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    腸炎沙門氏菌FliC單克隆抗體阻斷ELISA檢測方法的建立及初步應(yīng)用

    2022-07-05 00:57:38劉躍生趙海云崔國林禹海杰
    關(guān)鍵詞:小鼠血清檢測

    王 俊,李 軍,劉躍生,劉 銳,趙海云,費(fèi) 楓,崔國林,賈 艷*,禹海杰*

    (1.嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院,浙江 嘉興 314036;2.河北工程大學(xué),河北 邯鄲 056038)

    腸炎沙門氏菌(SalmonellaEnteritidis,SE)是一種重要的食源性病原菌,感染宿主范圍廣泛。禽類是SE重要的儲(chǔ)存宿主[1]。近來,SE的流行病學(xué)調(diào)查研究結(jié)果表明,SE是引起雞、鴨等禽類沙門氏菌病的主要血清型之一[2-3]。SE 感染成年禽類后主要定植于腸道,多呈隱性感染,持續(xù)向外排毒,污染禽肉及蛋產(chǎn)品[4]。國內(nèi)因SE污染禽類食品導(dǎo)致的食物中毒事件也被多次報(bào)道[5-6]。因此禽SE的血清學(xué)診斷具有重要意義。

    目前,SE 的血清學(xué)檢測方法主要有ELISA 方法、試管凝集試驗(yàn)、玻片凝集試驗(yàn)等,其中ELISA 方法的敏感性高和特異性強(qiáng)。用于SE抗體檢測的ELISA方法大多基于菌體表面多糖和蛋白等抗原,例如Xia 等利用沙門氏菌O9 抗原建立競爭ELISA 方法用于檢測腸炎、雞白痢等血清D 群沙門氏菌[7]。FliC 蛋白是SE 鞭毛的主要組分,其氨基酸序列劃分為D0、D1、D2 和D3區(qū)域,D0和D1區(qū)域在沙門氏菌屬內(nèi)高度保守,D2和D3 區(qū)域?yàn)楦咦儏^(qū),同時(shí)也是刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答的主要區(qū)域[8]。Mirhosseini 等利用原核表達(dá)了FliC 蛋白,并以此建立的間接ELISA 方法能夠檢測BALB/c 小鼠血清抗體[9]。阻斷ELISA 方法通過制備的特異性抗體與血清抗體競爭結(jié)合抗原位點(diǎn),具有特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。因此,本研究利用SE FliC蛋白高變區(qū)制備單克隆抗體(MAb),以此為基礎(chǔ)建立抗體阻斷ELISA方法(bELISA),為SE血清學(xué)調(diào)查提供技術(shù)手段。

    1 材料與方法

    1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SE CICC10467 株購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心,其他菌株均保存于本實(shí)驗(yàn)室;大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。6 周齡~8 周齡雌性BALB/c 小鼠購自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(中國北京);1 日齡雛鴨和14 周齡北京鴨購自北京市某北京鴨養(yǎng)殖場。SE 陽性雞血清由本實(shí)驗(yàn)室制備。

    1.2 主要試劑PEG1500、HT/HAT 培養(yǎng)基、SBA Clonotyping System-HRP、弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)購自美國Sigma 公司;Ni 和GST瓊脂糖凝膠,HRP 標(biāo)記山羊抗雞IgG 購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;rProtein A/G 瓊脂糖凝膠購自北京索萊寶科技有限公司;其他化學(xué)試劑均購自國藥集團(tuán);LB 和BPW 培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司;HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 購自北京中衫金橋生物科技有限公司;禽SE 抗體檢測試劑盒(REF 99-08701)購自美國IDEXX 公司。

