非洲豬瘟暴發(fā)前后我國豬繁殖與呼吸綜合征病毒的流行變化

趙 靜，李 超，許 滸，相麗潤，湯艷東，孟凡丹，付 軍，龔幫俊，陳家锃，冷超糧，彭金美，王 倩，周國輝，安同慶，童光志，蔡雪輝，張洪亮*，田志軍*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150069；2.南陽師范學(xué)院，河南 南陽 473061；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；4.天津渤海農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)聯(lián)合研究院有限公司，天津 300308）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是引起PRRS的主要病原，為單股正鏈RNA 病毒，基因組全長約15 000 nt，至少包含11 個開放閱讀框（Open reading frame，ORF），編碼至少16 種非結(jié)構(gòu)蛋白，分別是Nsp1α、Nsp1β、Nsp2、Nsp2N、Nsp2TF、Nsp3～Nsp6、Nsp7α、Nsp7β、以及Nsp8～Nsp12。8 種結(jié)構(gòu)蛋白分別是GP2a、E、GP3、GP4、GP5、ORF5a、M 和N。PRRSV 屬于套式病毒目，動脈炎病毒科，動脈炎病毒β 屬，分為2 個基因型，分別為基因1 型，屬于歐洲型動脈炎病毒亞屬；基因2 型，屬于美洲型動脈炎病毒亞屬。根據(jù)ORF5 基因，基因1 型PRRSV（Type 1 PRRSV）又分為3 個基因亞型，分別是I、II、III 基因亞型；基因2 型PRRSV 又分為9 個基因亞型，分別是1～9 基因亞型[1-3]。

2006 年中國暴發(fā)由高致病性PRRSV（HPPRRSV）引起的高致病性PRRS（HP-PRRS），該類病毒在nsp2 基因中存在30（1+29）個氨基酸的不連續(xù)缺失，致病性強(qiáng)，很快成為我國的主要流行株。同年，我國首次分離到了Type 1 PRRSV，然而，該類病毒只是散發(fā)，并未流行，2016 年首次報道Type 1 PRRSV 出現(xiàn)重組現(xiàn)象[4]。2012 年，我國報道了與NADC30 同源性較高的PRRSV，稱為NADC30-like PRRSV，該類病毒在nsp2 基因中存在131（111+19+1）個氨基酸的不連續(xù)缺失，且該類病毒與HP-PRRSV之間基因組序列同源性低、重組頻繁，致病性差異較大，自2016 年該病毒已超過HP-PRRSV 成為我國當(dāng)前主要的流行株[5]。2015 年，我國大陸報道出現(xiàn)QYYZ-like PRRSV，該類病毒在nsp2 基因中存在36個氨基酸的連續(xù)插入。根據(jù)ORF5 基因分類，大陸出現(xiàn)的QYYZ-like PRRSV 均屬于sublineage 3.5，并源于中國臺灣的sublineage 3.2 PRRSV[6]。2018 年，我國報道出現(xiàn)NADC34-like PRRSV，該類病毒在nsp2 基因中存在100 個氨基酸的連續(xù)缺失，對仔豬的致病性較低，是一種潛在流行株[7]。目前，我國的PRRSV呈現(xiàn)多基因亞型并存的復(fù)雜局面。

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由ASF 病毒（ASFV）引起的一種急性、高熱和高度接觸性傳染病，該病是世界衛(wèi)生組織（OIE）6 種法定報告的動物疫病之一，在我國也屬于一類動物疫病[8]。雖然存在自然缺失或基因修飾的ASF 實(shí)驗疫苗，但目前并無高免疫原性和完全保護(hù)效果的商品化疫苗。自2018年8 月遼寧沈陽發(fā)生首起ASF 疫情以來，據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公示，截至2020 年7 月30 日，全國共有28 個省份發(fā)生ASF 疫情160 余起（含2 起野豬疫情），累計撲殺生豬120 萬余頭[9]。中國是生豬產(chǎn)業(yè)大國，生豬貿(mào)易占據(jù)世界貿(mào)易量的50%。突然暴發(fā)的ASF 疫情使得我國生豬的養(yǎng)殖、屠宰、經(jīng)營和運(yùn)輸狀況均發(fā)生了較大改變，對非ASF 的其他豬病的流行也造成了一定影響，為了探究ASF 疫情對PRRSV 流行的影響，本研究檢測并統(tǒng)計分析了ASF疫情暴發(fā)前后我國大部分地區(qū)（華北、華東、中南及東北）4年間（2017年～2020 年）PRRSV 的流行病學(xué)變化，為我國PRRSV 的深入研究和PRRS 防控提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來源及主要試劑1 374份疑似PRRSV感染的病料樣品（肺或血液）采自全國18 個省、市和自治區(qū)（黑龍江省、內(nèi)蒙古自治區(qū)、吉林省、遼寧省、河北省、山西省、山東省、河南省、浙江省、江蘇省、廣東省、安徽省、湖北省、四川省、江西省、新疆自治區(qū)、天津市、北京市）各養(yǎng)豬場；大腸桿菌TGI 感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗室制備[10]。RNA 提取試劑盒購自Tiangen 公司；M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、LATaqDNA 聚 合 酶 和pMD18-T 載 體 等 購 自TaKaRa 公司；Gel Extraction Kit 購自O(shè)MEGA 公司。

