豬鏈球菌細(xì)菌素的篩選及理化特性分析

王凌利，楊 親，祝 瑤，楊文琳，曹 俊，劉思國，張萬江

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/動物細(xì)菌病創(chuàng)新團(tuán)隊，黑龍江 哈爾濱 150069）

豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）是世界范圍內(nèi)影響豬健康的重要病原菌之一，可以引起豬嚴(yán)重的感染性疾病，如腦膜炎、敗血癥和心內(nèi)膜炎等，給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前，用抗菌藥預(yù)防和治療該病是最有效的手段。然而，由于抗菌藥在畜牧業(yè)的大量和不合理使用，導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)和快速傳播。因此，有必要開發(fā)可在臨床環(huán)境中使用的新型抗菌素。細(xì)菌素是由細(xì)菌核糖體產(chǎn)生的在體內(nèi)和體外均具有抑菌活性的生物活性肽，它們在體內(nèi)經(jīng)過不同酶的加工后產(chǎn)生活性，被釋放到細(xì)胞外，對其他微生物進(jìn)行殺傷作用[2-3]。與抗生素相比，細(xì)菌素具有高效、無毒、無殘留、無耐藥性等優(yōu)點，是一種有價值的控制細(xì)菌感染的抗菌制劑，有望解決抗生素耐藥性傳播的問題和代替抗生素并在畜牧業(yè)中應(yīng)用的一類理想替代品。羊毛硫細(xì)菌素（Lantibiotics）是在革蘭陽性細(xì)菌的核糖體中合成的一類作用于細(xì)胞膜上的熱穩(wěn)定小分子抗菌肽，分子量小于5 ku，其特點是有翻譯后修飾的過程[4]。本研究利用瓊脂擴(kuò)散法篩選產(chǎn)抑菌物質(zhì)的SS，用PCR 方法進(jìn)一步檢測細(xì)菌素相關(guān)基因，并對篩選的SS 菌株的粗提取物檢測了其理化性質(zhì)，為進(jìn)一步研究SS 細(xì)菌素奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料200 株SS（包含G-9）、SS BAA、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 29213、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）T33、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）JH2-2、大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922、沙 門 氏 菌（Salmonella）SL1344、巴 氏 桿 菌（Pasteurella）284-1 均由本實驗室保存；THB 培養(yǎng)基和瓊脂購自BD 公司；MRS 培養(yǎng)基購自北京路橋技術(shù)有限公司；瑪琳乙磺酸（MES）購自上海源葉生物科技有限公司；硫酸銨購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PCR 試劑購自TaKaRa 公司；過氧化氫酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶購自上海源葉生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 引物設(shè)計與合成根據(jù)GenBank 登錄的3 個基因簇序列（KU867866.1、KU867867.1、KU867868.1）設(shè)計SS 細(xì)菌素相關(guān)基因擴(kuò)增引物，分別為sslA-F/R、suiA-F/R和sss-F/R；根據(jù)GenBank登錄號KU867868.1的基因序列，設(shè)計suicin 65 基因簇的分段擴(kuò)增引物sxj-1-F/R～sxj-8-F/R（表1）。引物均由吉林庫美生物科技有限公司合成。

表1 PCR引物序列Table 1 Primers used in this study

1.3 產(chǎn)抑菌物質(zhì)SS 的篩選采用瓊脂擴(kuò)散法篩選菌株[5]。將5 μL 200 株SS 株分別接種于THB 固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，用7 mL 含有指示菌菌液的軟瓊脂THB 固體培養(yǎng)基均勻覆蓋，37 ℃過夜培養(yǎng)。以SS BAA、金黃色葡萄球菌ATCC 29213 為指示菌，并測量對指示菌的抑菌圈直徑。

1.4 產(chǎn)抑菌物質(zhì)SS 的分型鑒定對篩選出的SS 通過CGE Server 網(wǎng)站進(jìn)行MLST 分型；根據(jù)文獻(xiàn)[6-7]設(shè)計SS 分型引物，通過PCR 方法鑒定血清型。