    1.3 MAb 的制備

    1.3.1 SE FliC蛋白原核表達(dá)、純化和鑒定 參照Gen-Bank 中SE P125109 株(AM933172.1)、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028 株(MF948286.1)、鴨沙門氏菌M-3471株(NZ_CP045458.1)、阿培依姆沙門氏菌1897 株(MK905544.1)的FliC蛋白氨基酸序列,利用Megalign軟件比對序列相似性。根據(jù)SE P125109 株fliC基因的高變區(qū)、pET-21b 和pGEX-2T 質(zhì)粒設(shè)計(jì)兩對引物(pET-21b:F1:GGGAATTCGAACGGGACTAACTCTG ATTCCG/R1: GGGCTCGAGCAGAATCTGCGCTTTAGAC A;pGEX-2T:F2:GCGGATCCAACGGGACTAACTC TGATTCCG/R2:GGGAATTCCCAGAATCTGCGCTTTAG ACA),分別擴(kuò)增目的基因片段。PCR 產(chǎn)物經(jīng)DNA 回收試劑盒回收純化,雙酶切后將其分別克隆于pET-21b 和pGEX-2T 載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET21b-fliC和pGEX-2T-fliC,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞,構(gòu)建重組菌pET21b-fliC/DH5α 和pGEX-2T-fliC/DH5α,PCR 篩選陽性菌株,經(jīng)測序鑒定序列無誤后,將重組大腸桿菌pET21b-fliC/DH5α 和pGEX-2T-fliC/DH5α分別37 ℃培養(yǎng)至OD600nm約為0.6 時(shí),加入終濃度0.5 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)4 h。收集菌體,超聲破碎,4 ℃離心,取沉淀后分別以His 抗體和GST 抗體(1∶5 000)為一抗,HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)為二抗,進(jìn)行western blot 分析。將重組His-FliC 蛋白和GST-FliC 經(jīng)Ni 瓊脂糖凝膠和GST 瓊脂糖凝膠純化, SDS-PAGE 分析純化效果后進(jìn)一步以SE 陽性雞血清(1∶200)為一抗,HRP 標(biāo)記山羊抗雞IgG 為二抗(1∶5 000),通過western blot 鑒定重組蛋白的抗原性,并利用BCA 法測定蛋白濃度。

    1.3.2 雜交瘤細(xì)胞株的制備 將經(jīng)GST 瓊脂糖凝膠純化的GST-FliC 重組蛋白與等劑量FCA 乳化后免疫6~8 周齡雌性BALB/c 小鼠,三周后用純化的GSTFliC 與等劑量FIA 乳化,進(jìn)行第二次免疫,間隔三周后進(jìn)行第三次免疫,方法和免疫劑量同第二次。第三次免疫后第7 d 經(jīng)眼靜脈叢采血,分離血清,以His-FliC 為包被抗原,待篩選雜交瘤細(xì)胞株上清原液為一抗,HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)為二抗,通過間接ELISA 方法檢測血清抗體效價(jià)。取三次免疫后血清抗體效價(jià)為1∶64 000 的小鼠脾臟,分離脾細(xì)胞并與SP2/0 細(xì)胞融合。采用上述間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞。

    1.3.3 小鼠腹水MAb 的制備、純化和鑒定 10 周齡雌性BALB/c小鼠腹腔注射0.5 mL滅菌液體石蠟,致敏14 d 后,每只腹腔注射約5×105個(gè)雜交瘤細(xì)胞,7 d~15 d 采集腹水,短暫離心去除脂肪等雜質(zhì),采用rProtein A/G 瓊脂糖凝膠親和層析法純化腹水,利用SDS-PAGE 分析MAb 純化效果。

    利用SBA Clonotyping System-HRP 試劑盒對MAb的亞類鑒定。同時(shí),分別將SE(H:g,m)、都柏林沙門氏菌(S.Dublin)(H:g,m)、雞白痢沙門氏菌(S. Pullorum)(H:-)、雞 傷 寒 沙 門 氏 菌(S. Gallinarium)(H:-)、鼠傷寒沙門氏菌(S. Typhimurium)(H:1,4,[5],12)、S. Rissen(H:f,g)、S. Senfternberg(H:g,[s],t)、S. Montevideo(H:g,m,s)菌株和大腸桿菌(E. coli)、銅綠假單胞桿菌(P. aeruginosa)、普通變形桿菌(P. vulgaris)、無乳鏈球菌(S. alactolyticus)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(L. monocytogenes)、鴨疫里默氏桿菌(R. anatipestifer)的過夜培養(yǎng)物稀釋至OD600nm約為1.0,取1 mL 菌液8 000 r/min 離心3 min 后,用100 μL 無菌去離子水重懸菌體,分別以篩選制備的MAb 為一抗(1∶5 000),HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)為二抗,通過western blot 分析鑒定MAb。