1.2 引物的設(shè)計與合成根據(jù)GenBank 中的PRRSV BJEU06-1（GU047344）、HuN4（EF635006）、NADC30（JN654459）、ATCC VR-2332（AY150564）、QYYZ（JQ-308798）和IA/2014/NADC34（MF326985）株全基因組序列，參照文獻(xiàn)[11]由庫美生物有限公司合成檢測PRRSV ORF5 基因與nsp2 基因的兩對引物（表1）。

表1 PRRSV的檢測引物Table 1 Detective primers of PRRSV

1.3 病料樣品ORF5 與nsp2 基因的PCR 擴(kuò)增及測序?qū)⒉×蠘悠方?jīng)組織研磨儀研磨后，8 000 r/min離心，分別取上清液和血清，利用RNA 提取試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 作為模板。分別利用表1 中2 對檢測引物經(jīng)PCR 擴(kuò)增。并對擴(kuò)增陽性樣品的nsp2 和ORF5 基因回收純化后與pMD18-T 載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒并經(jīng)PCR 鑒定，陽性菌液由庫美生物有限公司測序。并根據(jù)nsp2 和ORF5 基因測序結(jié)果統(tǒng)計分析陽性樣品的檢出率及不同地區(qū)在ASF暴發(fā)前后PRRSV 陽性檢出率的變化趨勢。

1.4 ASF 暴發(fā)前后我國各亞型及各地區(qū)PPRSV 流行變化趨勢的統(tǒng)計分析根據(jù)陽性病料樣品的來源地區(qū)和PRRSV 各亞型，利用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計分析并繪圖，分析ASF 暴發(fā)前后我國各亞型及各地區(qū)PPRSV 的流行變化趨勢。

1.5 PRRSV ORF5 基因遺傳進(jìn)化及nsp2 基因推導(dǎo)氨基酸序列缺失特征的分析上述經(jīng)PCR 擴(kuò)增的基因分別利用MegAlign 和Seqman 拼接后獲得ORF5 及nsp2 基因序列。利用DNAStar 和Mega 7.0 軟件對測序所得的ORF5 基因序列與GenBank 中參考株的ORF5基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析其遺傳變異情況；利用MegAlign 將測序所得的nsp2 基因推導(dǎo)的氨基酸序列與參考株的相應(yīng)氨基酸序列比對并分析其的缺失特征。

2 結(jié) 果

2.1 PRRSV 的PCR 檢測及目的基因測序結(jié)果對2017 年1 月～2020 年12 月采集的1 374 份疑似PRRSV感染的病料樣品進(jìn)行PCR 檢測并統(tǒng)計。結(jié)果顯示，共檢出PRRSV 陽性病料樣品779 份，其中ASF 暴發(fā)前397 份，ASF 暴發(fā)后382 份。對所有陽性樣品擴(kuò)增的ORF5 和nsp2 基因測序并根據(jù)測序結(jié)果對樣品統(tǒng)計分析后的結(jié)果顯示，ASF 暴發(fā)后（2019 年～2020年），我國華北地區(qū)PRRSV陽性率由ASF暴發(fā)前（2017年～2018 年）的60.47%升至66.33%；東北地區(qū)PRRSV陽性率由ASF暴發(fā)前的52.76%升至53.27%；華東地區(qū)PRRSV 陽性率由ASF 暴發(fā)前的60.93%升至62.59%；中南地區(qū)PRRSV 陽性率由ASF 暴發(fā)前的53.43%升至57.50%（表2）。表明我國華北地區(qū)、東北地區(qū)、華東地區(qū)PRRSV 陽性率在ASF 疫情暴發(fā)后均有上升。

