胞內勞森氏菌間接ELISA抗體檢測方法的建立及應用

王丹丹，周俊明，倪艷秀，祝昊丹，朱雪蛟，周金柱，李 彬

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所，江蘇 南京 210014）

豬增生性腸炎（Porcine proliferative enteritis，PPE）又稱為豬回腸炎（Porcine ileitis，PI），是由胞內勞森菌（Lawsonia intracellularis，LI）引起的一種細菌接觸性傳染病[1]。LI 主要感染后備豬和生長期育肥豬，以回腸和結腸的黏膜出現(xiàn)腺瘤樣病變?yōu)樘卣鳎磁R床癥狀分為急性型、慢性型和亞臨床型，其中慢性型最常見，主要表現(xiàn)為間歇性下痢、食欲下降和生長緩慢，飼料利用率下降，導致養(yǎng)殖成本增加[2]。該病自1931 年首次報道以來，加拿大、巴西、法國、希臘、泰國、日本、朝鮮、印度、中國等20 多個國家陸續(xù)發(fā)表LI 感染的相關報道，至今PPE 呈世界范圍內流行[3-7]。我國目前對LI 的流行病學調查尚不全面，LI 的流行地區(qū)尚不明確，但上海、福建、廣東、廣西、湖南、湖北等地豬場的檢測報告顯示，該病陽性檢出率最高可達100%[8]。給養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的經(jīng)濟損失，開展該病診斷方法的研究，對于該病的診斷具有重要意義。

目前，國內外鑒定LI 的實驗室方法主要為組織病理學診斷、血清免疫學診斷和分子生物學診斷等。血清免疫學診斷方法主要包括間接熒光抗體試驗（Indirect immunofluorescent antibody test，IFAT）、免疫過氧化物酶單層抗體試驗（Immunoperoxidase monolayer assay，IPMA）和酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）等[9-10]。IFAT 和IPMA 均適用于LI 的活體檢測，但這兩種方法對操作者的要求較高，結果判定的主觀性較強，易產(chǎn)生人為誤差。此外，IFAT 檢測易出現(xiàn)假陰性，IPMA 檢測易出現(xiàn)假陽性。

ELISA 方法可以對大量樣品進行檢測，并且因快速、操作簡便等優(yōu)勢，廣泛的用于多種疫病的診斷和檢測。研究表明，LI 外膜蛋白LI1022 具有抗原性，可維持LI 細胞外膜的完整性，有助于LI 對豬回腸細胞的吸附，且參與細菌的黏附和侵襲[11]。本研究以LI 外膜蛋白LI1022 為包被抗原，建立檢測LI 抗體的間接ELISA 方法，為我國PI 的防控、保障養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展以及提高養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟效益提供有力的技術支持。

1 材料與方法

1.1 血清樣品319 份臨床血清樣品采集自2019 年1 月～2021 年2 月江蘇地區(qū)的6 個豬場；指定豬場采集免疫PI 活疫苗（勃林格殷格翰）后二周的血清（10 頭份），經(jīng)PI 抗體檢測試劑盒（瑞士Svanova 公司，批號A99787）鑒定為陽性血清，作為實驗陽性對照血清；未免疫的健康豬血清（80 頭份），經(jīng)PI 抗體檢測試劑盒鑒定為陰性血清，作為實驗陰性血清，以上血清樣品均由本研究所動物腹瀉病防控創(chuàng)新團隊保存。兔抗LI 血清購自上海佑隆生物科技有限公司。

1.2 主要試劑重組表達質粒pET-32a（+）（Novagen）由本實驗室保存；BL21（DE3）感受態(tài)細胞購自TransGen Biotech 公司；豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）陽性血清、豬偽狂犬病病毒（PRV）陽性血清、口蹄疫病毒（FMDV）陽性血清、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）陽性血清等標準陽性血清均購自武漢科前生物股份有限公司，由本實驗室保存；限制性內切酶BamH I 和Hind III、DNA Marker、Protein Marker均購自TaKaRa 公司；HRP 標記的羊抗豬IgG（IgGHRP）和羊抗兔IgG-HRP 購自武漢博士德生物工程有限公司；TMB 底物顯色液購自湖州英創(chuàng)生物科技有限公司；96 孔酶標板購自Corning 公司；增強型ECL化學發(fā)光檢測試劑購自Vazyme公司；His Trap購自Cytiva公司。