    1.4 MAb 阻 斷ELISA 方 法 的 建立

    1.4.1 MAb 阻斷ELⅠSA 方法最佳反應(yīng)條件的確定 以MAb 1D3 為阻斷抗體建立bELISA 方法,操作過程:每孔加入100 μL 包被液稀釋的His-FliC 重組蛋白,4 ℃過夜孵育后棄去抗原液,1×PBST 洗滌3次;每孔加入250 μL 封閉液,37 ℃封閉2 h 后棄去封閉液,洗滌同上;每孔加入100 μL 5%脫脂乳稀釋的待檢血清,2個(gè)陽性對照孔加入稀釋的陽性血清,2個(gè)陰性孔加入封閉液,37 ℃孵育1 h 后棄去液體,洗滌同上;每孔加入100 μL 5%脫脂乳稀釋的MAb,37 ℃孵育1 h后棄去液體,洗滌同上;每孔加入100 μL 5%脫脂乳稀釋的HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶5 000),37 ℃孵育1 h 后棄去液體,洗滌同上;每孔加入100 μL 混合均勻的TMB 底物溶液,室溫避光反應(yīng)15 min 后每孔加入50 μL 終止液;讀取OD450nm值。阻斷率(%)計(jì)算公式:(OD450nm空白對照-OD450nm待檢血清)/(OD450nm空白對照)×100%。采用棋盤滴定法,分別對His-FliC 重組蛋白包被濃度(2 倍倍比稀釋:1∶8 μg/mL~1∶0.5 μg/mL)、MAb 稀釋度(2 倍倍比稀釋:1∶1 000~1∶64 000)、包被條件(37 ℃2 h、37 ℃2 h+4 ℃12 h、4 ℃12 h)、封閉液類型(5%脫脂乳、5% BSA),待檢血清(5 份SE 陽性鴨血清、5 份陽性雞血清、5 份陰性鴨血清、5 份陰性雞血清,分別作1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320 稀釋),以確定最佳反應(yīng)條件。

    1.4.2 陰陽性臨界值的確定 采用建立的bELISA 方法檢測239 份經(jīng)凝集試驗(yàn)檢測SE 抗體陰性的鴨血清樣品。計(jì)算239 份陰性血清阻斷率的平均值()和標(biāo)準(zhǔn)差(s),利用SPSS 25.0 對樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn),生成Q-Q 正態(tài)分布圖,以+3s作為陰陽性臨界值。當(dāng)樣品的阻斷率≥+3s時(shí),判為陽性,當(dāng)樣品的阻斷率<+2s時(shí),則判為陰性,樣品阻斷率介于+3s和+2s之間判 為 可 疑。

    1.5 特異性試驗(yàn)利用建立的bELISA 方法分別檢測SE、雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、阿培依姆沙門氏菌、大腸桿菌O78、阿尼蒂斯葡萄球菌、Ⅱ型鴨疫里默氏桿菌陽性血清,每份血清重復(fù)5 次,評(píng)估該方法的特異性。

    1.6 敏感性試驗(yàn)使用5%脫脂乳將經(jīng)western blot 確定為SE 陽性的鴨血清分別作1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640 稀釋,采用本研究建立的bELISA 方法與IDEEX 公司ELISA 試劑盒同時(shí)檢測,評(píng)估本實(shí)驗(yàn)建立的bELISA 方法的敏感性。

    1.7 重復(fù)性試驗(yàn)批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn):選取同批次包被酶標(biāo)板,利用建立的bELISA 方法檢測5 份SE 陽性鴨血清,每份樣品重復(fù)8 次,根據(jù)每份血清樣品阻斷率計(jì)算變異系數(shù)(CV)。批間重復(fù)試驗(yàn):選擇分8 批次包被的酶標(biāo)板,檢測5 份SE 陽性鴨血清,根據(jù)每份血清樣品阻斷率計(jì)算變異系數(shù)(CV)。

    1.8 符合率檢驗(yàn)將采集的北京地區(qū)5 個(gè)肉雞場的105 份雞血清和3 個(gè)鴨場的48 份鴨血清分別利用本實(shí)驗(yàn)建立的bELISA 方法和IDEXX 公司試劑盒檢測。以試劑盒檢測結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn),分別計(jì)算該方法的敏感性(真陽性/(真陽性+假陽性))、特異性(真陰性/(真陰性+假陰性))及二者的符合率((真陽性+真陽性)/(真陽性+假陽性+真陰性+假陰性))。

    1.9 bELISA 方法的初步應(yīng)用北京鴨雛鴨感染實(shí)驗(yàn):將25只SE抗體陰性的7日齡北京鴨雛鴨隨機(jī)分成3 組,A 組:10 只雛鴨每只皮下注射0.5 mL(107cfu)SE;B 組:10 只雛鴨每只皮下注射0.5 mL(106cfu)SE;C 組:5 只皮下注射0.5 mL 無菌PBS,從感染后第2 d 開始,每2 d 采血,分離血清。感染死亡的雛鴨剖檢觀察并分離SE,同時(shí)采用OIE 推薦的微量試管凝集試驗(yàn)(MAT)[10]檢測各組鴨血清抗體水平。