1.5 SS 細(xì)菌素相關(guān)基因的檢測文獻(xiàn)中已報道的SS 產(chǎn)生的細(xì)菌素suicin 主要為3 種，即suicin 90-1330（sslA）[8]、suicin 3908（suiA）[9]和suicin 65（sss）[10]，采用sslA-F/R、suiA-F/R 和sss-F/R 引物（表1），對產(chǎn)細(xì)菌素的SS 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

1.6 篩選的SS 菌株全基因組序列功能基因的分析從篩選出的可產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的SS 菌株中選擇xj-144 菌株，其基因組由金唯智生物科技有限公司進(jìn)行二代測序，利用在線軟件BAGEL4 分析細(xì)菌素潛在的經(jīng)核糖體途徑合成的和翻譯后修飾的多肽（RiPPs）的合成基因簇。

1.7 細(xì)菌素基因簇的分段擴(kuò)增及其編碼氨基酸的同源性分析以xj-144 菌株基因組為模板，利用引物sxj-1-F/R～sxj-8-F/R（表1）PCR 分段擴(kuò)增suicin 65的基因簇，PCR 產(chǎn)物由吉林庫美生物科技有限公司測序，測序結(jié)果通過軟件拼接，獲得xj-144 菌株潛在細(xì)菌素基因簇的完整序列，命名為sxj。利用NCBI Protein blast 網(wǎng)絡(luò)平臺，對比sxj 基因簇與suicin 65基因簇的同源性，對sxj 基因簇的結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行氨基酸序列比對。

1.8 細(xì)菌素的粗提及理化特性分析

1.8.1 細(xì)菌素的粗提及抑菌物質(zhì)的檢測 將xj-144單菌落接種于THB 培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接至500 mL MRS 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。高速離心后收集上清，緩慢加入硫酸銨固體粉末至終濃度為60%，4 ℃磁力攪拌器攪拌3 h～6 h后，10 000 r/min離心30 min，沉淀復(fù)溶于MES（pH5.5）溶液中透析24 h 后得到細(xì)菌素的粗提取物。以SS BAA 為指示菌，利用雙層瓊脂擴(kuò)散法測定抑菌物質(zhì)活性[11]，取15 mL THB 固體培養(yǎng)基倒入平板中，冷卻凝固后，均勻放置牛津杯，利用15 mL 含有指示菌菌液的軟瓊脂THB 固體培養(yǎng)基均勻覆蓋，冷卻凝固后將牛津杯取出，取150 μL 的粗提取物放入孔中，37 ℃過夜培養(yǎng)。

1.8.2 細(xì)菌素酸排除試驗 為排除有機(jī)酸對粗提取物抑菌活性的干擾，將粗提取液pH 調(diào)至7.0，并用乙酸調(diào)節(jié)MRS 培養(yǎng)基的pH 值為5.5 作為對照，然后利用雙層瓊脂擴(kuò)散法檢測細(xì)菌素粗提物的抑菌活性。

1.8.3 細(xì)菌素的過氧化氫排除試驗 為排除過氧化氫對粗提取物抑菌活性的干擾，將粗提取液的pH 值調(diào)至7.0，加入終濃度為500 μg/mL 的過氧化氫酶，37 ℃孵育1 h 后65 ℃5 min 使酶失活，利用雙層瓊脂擴(kuò)散法檢測細(xì)菌素粗提物的抑菌活性。

1.8.4 蛋白酶穩(wěn)定性的檢測 為檢測粗提取液對酶的敏感性，將粗提取液的pH 值調(diào)至7.0，按照終濃度500 μg/mL 分別加入胰蛋白酶、胃蛋白酶，蛋白酶K，37 ℃孵育1 h 后65 ℃5 min 使酶失活，利用雙層瓊脂擴(kuò)散法檢測細(xì)菌素粗提物的抑菌活性。