表2 我國部分地區(qū)在ASF暴發(fā)前后的PRRSV檢測陽性率Table 2 The positive rate of PRRSV in the different regions of China before or after the outbreak of ASF

2.2 ASF 暴發(fā)前后我國各亞型及各地區(qū)PPRSV 的流行變化趨勢對ASF 暴發(fā)前檢測的397 株P(guān)RRSV和ASF 暴發(fā)后檢測的382 株P(guān)RRSV 的來源地區(qū)及其ORF5 及nsp2 基因經(jīng)GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計并分析。結(jié)果顯示：ASF 暴發(fā)前，HP-PRRSV、NADC30-like PRRSV、NADC34-like PRRSV、VR2332-like PRRSV、QYYZ-like PRRSV、Type 1 PRRSV 的檢出率分別為34.01%（135/397）、47.36%（188/397）、1.76%（7/397）、6.80%（27/397）、7.30%（29/397）、2.77%（11/397）；ASF暴發(fā)后HP-PRRSV、NADC30-like PRRSV、NADC34-like PRRSV、VR2332-like PRRSV、QYYZ-like PRRSV、CH-1a like PRRSV、Type 1 PRRSV 的檢出率分別為20.68%（79/382）、65.97%（252/382）、5.50%（21/382）、3.40%（13/382）、0.52%（2/382）、1.31%（5/382）、2.62%（10/382）（圖1）。結(jié)果表明，ASF 暴發(fā)后，NADC30-like PRRSV 作為主要流行株，其檢出率明顯升高，HP-PRRSV、VR2332-like PRRSV 和QYYZ-like PRRSV檢出率降低。NADC34-like PRRSV 在ASF 暴發(fā)后檢出率明顯上升。 ASF 對PRRSV 各亞型流行情況的影響不同，對國內(nèi)主要流行的NADC30-like PRRSV、HP-PRRSV 和NADC34-like PRRSV 的影響較大，而對VR2332-like PRRSV、QYYZ-like PRRSV、CH-1a like PRRSV和Type 1 PRRSV的影響較小。

分析我國各地區(qū)各亞型PPRSV 的流行變化趨勢結(jié)果顯示：ASF 暴發(fā)前，我國華北地區(qū)（北京、天津、河北、山西、內(nèi)蒙古）NADC30-like PRRSV 檢出率為55.77%（29/52），HP-PRRSV 檢出率為36.54%（19/52），VR2332-like PRRSV、QYYZ-like PRRSV 和Type 1 PRRSV 也有少量檢出，未檢出NADC34-like PRRSV 和CH-1a like PRRSV；東北地區(qū)（遼寧、吉林、黑龍江）NADC30-like PRRSV 檢出率為44.76%（47/105），HP-PRRSV 檢出率為33.33%（35/105），并檢測到NADC34-like PRRSV、VR2332-like PRRSV、QYYZ-like PRRSV 和Type 1 PRRSV，未檢出CH-1a like PRRSV；華東地區(qū)（江蘇、浙江、安徽、江西、山東）NADC30-like PRRSV檢出率為52.17%（48/92），HPPRRSV檢出率為28.26%（26/92），還檢出少量VR2332-like PRRSV、QYYZ-like PRRSV 和Type 1 PRRSV，未檢出NADC34-like PRRSV 和CH-1a like PRRSV；中南地區(qū)（河南、湖北、湖南、廣東、廣西）NADC30-like PRRSV 檢出率為43.24%（64/148），HP-PRRSV 檢出率為37.16%（55/148），還檢測到少量NADC34-like PRRSV、VR2332-like PRRSV、QYYZ-like PRRSV 和Type 1 PRRSV，未檢出CH-1a like PRRSV（圖1）。

圖1 ASF暴發(fā)前后我國PRRSV各亞型檢出率的變化Fig.1 The changes of detection rates and subtypes of PRRSV before and after ASF outbreak in China

