低溫好氧反硝化菌的選育以及脫氮性能

姚甜甜， 董紅紅， 周小峰

(深圳市長(zhǎng)隆科技有限公司 邁葳生物事業(yè)部，廣州 深圳 518116)

總氮是污水排放的一個(gè)重要指標(biāo)，如何去除污水中的總氮使出水總氮達(dá)標(biāo)是目前亟待解決的主要問(wèn)題.傳統(tǒng)的生物脫氮技術(shù)去除水體中氨氮的原理是在好氧條件下把氨氮轉(zhuǎn)化成硝酸鹽氮即硝化作用，在厭氧或缺氧條件下把硝酸鹽氮最終轉(zhuǎn)化成氮?dú)饧捶聪趸饔?由于傳統(tǒng)的硝化菌和反硝化菌的生長(zhǎng)條件不同，使得硝化和反硝化作用不能在同一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行[1-3].這不僅增加了基建投資費(fèi)用，還增加了運(yùn)行成本.好氧反硝化菌的發(fā)現(xiàn)使硝化和反硝化作用同時(shí)進(jìn)行成為了可能，解決了傳統(tǒng)生物脫氮好氧和厭氧嚴(yán)格分離的問(wèn)題，進(jìn)一步簡(jiǎn)化了工藝和操作[4].1984年Robertson等[5]從除硫系統(tǒng)的出水中第一次分離出好氧反硝化菌，好氧反硝化現(xiàn)象由此被揭開(kāi).隨著對(duì)好氧反硝化菌的進(jìn)一步研究，目前已經(jīng)有20多個(gè)屬的好氧反硝化菌株被分離出來(lái)[6].

在中國(guó)北方，冬季水溫通常低于10 ℃.低溫會(huì)抑制酶的活性，減緩微生物的生長(zhǎng)，導(dǎo)致反硝化作用明顯減弱[7].因此，在冬季時(shí)溫度會(huì)成為污水生化處理系統(tǒng)的脫氮效果的限制因素.近年來(lái)，由于在強(qiáng)堿、強(qiáng)酸、低溫等極端條件下異養(yǎng)反硝化菌不具有良好的適應(yīng)能力和脫氮效果而倍受關(guān)注[8-9].因此，篩選耐低溫好氧反硝化菌株是提高低溫條件下生物脫氮效率的根本途徑.

本文中，筆者通過(guò)定向馴化從某污水處理廠(chǎng)的活性污泥，從中篩選出耐低溫好氧反硝化菌IL-2，對(duì)菌株進(jìn)行基本的生理生化和部分長(zhǎng)度16S rDNA鑒定，考察了不同因素對(duì)IL-2菌反硝化效率的影響.

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

所用污泥來(lái)自某污水處理廠(chǎng)CASS處理工藝反應(yīng)池出口活性污泥.

1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，pH優(yōu)選為7.2～7.6.

LB營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：酵母粉5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH為7.2～7.6.

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：乙酸鈉2 g/L，硝酸鉀1.0 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，七水合硫酸亞鐵0.05 g/L，氯化鈣1 g/L，七水合硫酸鎂1.0 g/L，pH為7.2～7.6.

1.3 菌株富集馴化

將10 g的活性污泥接種至150 mg/L硝態(tài)氮和裝有100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的錐形瓶中，在溶解氧約為3.0 mg/L、溫度20 ℃的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)3 d，得到第1菌液；吸取10 mL第1菌液轉(zhuǎn)接至150 mg/L硝態(tài)氮、裝有100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的錐形瓶中，在溶解氧約為3.0 mg/L，16 ℃的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)3 d，得到第2菌液；以此類(lèi)推，3 d一輪，每一輪溫度降低4 ℃直至溫度降低到4 ℃，該過(guò)程是對(duì)菌的低溫馴化.馴化過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)曝氣泵控制溶解氧的濃度，通過(guò)設(shè)置恒溫?fù)u床的溫度控制溫度.

1.4 菌株的純化分離

吸取2 mL馴化后的最終菌液，采用涂布平板法用LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行分離，在4 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，獲得單菌落;挑選單菌落用平板劃線(xiàn)法把不同形態(tài)的菌接種至不同的LB固體平板培養(yǎng)基上，對(duì)單菌落進(jìn)行3次劃線(xiàn)培養(yǎng)，對(duì)其進(jìn)行純化.

1.5 菌株的鑒定

根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌手冊(cè)》對(duì)篩選出的IL-2菌的表觀形貌進(jìn)行觀察，并對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色，染色之后用油鏡對(duì)該菌株進(jìn)行微觀形態(tài)的觀察.取多次純化后菌液，用試劑盒提取其基因組DNA，之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增、凝膠電泳，將PCR產(chǎn)物純化后對(duì)其直接測(cè)序，之后通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)將該菌株的16S rDNA序列與其他菌株進(jìn)行對(duì)比，選擇其他菌株的同源基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).