1.3LI1022基因的合成及重組表達質粒的構建根據(jù)GenBank 登錄的LI 外膜蛋白LI1022全基因序列（AM180252.1），由南京鐘鼎生物技術有限公司合成該基因并克隆于pET-32a 載體，構建重組表達質粒pET32a-LI1022，測序鑒定正確后轉化到BL21（DE3）宿主菌。

1.4 重組蛋白的表達、純化及鑒定將重組菌pET32-LI1022/BL21（DE3）在含有50 μg/mL 氨芐青霉素抗性LB 中培養(yǎng)至OD600nm達到0.6，加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG，37 ℃誘導表達6 h。離心收集菌體，低溫超聲破碎，分離并收集上清和沉淀，經(jīng)SDSPAGE檢測，確定重組LI1022蛋白（r LI1022）的表達形式。Ni 柱純化該蛋白，以兔抗LI 多抗血清為一抗（1∶100），羊抗兔IgG-HRP（1∶10 000）為二抗，對純化的rLI1022 進行western blot 鑒定。

1.5 間接ELISA 方法的建立及反應條件的優(yōu)化采用方陣滴定法將純化后濃度為0.3 mg/mL 的rLI1022作為包被抗原，用包被液依次按1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800稀釋，100 μL/孔加入酶標板，4 ℃包被過夜。LI 陽性血清和陰性血清分別用樣品稀釋液依次按1∶25、1∶50、1∶100、1∶200 稀釋，組成方陣。酶標儀測定LI 陽性和陰性血清的OD450nm值，以P/N 值（陽性血清OD450nm值/陰性血清OD450nm值）最大的反應條件為最佳工作條件。同時對包被條件（4 ℃過夜、37 ℃作用1 h 后4 ℃過夜、37 ℃作用2 h）、封閉液（5%脫脂乳、2%明膠）、37 ℃封閉時間（1 h、2 h、3 h），血清37 ℃作用時間（30 min、60 min、90 min），羊抗豬IgG-HRP 稀釋倍數(shù)（1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000）及其37 ℃作用時間（30 min、60 min、90 min），TMB 室溫顯色時間（10 min、15 min、20 min）等進行優(yōu)化，加入終止液（50 μL/孔）終止反應。

1.6 陰陽性臨界值的確定利用優(yōu)化后反應條件，對80 份陰性血清樣品進行檢測，按照以下公式計算S/P 值：S/P 值=（待檢血清OD450nm值-陰性對照血清OD450nm值）/（陽性對照血清OD450nm值-陰性對照血清OD450nm值），計算各待檢血清S/P 值的平均值及標準方差SD，當待檢血清的S/P 值＜+2s時，判定待檢血清為陰性；待檢血清的S/P 值＞+3s時，判定待檢血清為陽性；+2s≤待檢血清的S/P 值≤+3s時，判定待檢血清為疑似。

1.7 特異性試驗采用已建立的間接ELISA 方法分別對PRRSV、PRV、FMDV、PEDV 陽性豬血清、LI陰性血清和LI 陽性血清進行檢測，每份血清設置3個重復。根據(jù)OD450nm值判定陰陽性，分析該方法的特異性。

1.8 敏感性試驗將LI 陽性血清分別按1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200 稀釋，每個稀釋度設置3 個重復，采用本研究建立的間接ELISA 檢測，分析該ELISA 方法的敏感性。

1.9 重復性試驗批內重復試驗：選取同一批次包被的3 塊酶標板，分別在不同時間對隨機選取的5份不同抗體水平的LI 血清進行檢測，每份血清3 個重復。批間重復試驗：利用已建立的間接ELISA 方法，選取3 個不同批次包被的酶標板，同一時間對隨機選取的5 份不同抗體水平的LI 血清進行檢測，每份血清3 個重復。

根據(jù)各反應孔的OD450nm值，計算各血清樣品的S/P 值，以及每份血清樣品S/P 值的平均值、標準差s和變異系數(shù)CV，用于分析重復性試驗的效果。

1.10 符合率試驗利用已建立的間接ELISA 方法與瑞士Svanova 公司PI 抗體檢測試劑盒同時檢測54份臨床豬血清樣品（2019 年1 月～2021 年2 月于江蘇地區(qū)采集的臨床血清），分析檢測結果，計算二者的符合率。

1.11 臨床樣品檢測利用本研究建立的間接ELISA方法對江蘇部分地區(qū)（連云港61 份、徐州64 份、宿遷62 份、淮安88 份、泰州44 份）的319 份臨床豬血清樣品進行檢測，對檢測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，初步了解LI 在江蘇地區(qū)的感染和流行情況。