    北京鴨成年鴨感染實(shí)驗(yàn):將20 只14 周齡SE 抗體陰性的北京鴨隨機(jī)分為2 組,A 組:15 只成年鴨每只皮下注射0.5 mL(109cfu)SE;B 組:5 只成年鴨每只皮下注射0.5 mL 無菌PBS。于感染后5 d、11 d、18 d 各組分別剖殺5 只觀察組織病變,分離病原,并采血分離血清,分別采用bELISA 和MAT[10]檢測抗體。

    2 結(jié) 果

    2.1 FliC 蛋白原核表達(dá)、純化和鑒定結(jié)果根據(jù)4個(gè)沙門氏菌血清型FliC 蛋白氨基酸序列比對結(jié)果,截取腸炎沙門氏菌FliC 蛋白高變區(qū)(aa101~aa482)。PCR 擴(kuò)增高變區(qū)基因片段,分別克隆至pET21b 和pGEX2T 載體,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α,經(jīng)測序鑒定序列正確后進(jìn)行IPTG 誘導(dǎo),利用western blot 檢測。結(jié)果顯示分別在52 ku(His-FliC)和70 ku(GST-FliC)處出現(xiàn)特異性條帶(圖1A)。BCA 法測得蛋白濃度分別為0.6 mg/mL(His-FliC)和3.4 mg/mL(GST-FliC)。SDS-PAGE 分析純化效果顯示兩個(gè)重組蛋白均在目的蛋白大小處出現(xiàn)條帶,His-FliC的純化效果較好,呈單一目的條帶(圖1B)。Western blot結(jié)果顯示,兩個(gè)重組蛋白均能夠與SE陽性雞血清發(fā)生特異性反應(yīng)(圖1C),具有良好的反應(yīng)原性。根據(jù)以上結(jié)果,本研究將His-FliC 作為bELISA 方法中的包被抗原,GST-FliC作為免疫原免疫小鼠,制備MAb。

    圖1 重組蛋白原核表達(dá)(A)、純化(B)和鑒定(C)Fig.1 Prokaryotic expression(A),purification(B)and identification(C)of the fusion proteins

    2.2 MAb 的制備及鑒定結(jié)果選取血清抗體效價(jià)為1∶64 000 小鼠制備脾細(xì)胞,利用PEG1500 進(jìn)行細(xì)胞融合,間接ELISA 方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞。經(jīng)過3次克隆純化篩選獲得1 株雜交瘤細(xì)胞命名為1D3,MAb 亞類為IgG1,輕鏈為κ 鏈。rProtein A/G 親和層析純化小鼠腹水,輕鏈和重鏈條帶較單一,表明純化效果較好(圖2A)。Western blot 結(jié)果顯示MAb 1D3可特異性識(shí)別g,m型沙門氏菌鞭毛,但不與鼠傷寒、雞白痢、雞傷寒、阿培依姆等沙門氏菌血清型和大腸桿菌、巴氏桿菌、鴨疫里默氏桿菌、腸球菌、單增李斯特氏菌等發(fā)生反應(yīng)(圖2B),表明MAb 1D3特異性強(qiáng)。

    圖2 MAb純化的SDS-PAGE(A)和western blot鑒定(B)Fig.2 SDS-PAGE purification(A)and western blot identification(B)of MAb

    2.3 bELISA 方法的建立

    2.3.1 bELⅠSA 方法最佳反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果 通過棋盤法優(yōu)化結(jié)果見表1。待檢血清稀釋度優(yōu)化結(jié)果顯示,血清稀釋度為1∶10時(shí)阻斷率在60%以上,稀釋度為1∶20時(shí)阻斷率在40%以上(圖3),因此選取1∶10作為待檢血清的稀釋度[11]。

    表1 阻斷ELISA反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果Table 1 Optimization of working condition of blocking ELISA

    圖3 待檢鴨(A)和雞(B)血清稀釋度的優(yōu)化Fig.3 Optimization of test duck(A)and chicken(B)sera dilution