1.8.5 酸堿耐受性的檢測 取10 mL 粗提取物，利用HCl 和NaOH 調(diào)節(jié)粗提取液的pH 分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 和12 后，利用雙層瓊脂擴(kuò)散法檢測抑菌活性并測量抑菌圈直徑。

1.8.6 耐熱性的檢測 取少量粗提取物，在45 ℃、70 ℃、100 ℃和121 ℃下處理15 min，另外分別在4 ℃和室溫放置1 周后，利用雙層瓊脂擴(kuò)散法檢測抑菌活性并測量抑菌圈直徑。

1.9 細(xì)菌素抑菌譜的測定以部分革蘭陽性菌：SS G-9、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、無乳鏈球菌、糞腸球菌；部分革蘭陰性菌：大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌為指示菌，利用雙層瓊脂擴(kuò)散法檢測細(xì)菌素粗提物對上述各菌的抑菌活性，確定細(xì)菌素的抑菌譜。

2 結(jié) 果

2.1 產(chǎn)抑菌物質(zhì)SS 的篩選結(jié)果200 株SS 經(jīng)瓊脂擴(kuò)散試驗，結(jié)果顯示共篩選出了21 株對SS2 BAA 和金黃色葡萄球菌ATCC 29213 均具有明顯抑菌作用的菌株，對2 種指示菌的抑菌圈直徑見圖1。表明這21株SS 可以產(chǎn)生某種對SS2 BAA 和金黃色葡萄球菌有明顯抑菌作用的物質(zhì)。

圖1 21株SS對BAA（A）及對ATCC 29213（B）抑菌圈直徑的統(tǒng)計Fig.1 The inhibition zone diameters of 21 SS strains to BAA(A)and ATCC 29213(B)

2.2 產(chǎn)抑菌物質(zhì)SS 的分型試驗結(jié)果對篩選出的21 株SS 通 過CGE Server 網(wǎng)站進(jìn)行MLST 分型，通過PCR方法進(jìn)行血清學(xué)分型，結(jié)果顯示21株產(chǎn)抑菌物質(zhì)的SS 分布于多個ST 型和血清型：ST 型ST28 為8 株，ST308 為1 株，ST485 為2 株，ST941 為1 株，ST1259為3株，ST1263為4株，ST1265為1株；血清型4型2株，NCL-7型5株，8型1株，9型8株，12型1株，30型2株，未分型2株（表2）。表明產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的SS分布于多個血清型。

表2 21株產(chǎn)抑菌物質(zhì)SS的血清型Table 2 Serotypes of 21 SS strains producing bacteriostatic substances

2.3 SS 細(xì)菌素相關(guān)基因檢測結(jié)果以篩選出的21株產(chǎn)抑菌物質(zhì)SS 的基因組為模板，用引物sslA-F/R、suiA-F/R 和sss-F/R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示21株SS 中，菌株xj-144 攜帶sss基因，菌株38-3 攜帶suiA基因，其余菌株并未檢測出SS 細(xì)菌素相關(guān)基因（圖2）。表明菌株xj-144 和38-3 產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)與SS 細(xì)菌素相關(guān)。

圖2 xj-144（A）和38-3（B）菌株細(xì)菌素相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of bacteriocin-related genes in xj-144(A)and 38-3(B)strains

2.4 篩選的SS 全基因組序列功能基因分析結(jié)果菌株xj-144 與38-3 攜帶了與SS 細(xì)菌素相關(guān)的基因，由2.1 結(jié)果可知，菌株xj-144 比菌株38-3 的抑菌效果好，因此選用菌株xj-144 進(jìn)行后續(xù)試驗。菌株xj-144 經(jīng)金唯智公司二代測序，并通過在線軟件BAGEL4 對菌株xj-144 的全基因組序列功能基因分析可能產(chǎn)生的細(xì)菌素或RiPPs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株xj-144 的代謝產(chǎn)物中潛在的熱點區(qū)域（Areas of interest，AOI）僅有一個（圖3A），且xj-144 共有3 個核心肽（Core peptide），其編碼的氨基酸序列分別與suicin 65 基因簇中的sssA、sssA'、sssA1編碼的氨基酸序列相同（圖3B）。表明菌株xj-144 中僅有1 個與suicin 65 核心肽相同的細(xì)菌素，并沒有其他潛在細(xì)菌素的存在。

