大腸桿菌噬菌體Bp4尾部蛋白在宿主識別中的作用研究

李興健，孫蓉蓉，張 燦，劉文華，鄒 玲，任慧英

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109）

近年來，養(yǎng)殖業(yè)對抗生素過度依賴造成了抗生素的濫用，導(dǎo)致多重耐藥性細(xì)菌的相繼出現(xiàn)，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到行業(yè)的健康發(fā)展甚至人類健康。噬菌體作為細(xì)菌的天敵，可特異性殺菌，且其殺菌作用迅速、不受細(xì)菌耐藥性的限制、無毒副作用，受到醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)臨床的普遍重視[1]。因此探究噬菌體感染細(xì)菌的機(jī)制，研制新型抗菌類藥物刻不容緩。

根據(jù)形態(tài)可以將噬菌體分為3 大類：有尾噬菌體、絲狀噬菌體和無尾噬菌體，其中有尾噬菌體占比96%[2]。根據(jù)噬菌體尾部結(jié)構(gòu)的不同，又可以將有尾噬菌體分為長尾噬菌體、短尾噬菌體和肌尾噬菌體3 個(gè)科。不同噬菌體對同種宿主菌的吸附機(jī)制不同，同一噬菌體對同種細(xì)菌不同菌株的吸附機(jī)制也可能存在差異[3]。噬菌體尾部蛋白包括尾絲蛋白、尾刺蛋白、尾纖維蛋白等，負(fù)責(zé)對宿主細(xì)胞的識別和吸附[4]，與噬菌體的吸附機(jī)制有關(guān)。

短尾噬菌體包括P22 類噬菌體、T7 類噬菌體和N4 類噬菌體等[5]，本實(shí)驗(yàn)室分離的大腸桿菌短尾噬菌體Bp4 為N4 類噬菌體，經(jīng)基因組注釋發(fā)現(xiàn)其含有3 個(gè)尾部蛋白，即gp10（假定尾部蛋白）、gp11（尾絲蛋白）和gp13（尾刺蛋白），這3 個(gè)蛋白主要功能是負(fù)責(zé)對宿主受體的識別與吸附。但一般N4 類短尾噬菌體中無gp11和gp13基因[6]。研究結(jié)果顯示， N4 類噬菌體中的gp65 是識別宿主菌受體所必需的，但在Bp4 中卻未發(fā)現(xiàn)該類似基因[7]。這些結(jié)果顯示噬菌體Bp4 和N4 類短尾噬菌體的尾部蛋白基因不同，表明噬菌體Bp4 具有與N4 類噬菌體不同的吸附機(jī)制，因此，明確該噬菌體在識別宿主菌過程中的主要吸附蛋白對研究噬菌體的裂解機(jī)制及改造噬菌體有重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)室前期分離的多價(jià)噬菌體Bp4 為禽致病性大腸桿菌（APEC）的N4 類噬菌體，對該類細(xì)菌的裂解率達(dá)35%，可裂解O78、O88及O15等多種血清型的大腸桿菌[7]，但其識別宿主受體的機(jī)制尚不明確。因此，本研究對噬菌體Bp4 的3 個(gè)尾部蛋白gp10、gp11 和gp13 進(jìn)行相關(guān)研究，以明確Bp4 在宿主識別過程中起關(guān)鍵作用的尾部蛋白，為進(jìn)一步研究噬菌體感染宿主的機(jī)制及拓寬噬菌體的宿主譜奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料噬菌體Bp4 及其宿主菌O78血清型大腸桿菌由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物學(xué)研究室分離鑒定并保存。大腸桿菌BL21（DE3）菌株、原核重組表達(dá)載體pcoldTF 均由本實(shí)驗(yàn)室保存；未經(jīng)免疫的家兔陰性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備。

瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小提試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；DAB 試劑盒購自Biosharp 公司；牛血清白蛋白（BSA）、低分子量蛋白Marker 購自Solarbio 公司；T4 DNA Ligase、DL2000 DNA Marker、限制性內(nèi)切酶NdeI 與EcoR I、HRP 標(biāo)記羊抗鼠IgG（HRP-IgG）、鼠His 標(biāo)簽單克隆抗體（MAb）均購自寶生物工程（大連）有限公司；His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 尾部蛋白基因gp10、gp11、gp13的PCR 擴(kuò)增按照文獻(xiàn)[8]，利用O78血清型大腸桿菌為宿主菌進(jìn)行噬菌體Bp4 的增殖。參照GenBank 中噬菌體Bp4的全基因組序列（KJ135004.2），利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)分別針對尾部蛋白基因gp10、gp11、gp13的引物，并在其兩端分別加入酶切位點(diǎn)NdeI和EcoR I（下劃線表示）（表1）。