2 結 果

2.1 rLI1022 的表達、純化及western blot 分析重組菌誘導表達后經(jīng)超聲波破碎后的上清與包涵體，經(jīng)SDS-PAGE 檢測，結果顯示rLI1022 主要存在于上清中，融合蛋白大小約32 ku，與預期相符（圖1A）；通過Ni 柱純化上清中的蛋白，獲得純化的目的蛋白，western blot 鑒定結果顯示，純化的rLI1022 可與LI 兔多抗發(fā)生特異性結合（圖1B）。表明純化后的rLI1022具有較好的反應原性。

圖1 rLI1022表達的SDS-PAGE檢測（A）及純化rLI1022的western blot鑒定（B）Fig.1 Analysis of the expressed product of rLI1022 by SDS-PAGE(A)and western blot(B)

2.2 間接ELISA 方法的優(yōu)化結果通過方陣滴定法，選擇陽性血清OD450nm值≥1，陰性血清OD450nm值＜0.2，且P/N 值最大者為最佳條件，優(yōu)化結果見表1。

表1 間接ELISA檢測方法的反應條件優(yōu)化結果Table 1 The optimized reaction conditions of the indirect ELISA

2.3 陰陽性判定標準的確定利用優(yōu)化后的間接ELISA 方法檢測經(jīng)瑞士Svanova 公司PI 抗體檢測試劑盒檢測為陰性的80 份血清。經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，所有血清的S/P 值的平均數(shù)=0.114，S/P 值的標準方差s=0.104，+3s=0.426，+2s=0.322。因 此，當待檢血清S/P 值＜0.289 時，判定待檢血清中LI 抗體為陰性；待檢血清S/P 值＞0.426 時，判定待檢血清中LI 抗體為陽性；0.322≤待檢血清S/P 值≤0.426 時，判定待檢血清中LI 抗體為疑似陽性。所有陰性血清樣品OD450nm值正態(tài)分布結果如圖2 所示。

圖2 陰性樣品結果的正態(tài)分布圖Fig.2 Negative samples normal distribution diagram

2.4 特異性試驗結果利用建立的間接ELISA 方法檢測PRRSV、PRV、FMDV、PEDV 陽性豬血清以及LI 陽性和陰性血清，結果顯示，除LI 陽性血清為陽性外，其他血清檢測結果均為陰性（表2）。表明本研究建立的間接ELISA 方法具有較強的特異性。

表2 特異性試驗結果Table 2 Results of the specificity test of the indirect ELISA

2.5 敏感性試驗結果利用本研究建立的間接ELISA 方法，對2 倍倍比稀釋后（1∶100～1∶51 200）的LI陽性血清進行檢測。結果顯示，ELISA 方法可檢測的血清稀釋度為≥1∶400（表3），表明本研究建立的間接ELISA 方法敏感性較好。

表3 敏感性試驗結果Table 3 Results of the sensitivity test of the indirect ELISA

2.6 重復性試驗結果利用同批包被的ELISA板，于不同時間對隨機選取的5 份LI 血清進行檢測，結果顯示批內變異系數(shù)為2.8%～6.0%（表4），表明同一批次的多肽包被的ELISA 板在不同時間檢測的重復性良好。

利用不同批次包被的ELISA 板，于同一時間對隨機選取的5 份LI 血清進行檢測，結果顯示，批間變異系數(shù)為3.7%～9.4%（表4），表明不同批次rLI1022蛋白作為抗原檢測的重復性良好。

表4 重復性試驗結果Table 4 Results of the repeatability test for the indirect ELISA

2.7 符合率試驗結果利用已建立的間接ELISA 方法與瑞士Svanova 公司PI 抗體檢測試劑盒同時檢測54份臨床豬血清樣品，結果顯示本研究建立的LI 抗體ELISA 檢測方法檢測陽性樣品29 份，陰性樣品25份；瑞士Svanova 公司PI 抗體檢測試劑盒檢測陽性樣品26 份，陰性樣品28 份。兩者共同檢測的陽性血清26 份，陽性符合率100%；共同檢測的陰性血清25 份，陰性符合率89.28%；總體符合率為94.44%（表5）。表明該方法與商品化試劑盒符合率高，準確性好。