ASF 暴發(fā)后，我國華北地區(qū)NADC30-like PRRSV檢出率為56.92%（37/65），HP-PRRSV 檢出率為16.92%（11/65），NADC34-like PRRSV 檢出率為15.38%（10/65），檢出少量CH-1a like PRRSV 和Type 1 PRRSV，未檢出VR2332-like PRRSV 和QYYZ-like PRRSV；東北地區(qū)NADC30-like PRRSV 檢出率為66.48%（119/179），HP-PRRSV 檢出率為19.55%（35/179），檢出少量NADC34-like PRRSV、VR2332-like PRRSV、CH-1a like PRRSV 和Type 1 PRRSV，未檢出QYYZ-like PRRSV；華東地區(qū)NADC30-like PRRSV 檢出率為65.22%（60/92），HP-PRRSV 檢出率為28.26%（26/92），檢出少量NADC34-like PRRSV、VR2332-like PRRSV和Type 1 PRRSV，未檢出QYYZ-like PRRSV 和CH-1a like PRRSV；中南地區(qū)NADC30-like PRRSV 檢出率為78.26%（36/46），HP-PRRRSV 檢出率為15.22%（7/46），檢出少量VR2332-like PRRSV 和QYYZ-like PRRSV，未檢出NADC34-like PRRSV、Type 1 PRRSV和CH-1a like PRRSV（圖2）。上述結(jié)果表明，ASF暴發(fā)后，我國大部分地區(qū)（華北、東北、華東、中南）的NADC30-like PRRSV流行趨勢有所上升。與此同時，我國大部分地區(qū)HPPRRSV 的檢出率明顯下降。并且隨著ASF 的流行，除中南地區(qū)外，我國各地NADC34-like PRRSV 檢出率明顯上升。

圖2 ASF暴發(fā)前后國內(nèi)各地區(qū)各亞型PRRSV檢出率的變化Fig.2 The detection rates of different lineages of PRRSV before and after ASF outbreak in different regions of China

2.3 ASF暴發(fā)前后PRRSV基于ORF5基因的PRRSV遺傳演化分析分別選擇ASF暴發(fā)前后各51個和43個ORF5 基因序列與各亞型PRRSV 代表株相應(yīng)基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，ASF 暴發(fā)前共檢測到6種亞型的PRRSV，分別是NADC30-like PRRSV、HPPRRSV、NADC34-like PRRSV、VR2332-like PRRSV、QYYZ-like PRRSV、Type I PRRSV（圖3A）；ASF暴發(fā)后除以上6 種亞型的PRRSV 外，還檢測到了CH-1a like PRRSV（圖3B）。表明ASF暴發(fā)后我國PRRSV亞型分類變得更加多元化。

圖3 2017年～2018年（A）及2019年～2020年（B）分別基于ORF5基因序列的PRRSV的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic trees based on PRRSV ORF5 gene from during 2017 to 2018(A)and 2019 to 2020(B)

2.4 ASF 暴發(fā)前后PRRSV nsp2 基因推導(dǎo)的氨基酸序列位點(diǎn)的分析分別選擇ASF 暴發(fā)前后各12 個nsp2 基因與參考株nsp2 基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行了比對分析。結(jié)果顯示，與參考株相比，ASF 暴發(fā)前后，PRRSV 的缺失特征并未發(fā)生變化：NADC30-like PRRSV 仍具有131（111+1+19）個氨基酸缺失特征，HP-PRRSV 仍具有30（1+29）個氨基酸缺失特征，NADC34-like PRRSV 仍具有100 個連續(xù)氨基酸缺失特征（圖4）。結(jié)果表明，ASF 暴發(fā)前后各亞型PRRSV 的缺失特征均一致。

圖4 ASF暴發(fā)前（A）及ASF暴發(fā)后（B）nsp2基因推導(dǎo)的氨基酸序列比對結(jié)果Fig.4 Alignments results of the deduced amino acid sequence of nsp2 genes before(A)and after(B)the outbreak of ASF

3 討 論

自2018 年8 月在遼寧沈陽報道第一起ASF 疫情后，為了控制疫情，國家出臺了一些緊急應(yīng)對措施，包括疫情響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)、疫點(diǎn)的劃定與處置、撲殺及無害化處理標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)疫情后的緊急流行病學(xué)調(diào)查，以及養(yǎng)殖場（戶）、屠宰場及其他環(huán)節(jié)監(jiān)測為ASF 陽性的處理方法等，致國內(nèi)外生豬的流通情況發(fā)生了改變。

