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    新型鴨呼腸孤病毒動(dòng)物感染模型的建立

    2022-07-05 00:57:36高玉龍劉長(zhǎng)軍祁小樂(lè)崔紅玉張艷萍王笑梅
    關(guān)鍵詞:雛鴨載量脾臟

    羅 丹,劉 芮,高玉龍,李 凱,劉長(zhǎng)軍,祁小樂(lè),崔紅玉,張艷萍,潘 青,高 立*,王笑梅,2*

    (1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150069;2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人畜共患病協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚(yáng)州 225009)

    2006 年在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)鴨脾壞死病(Duck spleen necrosis disease,DSND),該病是由新型鴨呼腸孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)引起的一種以鴨脾臟表面出血或壞死為病變特征的疾病[1-3]。自2017 年以來(lái),DSND 在山東、江蘇和河南等地區(qū)的養(yǎng)鴨場(chǎng)中時(shí)有暴發(fā),有研究表明其致病性與先前報(bào)道的DSND 不同,呈不斷變異和增強(qiáng)態(tài)勢(shì)[4-6]。NDRV主要感染30 日齡以?xún)?nèi)的雛鴨,脾臟為其主要靶器官,感染日齡愈小,發(fā)病率和死亡率愈高。目前,該病已廣泛存在于我國(guó)水禽飼養(yǎng)地區(qū),給水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[7-12]。

    然而,目前尚無(wú)商業(yè)疫苗用于新型鴨呼腸孤病毒病的防控。隨著NDRV 感染宿主范圍和地理位置的不斷擴(kuò)大,NDRV 疫苗的研發(fā)愈發(fā)重要,而動(dòng)物感染模型是評(píng)價(jià)疫苗效果的重要工具[13-18],但相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期流行病學(xué)調(diào)查和致病性研究表明,2019 年分離的以脾臟腫脹壞死為特征的SD19/6201 株為NDRV 流行代表株[7-8],因此本研究選用該病毒株建立了NDRV 的14 日齡和21 日齡雛鴨感染模型,確定了感染劑量、剖檢時(shí)間及發(fā)病指標(biāo),為NDRV 疫苗免疫效果評(píng)價(jià)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料NDRV SD19/6201 株(MT829205~MT829214)由本實(shí)驗(yàn)室保存。SPF 麻鴨購(gòu)自國(guó)家禽類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源庫(kù),飼養(yǎng)于負(fù)壓隔離器中,且本研究中涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已獲得黑龍江省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并按照科學(xué)技術(shù)部的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指南》以及動(dòng)物道德準(zhǔn)則和批準(zhǔn)的規(guī)程操作。

    TRIzol、Premix ExTaq(Probe qPCR)均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;M-MLV Reverse Transcriptase 購(gòu)自Invitrogen 公司。

    1.2 NDRV 動(dòng)物感染試驗(yàn)將120 只1 日齡SPF 雛鴨隨機(jī)分成6 組(1~4 組為感染組、5~6 組為對(duì)照組),每組20 只,飼養(yǎng)于負(fù)壓隔離器中。將SPF 雛鴨飼養(yǎng)至14 日齡時(shí),組1 和組2 分別按105.0ELD50/0.1 mL/只和106.0ELD50/0.1 mL/只劑量經(jīng)腿部肌肉接種NDRV SD19/6201 株,組5 對(duì)照組經(jīng)腿部肌肉接種0.1 mL PBS;將SPF雛鴨飼養(yǎng)至21日齡時(shí),組3和組4分別按105.0ELD50/0.1 mL/只、106.0ELD50/0.1 mL/只劑量經(jīng)腿部肌肉接種NDRV SD19/6201 株,組6 對(duì)照組經(jīng)腿部肌肉接種0.1 mL PBS。采用隔離器飼養(yǎng),保證充足的飲水、采食和光照。

    1.3 NDRV 感染SPF 鴨臨床癥狀及剖檢變化1.2中SPF 雛鴨感染后每天早晚各觀察一次,記錄發(fā)病和死亡情況,連續(xù)觀察7 d。分別在感染后第5 d(5 dpi)、7 dpi 自各組中隨機(jī)選取10 只雛鴨,頸靜脈放血迫殺后剖檢并觀察脾臟有無(wú)腫脹、出血點(diǎn)(斑)或黃白色壞死灶等病理變化。

    1.4 NDRV 感染SPF 鴨脾臟組織病理學(xué)觀察將分別于感染后第5 d、7 d 采集的各組SPF 雛鴨的脾臟組織一部分按常規(guī)方法固定于福爾馬林溶液,制作病理切片,進(jìn)行組織病理學(xué)觀察分析。另一部分-20 ℃保存?zhèn)溆?,用于后續(xù)病毒載量的檢測(cè)。