圖3 xj-144全基因組序列功能基因分析結(jié)果Fig.3 Results of functional gene analysis results of xj-144 whole genome sequence

2.5 xj-144 菌株基因簇功能分析結(jié)果以xj-144 菌株的基因組為模板，利用sxj-1-F/R～sxj-8-F/R引物分段擴(kuò)增，得到了菌株xj-144 完整的基因簇（圖4A）。利用NCBI 比對，結(jié)果顯示菌株xj-144 基因簇與suicin 65 的同源性為99.4%。xj-144 菌株潛在的細(xì)菌素相關(guān)基因簇（sxj）長11 000 bp，包含10 個ORFs。該基因簇編碼了細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)基因（sxjA、sxjA'、sxjA1）（圖4B），氨基酸比對結(jié)果顯示sxjA 與sxjA'的相似性為92.16%，與sxjA1 的相似性為51.06%；此外還有參與修飾的合成酶（sxjM）、ABC 轉(zhuǎn)運蛋白（sxjT）、反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白（sxjR）、雙組份調(diào)控蛋白（sxj-R、sxjK）和3 種免疫蛋白（sxjE、sxjF、sxjG）。該結(jié)果表明xj-144 與suicin 65 有相同的基因簇，屬于suicin 家族，其基因的10 個ORFs 共同參與了細(xì)菌素的合成、免疫和調(diào)節(jié)過程。

圖4 sxj基因簇功能分析Fig.4 Functional analysis of sxj gene cluster

2.6 細(xì)菌素粗提取液的理化特性分析結(jié)果利用硫酸銨沉淀的方法得到粗提取液，經(jīng)過不同的方式處理后利用雙層瓊脂擴(kuò)散法檢測其抑菌活性，對指示菌BAA 的抑菌結(jié)果顯示：經(jīng)乙酸調(diào)節(jié)為pH7.0 后的粗提液對BAA 仍有抑菌效果，而pH5.5 的培養(yǎng)液對照沒有抑菌圈產(chǎn)生；經(jīng)過氧化氫酶處理后的粗提取液對BAA 仍然有抑菌作用，可以排除有機(jī)酸和過氧化氫對細(xì)菌素抑菌作用的影響（圖5A）。粗提取液經(jīng)蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶處理后，依然有抑菌活性，表明細(xì)菌素對蛋白酶有穩(wěn)定性（圖5B）；經(jīng)不同pH處理后，粗提取液仍保持抑菌活性（圖5C），表明細(xì)菌素有較強(qiáng)的酸堿耐受性；經(jīng)不同溫度處理后，粗提取液保持抑菌活性（圖5D），表明細(xì)菌素有一定的耐熱性。

圖5 xj-144菌株細(xì)菌素的理化特性分析Fig.5 Analysis of physical and chemical properties of bacteriocin produced by strain xj-144

2.7 細(xì)菌素抑菌活性譜的測定結(jié)果利用不同的革蘭陽性菌和革蘭陰性菌作為指示菌，檢測菌株xj-144 粗提取液的抑菌活性譜（表3）。結(jié)果顯示，其產(chǎn)生的細(xì)菌素不僅對豬鏈球菌，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、無乳鏈球菌等革蘭陽性菌有抑菌作用，對革蘭陰性菌巴氏桿菌也有抑制作用。表明菌株xj-144 產(chǎn)生的細(xì)菌素抑菌譜廣泛。

表3 細(xì)菌素的抑菌活性譜Table 3 Antibacterial activity spectrum of bacteriocin produced by strain xj-144