1.6 不同因素對(duì)菌株脫氮效果的影響

為考察不同C/N質(zhì)量濃度比對(duì)該菌株脫氮效果的影響，將該菌株接種到不同C/N質(zhì)量濃度比的某市政污水中，在4 ℃下培養(yǎng)10 h，測(cè)定初始和結(jié)束時(shí)污水中的硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮及COD濃度.為考察不同溫度對(duì)該菌株脫氮效果的影響，將該菌株接種到污水中，不同溫度下培養(yǎng)10 h，測(cè)定初始和結(jié)束時(shí)污水中的硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮及COD濃度.為考察溶解氧大小對(duì)該菌株脫氮效果的影響，把該菌株接種到污水中，不同濃度的溶解氧條件下培養(yǎng)10 h，測(cè)定初始和結(jié)束時(shí)污水中的硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮及COD濃度;為考察不同接種量對(duì)該菌株脫氮效果的影響，把不同量的該菌株接種到污水中，在4 ℃下培養(yǎng)10 h，測(cè)定初始和結(jié)束時(shí)污水中的硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮及COD濃度；為考察不同處理時(shí)間對(duì)該菌株脫氮效果的影響，把該菌株接種到污水中，在4 ℃下培養(yǎng)不同的時(shí)間，測(cè)定初始和結(jié)束時(shí)污水中的硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮及COD濃度.

1.7 測(cè)定方法

硝酸鹽氮測(cè)定方法采用鹽酸紫外分光光度法.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選與鑒定

從某污水處理廠(chǎng)CASS處理工藝反應(yīng)池出口活性污泥中篩選出3株菌，其中在4 ℃下對(duì)硝態(tài)氮的去除率在90 %以上的只有1株IL-2菌，在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行多次劃線(xiàn)分離，挑選生長(zhǎng)形態(tài)特征較好的單菌落進(jìn)行觀察和革蘭氏染色，菌落形態(tài)如圖1所示.該菌菌落偏大、呈黃色，近圓形且邊緣較整齊.通過(guò)革蘭氏染色，該菌為革蘭氏陰性菌.通過(guò)油鏡觀察，該菌是長(zhǎng)桿菌.對(duì)該株菌進(jìn)行16S rDNA測(cè)序并在NCBI上把該菌株的測(cè)序結(jié)果與其他菌株同源基因序列進(jìn)行比較，構(gòu)建菌株IL-2系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖2,菌株IL-2與假單胞菌屬(Pseudomonassp.)聚為一支，初步斷定該菌株為假單胞菌屬的菌株.

a.在平板培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)； b.革蘭氏染色后在油鏡下的菌落形態(tài).圖1 菌株IL-2的形態(tài)特征Fig.1 The Morphological Characteristics of Strain IL-2

圖2 菌株IL-2及部分假單胞菌屬菌株NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic NJ Tree of Strain IL-2 and Some Pseudomonas Strains

2.2 C/N質(zhì)量濃度比的影響

碳源是影響硝化過(guò)程的重要因素，反硝化菌多為異養(yǎng)型細(xì)菌，異養(yǎng)反硝化細(xì)菌可以以有機(jī)物為碳源，硝態(tài)氮為能源進(jìn)行反硝化作用，其生化過(guò)程為

5CH3COOH+8NO3-—→6H2O+10CO2↑+4N2↑+8OH-+能量.

碳源濃度影響反硝化作用進(jìn)程.適宜的C/N質(zhì)量濃度比對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)可以起到促進(jìn)作用，并在細(xì)菌的硝化和反硝化過(guò)程中提供能量.在該實(shí)驗(yàn)中，以乙酸鈉作為碳源，向污水中加入不同量的乙酸鈉以考察不同C/N質(zhì)量濃度比對(duì)菌株IL-2硝態(tài)氮去除效果的影響.由圖3可以看出，C/N質(zhì)量濃度比越高，硝態(tài)氮質(zhì)量濃度越低，硝態(tài)氮去除率越高.C/N質(zhì)量濃度比為2，4，6，8時(shí)，碳源相對(duì)不足，硝態(tài)氮濃度相對(duì)較高，硝態(tài)氮無(wú)法完全脫除.C/N質(zhì)量濃度比為10時(shí)，碳源質(zhì)量濃度適宜，此時(shí)硝態(tài)氮脫除效率達(dá)到97.94 %，碳氮質(zhì)量濃度比為12，14時(shí)，碳源較過(guò)量，成本較高.

