blot檢測。結(jié)果顯示，在Input樣品中，轉(zhuǎn)染pCAGGS-Flag-A137R 的293T 細胞與MAb 反應(yīng)后出現(xiàn)了特異性條帶，而轉(zhuǎn)染pCAGGS-Flag 空載體的293T 細胞中無該特異性條帶；在IP 樣品中，轉(zhuǎn)染pCAGGS-Flag-A137R 的293T 細胞中，A137R 與Flag-Agarose 的結(jié)合物可以與純化的MAb 反應(yīng)出現(xiàn)特異性條帶，而轉(zhuǎn)染pCAGGS-Flag的293T細胞中無該特異性條帶（圖6）。A137R 與Flag-Agarose 結(jié)合后，MAb 可以與結(jié)合在Beads 上的A137R 反應(yīng)。表明純化的MAb 3D1 可以用于Co-IP 試驗。

圖6 MAb 3D1 用于Co-IP試驗檢測293T細胞中過表達的pA137RFig.6 MAb 3D1 was used to detect overexpressed pA137R in 293T cells by Co-IP assay

2.8 MAb 3D1 和2C3 表位的鑒定結(jié)果為了確定MAb 3D1 和2C3 的抗原表位，將A137R 截短為6 段進行原核表達，通過MAb 3D1 和2C3 對截短表達的多肽進行western blot 鑒定。結(jié)果顯示，MAb 3D1 和2C3識別的位點分別為aa1～aa30（D1）和aa61～aa90（D11）（圖7A）。進一步將D1 和D11 截短為4 段，經(jīng)融合表達后再經(jīng)western blot 鑒定，結(jié)果顯示，MAb 3D1 和2C3 識別的位點分別位于A137R 的aa11～aa30（D10）和aa61～aa80（D13）（圖7B）；為了更進一步確定MAb 3D1 識別的最小表位，按照最小表位通常為10 個氨基酸的原則以1 個氨基酸為步移合成一系列多肽作為包被抗原，利用間接ELISA 檢測，結(jié)果顯示，MAb 3D1 識別的表位為18NFHRCAWEE26（圖7C）；為了明確MAb 2C3 識別的最小表位，將D13（aa61～aa80）逐步截短，并經(jīng)融合表達后經(jīng)western blot 鑒定，結(jié)果顯示，MAb 2C3 識別的表位為64AWHEVPE CREFI75（圖7D）。為驗證MAb 3D1 和2C3 識別表位的正確性，將編碼P1（18NFHRCAWEE26）和P2（64AWHE VPECREFI75）的基因分別克隆表達后經(jīng)western blot 驗證，結(jié)果顯示，18NFHRCAWEE26（P1）和64AWHEVPE CREFI75（P2）確實分別為MAb 3D1 和2C3 識別的表位（圖7E）。

3 討 論

目前，ASF 呈全球蔓延之勢，由于無ASF 商品化疫苗，對該疫情只能采用被動防控（撲殺）的措施，給世界豬養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，因此，研發(fā)用于預(yù)防ASF的疫苗迫在眉睫。各種疫苗中，滅活疫苗多數(shù)保護作用較差，減毒活疫苗無法提供良好的異源保護，并可能出現(xiàn)副作用和毒力返強的問題，而亞單位疫苗作為一種標記疫苗，則具有研究前景。ASFV CD2v、p30 和p54 單獨或聯(lián)合使用以及其他亞單位疫苗均具有部分保護效果[13-14]。利用表達EP402R、p54 和p72 等基因的重組腺病毒載體疫苗和表達B646L、EP153R 和EP402R 等基因的重組牛痘病毒疫苗的“雞尾酒”免疫后，均能夠誘導(dǎo)豬產(chǎn)生較強的體液和細胞免疫應(yīng)答[15-16]。制備亞單位疫苗的關(guān)鍵是尋找有良好免疫原性的蛋白靶標。本研究室發(fā)現(xiàn)A137R 能與ASFV 感染后的康復(fù)豬血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表明A137R 具有良好的抗原性。因此，本研究將A137R基因克隆到原核表達載體pET-21a 中，表達并成功純化出高質(zhì)量的rA137R，并利用rA137R 制備了鼠源MAb。

制備ASFV 蛋白的MAb 是研究該病毒基因功能的基礎(chǔ)，也為ASFV 檢測和疫苗研究提供了材料，因此，針對ASFV 蛋白MAb 的制備成為了熱點。趙少若等制備的ASFV DP96R 蛋白MAb，能夠特異性識別DP96R 蛋白，篩選的14 株MAb 效價均不低于1∶2 560 000[17]。趙亞茹等利用重組K205R 蛋白免疫BALB/c小鼠獲得了3株MAb且均具有很好的反應(yīng)性和特異性，且其效價均在1∶51 200 以上[18]。本研究以純化的rA137R 免疫小鼠，通過間接ELISA 篩選，獲得了A137R 的兩株MAb 3D1 和2C3。經(jīng)間接ELISA 方法檢測，MAb 3D1和2C3的效價分別為1∶218和1∶217，選擇效價高的3D1 用于后續(xù)鑒定試驗。Western blot、IFA 和激光共聚焦試驗均證明MAb 3D1 能特異性地識別在HEK293T 細胞中表達的A137R 以及ASFV 感染PAMs 后天然表達的A137R。且激光共聚焦試驗結(jié)果證明，ASFV 感染PAMs 6 h 后表達A137R 并定位于PAMs 的細胞質(zhì)。Co-IP 試驗結(jié)果表明，制備的MAb 3D1 可以用于Co-IP 試驗來鑒定p293T 細胞中過表達的A137R。

根據(jù)文獻報道，通常采用western blot 鑒定MAb所識別的表位[19]。本研究在將MAb 的抗原表位定位到19 個氨基酸后，按照最小表位通常為10 個氨基酸的原則并以1 個氨基酸為步移合成一系列多肽，再通過ELISA 方法鑒定MAb 3D1 的表位，優(yōu)點在于合成的多肽更加經(jīng)濟方便，且間接ELISA 方法敏感性更高。本試驗結(jié)果顯示，MAb 3D1 能與包被的多肽F6（17QNFHRCAWEE26）和F7（18NFHRCAWEET27）分 別反應(yīng)，表明18NFHRCAWEE26作為多肽F6 和F7 的氨基酸重疊部分能夠被MAb 3D1 識別，而MAb 2C3 識別的抗原表位為64AWHEVPECREFI75。將表達這兩個表位的重組質(zhì)粒分別與ASFV 康復(fù)豬血清反應(yīng)，結(jié)果均未出現(xiàn)特異性反應(yīng)，推測這兩個抗原表位可能不是A137R 的免疫原性區(qū)域，也可能是由于動物種屬之間的差異引起的，但這兩個表位的鑒定為ASFV 的檢測及疫苗研究提供了參考依據(jù)。