PRRSV 的檢測以及測序結(jié)果表明，ASF 暴發(fā)后，國內(nèi)華東、東北、華北及中南地區(qū)PRRSV 的陽性率均有明顯上升。在防控ASF 的同時，為避免應(yīng)激反應(yīng)，許多豬場停止使用了一些豬病病毒疫苗，其中就包括PRRSV 相關(guān)疫苗。正常情況下使用PRRSV 疫苗可以對豬提供有效保護(hù)，而在ASF暴發(fā)后，PRRSV疫苗的停用導(dǎo)致我國各地PRRSV 檢測陽性率的上升，表明疫苗在豬病防控中的重要作用。在ASF 疫情暴發(fā)后，我國PRRSV 檢測陽性率的上升反映了許多豬場為預(yù)防和清除ASF 而忽視或放棄對其他豬病的防控，反而使得豬場內(nèi)原本已經(jīng)得到一定控制的傳染病再次開始流行，這些情況也表明了建立豬病綜合防控體系的重要性。

對ASF 暴發(fā)前后（2017 年～2020 年）PRRSV 的遺傳演化分析結(jié)果顯示，我國PRRSV 亞型Nsp 氨基酸的缺失特征均一致，但在ASF 暴發(fā)后我國PRRSV 流行情況更加多元化，檢測到了更多亞型的PRRSV。國內(nèi)的NADC30-like PRRSV 在ASF 疫情之前形成了獨(dú)立分支，但在ASF 暴發(fā)后，其并未形成具有優(yōu)勢的獨(dú)立分支。表明ASF 疫情發(fā)生后NADC30-like PRRSV 的遺傳演化變得更加復(fù)雜。生豬大量的撲殺直接導(dǎo)致了能繁種豬流通數(shù)量的減少，為促進(jìn)產(chǎn)能的回升，全國各地養(yǎng)殖場開始使用三元、四元甚至來源更復(fù)雜的雜交品種做種豬，使得疾病的流行情況更加復(fù)雜，也造成了ASF 暴發(fā)后PRRSV 亞型的增加，對我國PRRS 防控帶來了更嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

ASF 暴發(fā)后，NADC30-like PRRSV 作為主要流行株，其檢出率有顯著增長。這種趨勢在中南地區(qū)表現(xiàn)得更加明顯。由于無針對NADC30-like PRRSV 的疫苗，加之頻繁發(fā)生的重組事件也給NADC30-like PRRSV 的檢測和其感染的防控造成了困難[12]。NADC34-like PRRSV 是近年來才被報道的病毒，最初報道于美國，后傳播至中國，該類病毒株大多存在重組，但尚未發(fā)現(xiàn)其與國內(nèi)HP-PRRSV 和CH-1a like PRRSV 的重組[13-14]，之前有報道稱其可能是潛在的流行株[7]。根據(jù)本研究的分析統(tǒng)計結(jié)果，在此次ASF 疫情暴發(fā)后，NADC34-like PRRSV 的檢出率上升。因此，從業(yè)人員應(yīng)加大對該亞型PRRSV流行情況的監(jiān)控，對其的鑒別診斷試劑盒和疫苗做儲備性研究，并開發(fā)應(yīng)對的防控措施。隨著ASF疫情對生豬流通的影響，表明ASF 暴發(fā)前后VR2332-like PRRSV、QYYZ-like PRRSV、CH-1a like PRRSV 和Type 1 PRRSV在不同地區(qū)檢出率的變化表明這些亞型PRRSV 的流行仍具有地域性，應(yīng)加強(qiáng)區(qū)域內(nèi)動物疫病監(jiān)測、動物衛(wèi)生監(jiān)督、優(yōu)化流通控制模式。

本研究通過檢測并統(tǒng)計分析了ASF 暴發(fā)前后國內(nèi)PRRSV 的流行變化，表明ASF 暴發(fā)后國內(nèi)大部分地區(qū)PRRSV 的流行更加嚴(yán)重，流行亞型更加多元；國內(nèi)NADC30-like PRRSV 的檢出率大幅度上升，HP-PRRSV 的檢出率大幅降低，NADC34-like PRRSV流行有上升趨勢。本研究分析了ASF 疫情對我國PRRSV 流行變化的影響及目前國內(nèi)PRRSV 的流行現(xiàn)狀，為我國PRRS 的防控提供了數(shù)據(jù)支持。