    2.3.2 陰陽性臨界值的確定 將239 份SE FliC 蛋白抗體陰性鴨血清樣品10 倍倍比稀釋后,采用建立的bELISA 方法檢測,統(tǒng)計(jì)計(jì)算該方法的阻斷率。通過單樣本Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn),得P=0.2>0.05,表明樣品數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布(圖4),因此用該數(shù)據(jù)代表陰性血清樣品具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)算得到239 份樣品阻斷率的平均值為7.70%,標(biāo)準(zhǔn)差為0.0788,因此建立的bELISA 方法的陰陽性臨界值為7.70%+3×0.07587=30.46%,即樣品阻斷率大于等于30.46%判為陽性,阻斷率小于等于7.70%+2×0.07587=22.87%的樣品判為陰性,阻斷率介于30.46%和22.87%之間的血清樣品判為可疑進(jìn)行再次檢測,若仍小于30.46%則判為陰性。

    圖4 陰性血清樣本正態(tài)分布分析Fig.4 The normal distribution analysis of negative serum samples

    2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果采用該bELISA 方法檢測大腸桿菌、鴨疫里默氏桿菌等非沙門氏菌陽性血清和鼠傷寒、雞白痢等沙門氏菌血清型陽性血清,結(jié)果顯示除SE陽性血清外,其他病原陽性血清檢測均為陰性,無交叉反應(yīng)(圖5)。表明本研究建立的bELISA特異性較強(qiáng)。

    圖5 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Specificity test of the bELISA method

    2.5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果將陽性血清倍比稀釋后采用建立的bELISA 方法和IDEXX 試劑盒方法同時(shí)檢測,結(jié)果顯示二者檢測陽性血清最大稀釋倍數(shù)均為1∶320(圖6)。表明本研究建立的bELISA 方法敏感性較高。

    圖6 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Sensitivity analysis of the bELISA method

    2.6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果批內(nèi)重復(fù)性檢測結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出變異系數(shù)為0.66%~1.81%,批間重復(fù)性檢測結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出變異系數(shù)為1.06%~6.25%,均小于10%(表2),表明該bELISA 方法重復(fù)性良好。

    表2 bELISA重復(fù)性試驗(yàn)(n=8)Table 2 The repeatability test of the bELISA(n=8)

    2.7 符合率檢驗(yàn)結(jié)果利用建立的bELISA 方法檢測105 份雞血清,結(jié)果顯示35 份血清陽性,70 份陰性;檢測48 份鴨血清,結(jié)果顯示17 份血清陽性,31份陰性。IDEXX 試劑盒檢測105 份雞血清,結(jié)果顯示38 份血清陽性,67 份血清陰性,48 份鴨血清包括18 份陽性和30 份陰性。根據(jù)以上結(jié)果計(jì)算bELISA方法的特異性為98.97%、敏感性91.07%,兩種方法符合率為96.30%(表3)。表明該bELISA 方法具有較高的特異性和敏感性,可用于臨床檢測。

    表3 bELISA和IDEXX試劑盒方法比較Table 3 Comparative result of the bELISA and IDEXX kit

    2.8 人工感染北京鴨血清抗體檢測7日齡北京鴨分別皮下注射感染SE 107cfu/只和106cfu/只,觀察臨床癥狀并檢測血清抗體,結(jié)果顯示,107cfu/只感染SE后7 d內(nèi)死亡7只,4 d時(shí)1只出現(xiàn)抗體反應(yīng),8 d時(shí)3只均產(chǎn)生抗體,2周左右平均抗體滴度達(dá)到峰值(圖7A);106cfu/只感染SE 北京雛鴨5 d 死亡1 只,6 d 時(shí)3 只出現(xiàn)抗體反應(yīng),2周左右平均抗體滴度達(dá)到峰值(圖7B),共4 只鴨子產(chǎn)生抗體反應(yīng)。107cfu/只感染鴨子產(chǎn)生的抗體水平(1∶160)高于106cfu/只(1∶20)。MAT 檢測各組鴨血清抗體動(dòng)態(tài)變化,呈現(xiàn)與bELISA相同的變化趨勢。死亡鴨子剖檢觀察肝臟和脾臟腫大,肝臟細(xì)菌培養(yǎng)均分離獲得SE。

    圖7 107 cfu/只(A)和106 cfu/只(B)SE感染后北京雛鴨血清抗體動(dòng)態(tài)變化Fig.7 Antibody dynamic changes of Peking ducklings after 107 cfu(A)and 106 cfu(B)Salmonella Enteritidis infection

    成年鴨感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,109cfu/只皮下注射5 d后能夠檢測到抗體反應(yīng),平均抗體滴度約為1∶20;感染后11 d bELISA 和MAT 測定平均抗體滴度均達(dá)到峰值,約為1∶120;感染后18 d平均抗體滴度下降至1∶60(圖8A)。感染后5 d 剖檢可見肝臟出現(xiàn)壞死點(diǎn)(2/5)(圖8B),肝臟組織病原分離結(jié)果顯示5只均攜帶SE。