表1 噬菌體Bp4尾部蛋白基因的擴(kuò)增引物Table 1 Primers of tail proteins of phage Bp4

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定及重組蛋白gp10、gp11、gp13 的表達(dá)以噬菌體Bp4 增殖液為模板，采用表1 中的相應(yīng)引物，經(jīng)PCR 擴(kuò)增Bp4 尾部蛋白基因。擴(kuò)增程序：94 ℃5 min；94 ℃1 min、55 ℃1 min、72 ℃1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物回收與純化后分別克隆至經(jīng)NdeI 和EcoR I 雙酶切的表達(dá)載體pcoldTF 中，構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒pcoldTF-gp10、pcoldTF-gp11、pcoldTF-gp13，并分別經(jīng)NdeI/EcoR I 雙酶切和測序鑒定。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，在含1%Amp的LB中培養(yǎng)至OD600nm約為0.6～0.8 時(shí)加入終濃度為0.01 mol/L的IPTG 誘導(dǎo)12 h，取上清經(jīng)SDS-PAGE 檢測后，以His 標(biāo)簽MAb（1∶1 500）為一抗，以羊抗鼠HRP-IgG（1∶3 000）為二抗，經(jīng)western blot 鑒定各重組蛋白的表達(dá)，并設(shè)誘導(dǎo)后含空質(zhì)粒的重組菌作為陽性對照。獲得的重組蛋白分別命名為rgp10、rgp11 及rgp13。將各重組蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)并經(jīng)His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化后，采用BCA 試劑盒分別測定各重組蛋白的含量。

1.4 各蛋白兔多克隆抗體的制備與效價(jià)的檢測調(diào)整各重組蛋白濃度均為1.0 mg/mL，以201 油性佐劑與各重組蛋白混勻乳化后， 免疫家兔，2 mL/只。共免疫4 次，每次間隔一周。4 免后1 周采集各組家兔血清，采用瓊脂免疫雙向擴(kuò)散試驗(yàn)[9]測定針對gp10、gp11、gp13 的抗體效價(jià)，選擇效價(jià)達(dá)1∶4 以上的抗血清用于后續(xù)試驗(yàn)。將制備的gp10、gp11、gp13 的兔多克隆抗體分別命名為anti-gp10、antigp11 和anti-gp13。

1.5 尾部蛋白競爭吸附試驗(yàn)檢測噬菌體Bp4 吸附宿主菌的關(guān)鍵蛋白利用雙層平板法[6]，將200 μL O78型大腸桿菌懸液（8×109cfu/mL）分別與200 μL 濃度為1.0 mg/mL 純化的rgp10、rgp11 與rgp13 混合，對照組加入200 μL LB 肉湯，37 ℃孵育10 min 后，加入100 μL 9×1010pfu/mL的噬菌體Bp4增殖液，37 ℃孵育5 min，將其與5 mL 的上層培養(yǎng)基混合并吹打均勻，倒在事先鋪好并已凝固的下層培養(yǎng)基上。37 ℃培養(yǎng)12 h 后檢測并計(jì)算各組噬菌斑的數(shù)量，按照公式：噬菌體相對吸附率=實(shí)驗(yàn)組噬菌斑數(shù)/對照組噬菌斑數(shù)×100%，計(jì)算噬菌體對大腸桿菌的相對吸附率。利用GraphPad Prism 6 軟件作圖，分析噬菌體Bp4 吸附宿主菌的關(guān)鍵蛋白。

1.6 尾部蛋白抗體阻斷吸附試驗(yàn)檢測噬菌體Bp4 吸附宿主菌的關(guān)鍵蛋白取100 μL 9×1010pfu/mL 的噬菌體增殖液分別與100 μL 不同尾部蛋白的抗血清（anti-gp10、anti-gp11、anti-gp13）37 ℃孵育5 min，以阻斷噬菌體對大腸桿菌的吸附。再加入200 μL 8×109cfu/mL 大腸桿菌菌增殖液，37 ℃作用5 min，以未免疫家兔的陰性血清為對照，參照1.5 中雙層平板法檢測計(jì)算，并分析噬菌體Bp4 吸附宿主菌的關(guān)鍵蛋白。