    1.5 各組鴨脾臟指數(shù)的測(cè)定在5 dpi、7 dpi 分別取6 組各其余10 只,稱(chēng)重后放血剖殺,采集脾臟稱(chēng)重,計(jì)算脾臟比重和脾臟指數(shù)(脾臟比重=脾臟重/體重,脾臟指數(shù)=感染組脾臟比重/對(duì)照組脾臟比重)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示,采用GraphPad Prism 8 雙因素方差分析方法(Two-way-ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.05 表示差異顯著,P<0.01 表示差異極顯著。

    1.6 各組鴨脾臟病毒載量檢測(cè)取1.4 中采集的各組雛鴨脾臟組織各1 g,研磨破碎后采用TRIzol 試劑進(jìn)行病毒RNA 提取,利用M-MLV Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以其為模板,采用文獻(xiàn)[19]中NDRV 熒光定量引物和探針,參照文獻(xiàn)[20]中TaqMan 熒光定量RT-PCR 方法對(duì)各組雛鴨脾臟中的病毒載量進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)樣品重復(fù)3次,并對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

    2 結(jié) 果

    2.1 NDRV 感染SPF 鴨臨床癥狀及剖檢變化將NDRV SD19/6201 株分別感染SPF 雛鴨后觀察雛鴨臨床癥狀及剖檢變化。結(jié)果顯示,感染組雛鴨均表現(xiàn)為喜臥、精神稍有沉郁等臨床癥狀,無(wú)死亡,對(duì)照組無(wú)明顯異常。剖檢觀察可見(jiàn),各感染組發(fā)病鴨脾臟出現(xiàn)腫大、表面有出血斑或壞死灶等特征性病變,而其他臟器和對(duì)照組各臟器均無(wú)明顯眼觀病變(圖1)。將脾臟出血或壞死等特征性病變作為NDRV 感染雛鴨的發(fā)病指標(biāo),各組發(fā)病比率統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表1。

    表1 NDRV感染鴨的發(fā)病率統(tǒng)計(jì)Table 1 Morbidity of animals infected with NDRV

    14 日齡感染雛鴨,5 dpi 時(shí)低劑量感染組雛鴨剖檢病變以脾臟出血點(diǎn)/斑為主,脾臟病變比率為70%(圖1A);高劑量感染組所有雛鴨脾臟均出現(xiàn)黃白色壞死灶,脾臟病變比率為100%。7 dpi 時(shí)雛鴨脾臟病變更加嚴(yán)重,甚至個(gè)別脾臟完全壞死,低高劑量組脾臟的病變比率分別為80%和90%。

    與14 日齡雛鴨相比,21 日齡雛鴨感染后脾臟剖檢病變較輕(圖1),低劑量感染組雛鴨在5 dpi 和7 dpi 脾臟出現(xiàn)腫大、出血或壞死的比率明顯低于相同劑量的14 日齡雛鴨感染組;高劑量感染組雛鴨在5 dpi 和7 dpi 脾臟出現(xiàn)出血、壞死的比率均為80%,但7 dpi 脾臟黃白色壞死灶病變較5 dpi 更明顯。各對(duì)照組雛鴨未見(jiàn)異常,剖檢脾臟無(wú)任何病變(圖1B)。

    圖1 NDRV感染雛鴨的脾臟剖檢病變Fig.1 Spleen lesion of ducklings infected with NDRV

    以上結(jié)果表明,NDRV 感染引起的脾臟病變程度與感染鴨日齡呈負(fù)相關(guān),與21 日齡雛鴨感染組相比,14 日齡雛鴨對(duì)NDRV 更易感,表現(xiàn)為感染雛鴨脾臟發(fā)病率更高,脾臟眼觀病變更嚴(yán)重。

    2.2 NDRV 感染SPF 鴨脾臟組織病理學(xué)觀察在5 dpi、7 dpi 采集各組SPF 鴨的脾臟組織,制作病理切片后觀察組織病變,結(jié)果顯示感染組鴨均可見(jiàn)脾臟紅白髓界限不清,淋巴細(xì)胞數(shù)量減少,異嗜細(xì)胞浸潤(rùn),呈局灶性壞死等。其中在7 dpi 時(shí),高劑量感染組14 日齡雛鴨脾臟局部出現(xiàn)大面積壞死,伴隨蛋白樣滲出,巨噬細(xì)胞增生(圖2B、圖2C),21 日齡雛鴨脾臟組織內(nèi)淋巴細(xì)胞大量減少,脾臟紅髓可見(jiàn)異嗜細(xì)胞增生。對(duì)照組鴨脾臟組織正常。上述結(jié)果顯示,與14 日齡雛鴨感染組相比,21 日齡雛鴨感染組脾臟組織病變更輕(圖2E、圖2F),這與剖檢病變一致。表明以脾臟剖檢病變作為NDRV 感染模型發(fā)病指標(biāo)具有科學(xué)性。