表5 間接ELISA方法與商品化試劑盒的比較Table 5 Comparison between indirect ELISA method and commercialized ELISA kit

2.8 臨床樣品檢測結果利用本研究建立的LI 抗體ELISA 檢測方法檢測江蘇部分地區(qū)319 份臨床血清樣品，結果顯示，總體LI 抗體陽性檢出率為87.77%（280/319），其中連云港陽性率為80.33%（49/61），徐州陽性率為89.06%（57/64），宿遷陽性率為85.48%（53/62），淮安陽性率為92.05%（81/88），泰州陽性率為90.91%（41/44）。表明江蘇各地區(qū)LI 感染率較高。

3 討 論

PPE 屬于慢性消耗性疾病，因其病死率低，一直以來養(yǎng)豬業(yè)并未對該病予以足夠的重視[12]。近年來，世界各地陸續(xù)發(fā)表豬場感染LI 的報道，LI 的感染已遍及全世界[13]。我國對該病的研究較為缺乏，對該病防控主要依賴抗生素[14]，隨著我國逐步控制、禁止抗生素的使用，這將直接增加防控該病的難度，給養(yǎng)豬業(yè)造成經(jīng)濟損失。因此，及時對PPE進行鑒別診斷和監(jiān)測尤為重要。豬腹瀉是養(yǎng)豬業(yè)的一類常見病，其病因復雜多樣，僅憑臨床癥狀難以區(qū)分感染病原，且常伴有混合感染和繼發(fā)感染。因此明確病原，建立病原鑒別診斷方法尤為重要。目前，對PPE 血清抗體檢測的實驗方法尚不成熟，尚無PI 抗體檢測國家標準，因此本研究中的敏感性試驗依據(jù)陰陽性血清在預實驗中檢測的效價進行稀釋。國內市場尚無商品化PI 抗體檢測試劑盒，國外僅l 款由瑞士Svanova公司生產(chǎn)的商品化PPE檢測試劑盒，因此本研究中符合率試驗以國外商品化試劑盒作為比對，以確保本研究建立方法的準確性和可行性。

LI 為專性胞內菌，體外分離培養(yǎng)十分困難，近年來PPE 抗原抗體檢測技術多以LI 相關蛋白做為研究對象[15-16]。目前，已經(jīng)公開發(fā)表全基因組的LI 有2株，分別是2003 年美國明尼蘇達大學發(fā)表的PHE/MN1-00（AM180252.1）和2013年英國莫爾登研究所發(fā)表的N343（CP004029.1）[17]。PHE/MN1-00編碼1 419 個蛋白、N343 編碼1 421 個蛋白，但目前大部分蛋白的功能尚不明確。LI1022是LI的外膜蛋白，可維持LI細胞外膜的完整性，有助于LI對豬回腸細胞的吸附，參與細菌的黏附和侵襲，具有一定的抗原性[11,18-19]。實驗前期通過生物信息學分析去除LI1022信號肽序列，并利用技術優(yōu)化其密碼子，以提高rLI1022 在大腸桿菌BL21中的表達量。Western blot 結果顯示rLI1022 可被兔抗LI 多抗血清所識別，具有良好的反應原性。

將rLI1022 作為包被抗原，經(jīng)過條件摸索及優(yōu)化，初步建立了LI 抗體檢測的間接ELISA 方法[20-22]。確定了該ELISA 檢測方法的陰陽性臨界值；與PRRSV、PRV、FMDV、PEDV 等陽性血清均無交叉反應，表明該方法特異性良好；通過組內和組間重復性試驗發(fā)現(xiàn)，變異系數(shù)均小于10%，表明該方法重復性較好。采用該方法與商品化試劑盒共同檢測54份臨床樣品血清，二者總體符合率達到94.44%。對來自江蘇部分地區(qū)的319 份血清樣品進行檢測分析，總體陽性率達到87.77%，其中淮安和泰州地區(qū)陽性率超過90%，表明LI感染在江蘇地區(qū)已經(jīng)十分普遍。

本研究建立了以rLI1022 為抗原檢測LI 抗體的間接ELISA 方法，該方法敏感性高、特異性強、重復性良好，與商品化試劑盒對比符合率高，可用于臨床血清樣品的檢測，確認豬群PPE 的感染狀態(tài)，這對于該病的診斷具有重要意義，為LI 抗體ELISA 檢測試劑盒的開發(fā)奠定基礎，為PPE 流行病學調查及臨床診斷提供有效的方法。