1.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析1.5、1.6 試驗(yàn)中兩組間的差異性通過Student's t-test 檢驗(yàn)，P＞0.05 表示差異不顯著，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定及重組蛋白的表達(dá)鑒定結(jié)果以噬菌體Bp4 的基因組為模板，PCR 擴(kuò)增其尾部基因gp10、gp11及gp13，分別克隆至pcoldTF 載體中，構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒pcoldTFgp10、pcoldTF-gp11 及pcoldTF-gp13。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定結(jié)果顯示，分別出現(xiàn)711 bp、1 803 bp、2 115 bp 的目的條帶及5 733 bp 的載體條帶（圖1）。測序結(jié)果均與預(yù)期一致，表明正確構(gòu)建了上述3 種尾部蛋白基因重組表達(dá)質(zhì)粒。將重組菌pcoldTFgp10/BL21、pcoldTF-gp11/BL21 和pcoldTF-gp13/BL21經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)后，以鼠His 標(biāo)簽MAb 為一抗，羊抗鼠HRP-IgG 為二抗，經(jīng)western blot 鑒定結(jié)果顯示，上述重組菌分別在79 ku、117 ku和126 ku處出現(xiàn)與預(yù)期大小相一致的特異性條帶（圖2A、圖2B），表明rgp10、rgp11 及rgp13 在大腸桿菌中獲得了表達(dá)。通過BCA 蛋白濃度檢測試劑盒測得純化蛋白的濃度均為3 mg/mL。

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒pcoldTF-gp10（A）、pcoldTF-gp11（B）及pcoldTF-gp13（C）的雙酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Double enzyme digestion results of pcoldTF-gp10(A),pcoldTF-gp11(B)and pcoldTF-gp13 recombinat plasmids(C)

圖2 重組蛋白的western blot鑒定（A、B）結(jié)果Fig.2 Western blot detection of recombinant protein(A,B)

2.2 各重組蛋白兔多克隆抗體的制備與效價(jià)的檢測結(jié)果將各重組蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)并純化后，將各重組蛋白免疫小鼠4 次后采血，采用瓊脂免疫雙向擴(kuò)散試驗(yàn)檢測各重組蛋白的效價(jià)。結(jié)果顯示，獲得的各重組蛋白兔抗血清anti-gp10、anti-gp11 和antigp13 的效價(jià)分別為1∶4、1∶8、1∶8，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 噬菌體尾部蛋白競爭吸附試驗(yàn)結(jié)果將O78型大腸桿菌分別與rgp10、rgp11 和rgp13 孵育10 min后，加入噬菌體Bp4 增殖液吸附5 min 后，經(jīng)雙層平板法檢測并計(jì)數(shù)各組噬菌斑的數(shù)量，計(jì)算噬菌體對大腸桿菌的相對吸附率。結(jié)果顯示，尾刺蛋白rgp13組中噬菌體對大腸桿菌的相對吸附率為0，與對照組差異極顯著（P＜0.01）。而尾部蛋白rgp10 組和尾絲蛋白rgp11 組中噬菌體對大腸桿菌的相對吸附率均為100%，均與對照組無差異（圖3）。rgp13 在體外能夠完全抑制噬菌體Bp4 對宿主菌的吸附，而rgp10、rgp11 不能抑制噬菌體Bp4 對宿主菌的吸附，表明rgp13 是噬菌體Bp4 吸附宿主菌受體的關(guān)鍵尾部蛋白。

圖3 各重組尾部蛋白對噬菌體Bp4的相對吸附率的影響Fig.3 Effect of recombinat tail proteins on the relative adsorption rate of phage Bp4

2.4 噬菌體尾部蛋白抗體阻斷吸附試驗(yàn)結(jié)果分別利用制備的各重組蛋白抗血清與噬菌體Bp4 相互作用5 min 后，加入O78型大腸桿菌宿主菌吸附5 min，利用雙層平板法檢測并對各組噬菌斑計(jì)數(shù)，計(jì)算噬菌體對大腸桿菌的相對吸附率。結(jié)果顯示，antigp11、anti-gp13組中的噬菌體對大腸桿菌的相對吸附率均為0，且與對照組相比差異均極顯著（P＜0.01）。而anti-gp10 組與對照組一樣，其中的噬菌體對宿主菌的相對吸附率均為100%，即anti-gp10 不能夠競爭噬菌體Bp4 對宿主菌的吸附（圖4）?？梢娢步z蛋白抗血清anti-gp11 和尾刺蛋白抗血清anti-gp13 在體外均能夠完全競爭噬菌體Bp4 對宿主菌的吸附。這兩種抗體與噬菌體尾部蛋白的特異性結(jié)合，使噬菌體尾部蛋白無法識別并結(jié)合受體，阻斷了噬菌體對宿主菌的吸附，而尾部蛋白anti-gp10 則無該阻斷作用。進(jìn)一步表明尾刺蛋白gp13 是噬菌體Bp4 識別宿主菌的關(guān)鍵蛋白，而尾絲蛋白gp11 是影響噬菌體Bp4 識別宿主菌的重要蛋白。