    圖8 SE感染后北京鴨血清抗體動(dòng)態(tài)變化(A)和病理變化(B)Fig.8 Antibody dynamic changes(A)and liver pathology(B)of Peking ducks after 109 cfu Salmonella Enteritidis infection

    上述結(jié)果表明本研究建立的bELISA 方法可用于臨床SE 檢測及抗體分析。

    3 討 論

    SE和雞白痢沙門氏菌攜帶相同的菌體抗原,傳統(tǒng)的玻片凝集試驗(yàn)無法區(qū)分兩種血清型的陽性血清。本研究基于SE FliC蛋白制備MAb,建立SE bELISA方法用于檢測禽類血清抗體,該檢測方法適用于雞和鴨等禽類血清樣品檢測,且具有較強(qiáng)的特異性。

    為避免檢測方法出現(xiàn)交叉反應(yīng),本研究截取SE FliC 蛋白的高變區(qū)。進(jìn)一步分析SE 血清型菌株之間的序列相似性,根據(jù)GenBank 中1949 年至2020 年共25株SEfliC基因序列比對結(jié)果顯示FliC蛋白氨基酸序列完全一致,表明SEfliC基因高度保守。因此本研究分別原核表達(dá)帶有不同標(biāo)簽的融合蛋白His-FliC 和GST-FliC,用于小鼠免疫和篩選,以排除亞克隆篩選時(shí)出現(xiàn)針對標(biāo)簽蛋白的假陽性雜交瘤細(xì)胞株。

    SE 能夠感染多種禽類,同時(shí)也是感染鴨子的優(yōu)勢血清型之一[12]。目前除用于雞SE 血清抗體的間接ELISA 外,市場上還沒有針對鴨血清抗體檢測的方法,基于MAb 的bELISA 方法相對于間接ELISA 方法穩(wěn)定性好、特異性更強(qiáng)、檢測范圍更廣。本研究建立的bELISA 方法能夠同時(shí)用于雞和鴨血清的SE 抗體檢測,擴(kuò)大了血清學(xué)調(diào)查范圍,為臨床SE 感染的防控提供技術(shù)手段。目前尚無用于沙門氏菌血清抗體檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法,為了評(píng)估本研究建立的bELISA方法,選取IDEXX 公司檢測試劑盒作為參照,分別檢測來自養(yǎng)殖場的105 份雞血清和48 份鴨血清,結(jié)果顯示其具有較高的特異性和敏感性,證明該方法可用于雞和鴨血清SE 抗體檢測。檢測雞血清得出總的SE 血清抗體陽性率約為33.33%,每個(gè)雞場的平均陽性率約為27%,由于檢測血清均為玻片凝集初篩陽性血清,因此陽性率較高,但是可以反映這5 個(gè)雞場存在SE 感染,此結(jié)果也符合這些雞場SE 的病原分離結(jié)果[3]。

    為了進(jìn)一步分析bELISA 方法的可行性,本研究采用107cfu/只和106cfu/只兩個(gè)劑量的SE 感染北京鴨雛鴨,感染后兩個(gè)劑量均能夠引起雛鴨部分死亡,并且感染鴨肝臟可再次分離到SE。利用本實(shí)驗(yàn)建立的bELISA方法進(jìn)行血清抗體檢測,結(jié)果顯示106cfu/只感染劑量僅引起部分(4/9)雛鴨產(chǎn)生抗體反應(yīng)。研究表明SE 感染能夠?qū)е缕⑴KB 細(xì)胞數(shù)量下降,從而抑制抗體產(chǎn)生[13]。Zhang 等通過SE 口服感染12 周齡紹興鴨,當(dāng)感染劑量達(dá)到1011cfu/只才能產(chǎn)生抗體應(yīng)答反應(yīng),且感染劑量達(dá)到1011cfu/只時(shí)仍有71.8%的鴨子器官無病變,且組織分離不到SE,表明紹興鴨對SE具有一定抗性[14]。結(jié)合本研究檢測結(jié)果推測北京鴨個(gè)體差異導(dǎo)致了抗體反應(yīng)的參差不齊。

    綜上,本研究首次建立的SE bELISA 方法具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、敏感性高的特點(diǎn),能夠用于禽SE 感染的血清學(xué)調(diào)查及抗體檢測,為SE 感染監(jiān)測提供快速有效的手段。

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