    圖2 高劑量NDRV感染雛鴨脾臟病理組織切片觀察結(jié)果(標(biāo)尺為100 μm)Fig.2 Results of histopathological section in spleen of the high dose NDRV infected ducklings(Scale is 100 μm)

    2.3 各組鴨脾臟指數(shù)的測(cè)定結(jié)果各組鴨脾臟指數(shù)的測(cè)定結(jié)果顯示,14 日齡和21 日齡感染雛鴨在5 dpi 脾臟指數(shù)顯著或者極顯著高于對(duì)照組(P<0.05 或P<0.001;圖3A),在7 dpi 14 日齡雛鴨感染組脾臟指數(shù)與對(duì)照組脾臟指數(shù)無(wú)明顯差異,但脾臟壞死癥狀并未恢復(fù)(圖1A);在5 dpi 和7 dpi 時(shí)21 日齡感染雛鴨脾臟指數(shù)均顯著或者極顯著高于對(duì)照組(P<0.05,P<0.01 或P<0.001;圖3B),但脾臟腫脹程度7 dpi 時(shí)較5 dpi 減輕。以上結(jié)果表明,NDRV 可引起感染雛鴨脾臟腫大,隨著感染時(shí)間的推移脾臟腫大程度變輕,但其壞死癥狀并未恢復(fù)。

    圖3 NDRV感染后不同時(shí)間鴨的脾臟指數(shù)Fig.3 Index of spleen at different time points after NDRV infection

    2.4 各組鴨脾臟病毒載量檢測(cè)結(jié)果利用熒光定量PCR 檢測(cè)方法對(duì)靶器官脾臟進(jìn)行病毒載量的檢測(cè),結(jié)果顯示,在5 dpi 即可在各組感染雛鴨脾臟中檢測(cè)到大量病毒,且高劑量感染組雛鴨脾臟中病毒載量高于低劑量感染組雛鴨;在5 dpi 時(shí)14 日齡雛鴨(低日齡)各劑量感染組病毒載量明顯高于21 日齡雛鴨(高日齡)各劑量感染組;在7 dpi,除21 日齡高劑量感染組雛鴨脾臟中病毒載量稍高于5 dpi 外,其余各劑量感染組脾臟病毒載量均明顯低于5 dpi(圖4)。

    圖4 NDRV感染雛鴨脾臟病毒載量的檢測(cè)Fig.4 Detection of viral loads in spleen of the NDRV infected ducklings

    以上結(jié)果顯示,NDRV 在低日齡雛鴨脾臟中復(fù)制滴度明顯高于高日齡雛鴨,表明NDRV 在低日齡雛鴨脾臟中的復(fù)制能力更強(qiáng),這可能是造成NDRV在不同日齡雛鴨上致病性差異的原因,即隨著雛鴨日齡的增大而對(duì)該病原易感性降低,抵抗力增強(qiáng)。

    2.5 NDRV 動(dòng)物感染模型評(píng)價(jià)指標(biāo)的確定通過(guò)以不同劑量NDRV 感染不同日齡雛鴨,以雛鴨脾臟特征性出血或壞死作為NDRV 感染的發(fā)病指標(biāo),統(tǒng)計(jì)其發(fā)病率,確定了NDRV 對(duì)14 日齡雛鴨的最佳感染劑量為105.0ELD50/0.1 mL,對(duì)21 日齡雛鴨的最佳感染劑量為106.0ELD50/0.1 mL,最佳迫殺時(shí)間均為7 dpi,此時(shí)脾臟黃白色壞死灶明顯,脾臟病變比率可達(dá)80%(8/10)。

    3 討 論

    NDRV 感染是嚴(yán)重危害我國(guó)水禽業(yè)健康發(fā)展的重要傳染病之一。近年來(lái),針對(duì)該病原的疫苗研發(fā)是目前的關(guān)注點(diǎn),但如何對(duì)相關(guān)疫苗效果進(jìn)行評(píng)價(jià),一直是限制該病疫苗研發(fā)的瓶頸,而NDRV 動(dòng)物感染模型的建立是評(píng)價(jià)疫苗效果的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)室前期分離獲得9 株NDRV,對(duì)其主要保護(hù)性抗原基因σC 的遺傳進(jìn)化分析表明,NDRV SD19/6201 株為當(dāng)前流行代表株[7-8]。因此本研究以該病毒株建立動(dòng)物感染模型具有普適性。