3 討 論

隨著耐抗生素細(xì)菌的出現(xiàn)，研發(fā)新的抗菌藥物日益受到人們的廣泛關(guān)注。細(xì)菌素是一種經(jīng)核糖體合成的細(xì)菌源抗菌肽，是治療細(xì)菌感染性疾病的一種有希望的替代藥物。細(xì)菌素具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，并且對強(qiáng)酸強(qiáng)堿、表面活性劑和高鹽等環(huán)境因子具有較強(qiáng)的耐受力；這些特性使該細(xì)菌素具有潛在的廣闊應(yīng)用前景。在不同類型的羊毛硫細(xì)菌素中，乳酸鏈球菌肽是報道最多、研究最深入的細(xì)菌素，目前已經(jīng)有60 多個國家和地區(qū)使用乳鏈菌肽作為防腐劑，已有報道證實乳鏈菌肽可以抑制耐甲氧芐啶的金黃色葡萄球菌等細(xì)菌的生長[12]。Melancon 和Grenier 首先報道了SS 分離株可以產(chǎn)生與有機(jī)酸和過氧化氫無關(guān)的抑制物質(zhì)，并表現(xiàn)出與羊毛硫細(xì)菌素相關(guān)的特性[13]。根據(jù)報道，從2 型SS 的ST25 和ST28中發(fā)現(xiàn)了3 種不同的羊毛硫細(xì)菌素，suicin 90-1330（sslA）是由ST28 非毒性SS 分離的AI 型羊毛硫細(xì)菌素；suicin 3908（suiA）是2 型SS 產(chǎn)生的一種AII 型羊毛硫細(xì)菌素；suicin 65（sss）是由ST28 非毒性SS 產(chǎn)生的第二種AII 型羊毛硫細(xì)菌素。

在本研究中，篩選了近年來從不同地區(qū)健康豬肺臟樣品中分離純化的200 株SS，獲得21 株可產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的菌株，其代謝產(chǎn)物有明顯的抑菌活性，其中攜帶細(xì)菌素相關(guān)基因的占比約為9.52%，PCR 鑒定出了菌株38-3 和xj-144 分別攜帶suiA和sss細(xì)菌素相關(guān)基因，沒有擴(kuò)增到sslA基因，38-3 和xj-144 為4型SS，說明不僅2 型SS 可以產(chǎn)生suicin，其他血清型也會產(chǎn)生。其他菌株并未鑒定出來與SS 細(xì)菌素相關(guān)基因，可能存在未知的與抑菌作用相關(guān)的基因或物質(zhì)。使用在線軟件BAGEL4 檢索菌株xj-144 全基因組中細(xì)菌素潛在的經(jīng)核糖體途徑合成的和翻譯后修飾的多肽（RiPPs）的合成基因簇，顯示其僅有一個潛在的AOI，與suicin 65 的核心肽相同，并沒有其他細(xì)菌素。與細(xì)菌素合成相關(guān)的基因通常以基因簇的形式出現(xiàn)，包含了結(jié)構(gòu)基因、免疫基因和修飾酶以及運輸酶的相關(guān)基因，每個ORF 均起到不同的作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，菌株xj-144 的粗提取物在排除有機(jī)酸和過氧化氫潛在影響因素后，其仍具有耐高溫、酸堿耐受性和蛋白酶穩(wěn)定性，符合細(xì)菌素的穩(wěn)定特性，這個特性使其可以更好的應(yīng)用于臨床抗感染的治療和作為飼料添加劑。羊毛硫細(xì)菌素被認(rèn)為普遍對革蘭陽性菌有抑菌作用，菌株xj-144產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對許多革蘭陽性菌具有明顯的抑菌效果，同時對革蘭陰性菌巴氏桿菌也有抑菌作用，這對獲得新型且較廣譜的代替抗生素的抑菌物質(zhì)十分重要，但不排除菌株中還有未知的物質(zhì)在起作用。

篩選出產(chǎn)生細(xì)菌素的菌株對控制SS 和其他細(xì)菌病具有重要作用，可減少養(yǎng)豬業(yè)中抗生素的使用，從而解決抗生素耐藥性的傳播問題，該策略為以后使用細(xì)菌素代替抗生素奠定了基礎(chǔ)。