圖4 各尾部蛋白的多克隆抗體對噬菌體相對吸附率的影響Fig.4 Effects of polycloned antibodies against tail protein gp10，gp11 and gp13 on the relative adsorption rate of phage Bp4

3 討 論

噬菌體在對抗耐藥菌感染中發(fā)揮越來越重要的作用。有尾噬菌體通過尾部蛋白與細(xì)菌表面受體的作用，引發(fā)噬菌體的感染及裂解過程[10]。噬菌體受體的特異性識別限制了噬菌體的裂解譜，目前主要利用噬菌體雞尾酒擴(kuò)大噬菌體制劑的裂解譜，以增強(qiáng)噬菌體臨床應(yīng)用的有效性[11]。通過噬菌體與宿主菌的相互作用研究，明確決定噬菌體感染細(xì)菌的主要尾部蛋白，將有利于改造噬菌體從而擴(kuò)展其的宿主譜。本研究所用的噬菌體Bp4 為短尾噬菌體，屬N4 類雙鏈DNA 噬菌體，前期通過全基因組測序預(yù)測到其有3 個(gè)尾部蛋白，分別是假定尾部蛋白rgp10、尾絲蛋白rgp11 及尾刺蛋白rgp13，通過對噬菌體Bp4 這3 個(gè)尾部蛋白的研究，可以明確它們在噬菌體Bp4 吸附過程中的作用[12]。

本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得可溶性表達(dá)的噬菌體尾部蛋白rgp10、rgp11 和rgp13，純化后，一方面用于尾部蛋白競爭吸附試驗(yàn)，檢測噬菌體Bp4 吸附宿主菌的關(guān)鍵蛋白；另一方面將這3 種蛋白分別免疫家兔得到各蛋白的抗血清（多克隆抗體），用于尾部蛋白抗體阻斷吸附試驗(yàn)中阻斷噬菌體尾部蛋白與細(xì)菌的吸附[14]，進(jìn)一步確定噬菌體Bp4 吸附宿主菌的關(guān)鍵蛋白。根據(jù)噬菌體Bp4 的尾部結(jié)構(gòu)及上述兩個(gè)試驗(yàn)結(jié)果可知，宿主菌的受體與尾絲蛋白rgp13結(jié)合后，阻斷了噬菌體對細(xì)菌的吸附，使噬菌體Bp4 無法與宿主菌結(jié)合；噬菌體Bp4 尾絲蛋白rgp11和尾刺蛋白rgp13 由于競爭性結(jié)合了制備的多克隆抗體（anti-gp11、anti-gp13），造成這兩種尾部蛋白無法結(jié)合細(xì)菌受體，從而阻斷了噬菌體Bp4 對宿主菌的吸附。而尾部蛋白rgp10 卻不能影響噬菌體與宿主菌的結(jié)合，anti-gp10 也不能阻斷噬菌體對宿主菌的吸附。這表明尾刺蛋白gp13 是噬菌體Bp4 關(guān)鍵的受體識別蛋白，尾絲蛋白gp11 是影響噬菌體與細(xì)菌結(jié)合的重要蛋白。綜上所述，本研究確定了該噬菌體在與細(xì)菌結(jié)合的過程中，主要是由其尾刺蛋白gp13 識別吸附細(xì)菌受體。

不同類型噬菌體的感染機(jī)制不同，如本實(shí)驗(yàn)室前期分離保存的大腸桿菌肌尾噬菌體Bp7 為T4 類噬菌體，尾絲蛋白gp38 為其長尾絲末端的吸附蛋白，在噬菌體吸附宿主中發(fā)揮關(guān)鍵作用。而本研究證實(shí)尾刺蛋白gp13 是短尾噬菌體Bp4 吸附宿主的關(guān)鍵蛋白?？梢?，Bp4 和Bp7 雖均為大腸桿菌的噬菌體，其裂解譜有交叉，但各自也有許多特異的宿主菌。解析噬菌體的主要吸附蛋白及其關(guān)鍵位點(diǎn)和功能，將有助于改造噬菌體，擴(kuò)大噬菌體的宿主譜。本研究在一定程度上彌補(bǔ)了大腸桿菌噬菌體對宿主菌裂解機(jī)制的空缺，并為噬菌體的臨床治療奠定基礎(chǔ)。