    NDRV 對(duì)雛鴨的致病與其日齡呈負(fù)相關(guān),即雛鴨感染日齡越大,病毒對(duì)其致病性越弱[21]?;谠摬≡攸c(diǎn),應(yīng)盡量選擇小日齡雛鴨進(jìn)行動(dòng)物感染試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),NDRV 感染1 日齡雛鴨后的10 d~14 d 為抗體高水平期,之后抗體水平開(kāi)始下降[8]。李靜等將NDRV-SDYC 株作為疫苗株,制備油乳劑滅活疫苗免疫1 日齡雛鴨后5 d 開(kāi)始產(chǎn)生抗體,14 d 和21 d 為抗體高水平期[22],這與本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果基本一致。NDRV 主要侵害30 日齡以?xún)?nèi)的雛鴨,為了使其高峰抗體水平可覆蓋整個(gè)易感期,所以常在1 日齡或7 日齡免疫NDRV 候選疫苗,免疫后14 d 或21 d 抗體水平較高,此時(shí)進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn),評(píng)價(jià)疫苗免疫效果較合理。因此,本研究以不同劑量NDRV SD19/6201 株感染14 日齡和21 日齡雛鴨,建立了NDRV 對(duì)14 日齡和21 日齡雛鴨的感染模型。

    有研究報(bào)道湖北地區(qū)的鴨呼腸孤病毒感染主要以脾臟和法氏囊壞死為主要特征[23];廣西、山東、廣東及江蘇等地的NDRV 分離株主要引起雛鴨脾臟腫大和壞死[24]。由于靶器官脾臟是NDRV 檢測(cè)和分離的首選臟器[25-26],因此,雛鴨脾臟的病理變化是該病原感染模型建立的主要依據(jù),雛鴨脾臟出血或壞死的特征性病變可作為NDRV 感染雛鴨的發(fā)病指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)室前期在1 日齡雛鴨上開(kāi)展了NDRV 的動(dòng)物感染試驗(yàn),分別在1 dpi、3 dpi、5 dpi、7 dpi、10 dpi、14 dpi 對(duì)雛鴨進(jìn)行剖檢觀察可見(jiàn),在1 dpi~3 dpi 雛鴨脾臟病變以出血、腫脹為主,病變輕微;在5 dpi~10 dpi 雛鴨脾臟病變最嚴(yán)重,特別是在7 dpi和10 dpi,脾臟病變以黃白色壞死點(diǎn)、斑為主;在14 dpi 雛鴨脾臟壞死斑病變有所恢復(fù),病變較輕微[8]。鑒于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在本研究選擇5 dpi 和7 dpi 2 個(gè)迫殺時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察,最終確定了最佳迫殺時(shí)間為7 dpi,各感染組脾臟病變以黃白色壞死灶為主,能夠保證發(fā)病率統(tǒng)計(jì)的準(zhǔn)確性。與SD19/6201 株感染21日齡雛鴨相比,病毒感染14 日齡雛鴨脾臟出現(xiàn)出血或壞死的比率更高、病變更明顯,且脾臟病理變化更嚴(yán)重。提示14 日齡雛鴨對(duì)NDRV 更易感。Li 等人將NDRV 接種21 日齡櫻桃谷鴨的致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示,21 日齡櫻桃谷鴨對(duì)NDRV 有很強(qiáng)的抵抗力[27]。本研究中21 日齡雛麻鴨對(duì)NDRV 的感染也呈現(xiàn)出一定的抵抗力,但106.0ELD50/0.1 mL/只的高接種劑量也能引起21 日齡雛麻鴨脾臟出現(xiàn)80%的病變比率,這可能與不同NDRV 分離株的致病力和被感染鴨的品種有關(guān)。本研究初期也曾嘗試建立6 周齡麻鴨的NDRV 感染模型,但該日齡麻鴨感染NDRV 后無(wú)任何臨床癥狀,各器官特別是靶器官脾臟也無(wú)任何剖檢變化,進(jìn)一步體現(xiàn)了該病原與鴨日齡呈負(fù)相關(guān)的致病特點(diǎn),隨著鴨子日齡的增大對(duì)該病原的易感性明顯降低,抵抗力明顯增強(qiáng)。

    綜上,結(jié)合NDRV 的致病特點(diǎn),本研究確定了NDRV 對(duì)14 日齡雛鴨的最佳感染劑量為105.0ELD50/0.1 mL/只,21 日齡雛鴨最佳感染劑量為106.0ELD50/0.1 mL/只,最佳迫殺時(shí)間均為7 dpi,以脾臟出血、壞死為發(fā)病指標(biāo),病變率為80%(8/10)。本研究首次建立了NDRV 對(duì)不同日齡雛鴨的動(dòng)物感染模型,該感染模型評(píng)價(jià)指標(biāo)直觀,可操作性強(qiáng),也便于基層推廣應(yīng)用,為DSND 相關(guān)疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供重要依據(jù)。

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