2.3 溫度的影響

溫度的變化對(duì)大多數(shù)微生物來(lái)說(shuō)影響比較大，溫度過(guò)高會(huì)使微生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)和酶變形甚至失活，溫度過(guò)低，微生物體內(nèi)的酶會(huì)受到抑制進(jìn)而影響酶的活性[10].一般情況下，在一定溫度內(nèi)，隨著溫度的升高微生物的生長(zhǎng)速率加快.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4.可以看出，隨著溫度的升高，硝態(tài)氮的去除率先升高后降低，8 ℃時(shí)硝態(tài)氮去除率最高，為97.59 %.溫度升高到8 ℃以上時(shí)硝態(tài)氮去除效率降低，原因可能是反應(yīng)體系中酶的活性隨著溫度的升高受到了抑制，因此影響了反硝化速率.說(shuō)明該菌株屬于耐冷菌，在較低溫度下顯示出良好的硝態(tài)氮去除效果.

圖3 低溫下C/N質(zhì)量濃度比對(duì)菌株IL-2去除硝態(tài)氮的影響Fig.3 The Effect of Mass Concentration Ratio of C/N on the Removal of Nitrate Nitrogen by Strain IL-2 at Low Temperature

圖4 溫度對(duì)菌株IL-2去除硝態(tài)氮的影響Fig.4 The Effect of Temperature on the Removal of Nitrate Nitrogen by Strain IL-2

2.4 溶解氧的影響

在菌種的培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)曝氣泵調(diào)節(jié)溶解氧質(zhì)量濃度.20世紀(jì)80年代之前，一直認(rèn)為反硝化只發(fā)生在嚴(yán)格的缺氧環(huán)境中，在有氧的條件下參與反硝化的酶會(huì)受到抑制.Robertson等[5]發(fā)現(xiàn)好氧反硝化菌之后,這一傳統(tǒng)的觀點(diǎn)被打破，在好氧條件下也能進(jìn)行反硝化，氧氣作為微生物的終端電子受體.本研究篩選的IL-2菌是好氧反硝化菌，在好氧反硝化過(guò)程中，溶解氧(DO)是好氧脫氮的關(guān)鍵參數(shù).從圖5可以看出，當(dāng)ρ(DO)=1，2，3 mg/L，時(shí)，隨著ρ(DO)的增加，硝態(tài)氮脫除效率升高；當(dāng)ρ(DO)=3 mg/L時(shí)，IL-2菌脫氮效率最高，為98.18 %，此時(shí)ρ(硝態(tài)氮)=0.40 mg/L；繼續(xù)增加轉(zhuǎn)速，硝態(tài)氮去除率略微下降，為97.13 %.

圖5 溶解氧對(duì)菌株IL-2去除硝態(tài)氮的影響Fig.5 The Effect of DO on the Removal of Nitrate Nitrogen by Strain IL-2

圖6 接種量對(duì)菌株IL-2去除硝態(tài)氮的影響Fig.6 The Effect of Inoculum on the Removal of Nitrate Nitrogen by Strain IL-2

2.5 接種量的影響

在低溫條件下微生物生長(zhǎng)繁殖的速率較慢，因此，菌種的初始投加量對(duì)污水的反硝化效率影響較大.分別取5，10，20，30，40 mL的IL-2菌液，于3 000 r/min離心10 min，棄上清，把菌體分別接種到污水中，之后放入4 ℃，180 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)10 h.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6，可以看出，當(dāng)菌株添加5 %～30 %體積分?jǐn)?shù)時(shí)，菌株投加量越大，硝態(tài)氮脫除效率越高；當(dāng)菌株添加為30 %時(shí)，IL-2菌株脫氮效率最高為96.26 %，此時(shí)ρ(硝態(tài)氮)=0.85 mg/L；繼續(xù)增加菌株為40 %，硝態(tài)氮去除率不再升高反而降低，為91.34 %.在低溫條件下，向污水體系中投加的菌種量不能太低，否則污水中的微生物數(shù)量不足反硝化效率不高；通過(guò)增加菌種的投加量可以提高反硝化速率，但菌種的投加量也不能太高，因?yàn)槲鬯械臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限.菌種投加量過(guò)高水中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足會(huì)造成部分微生物死亡，死亡的微生物會(huì)向水中釋放氮素從而造成水中氮含量升高.

2.6 處理時(shí)間的影響

時(shí)間也是影響反硝化能力的一個(gè)因素，時(shí)間過(guò)短，反硝化進(jìn)行得不充分；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，反硝化完全進(jìn)行.從圖7可以看出，隨著處理時(shí)間的增加，硝態(tài)氮去除率有增加的趨勢(shì).其中，處理14 h時(shí)，IL-2菌脫氮效率最高，為97.84 %.

圖7 接種量對(duì)菌株IL-2去除硝態(tài)氮的影響Fig.7 The Effect of Inoculum Amount on the Removal of Nitrate Nitrogen by Strain IL-2

3 結(jié)果與討論

1) 從某污水處理廠(chǎng)CASS處理工藝反應(yīng)池出口活性污泥中篩選出一株低溫異氧反硝化菌IL-2，經(jīng)16S rDNA基因序列同源性分析，其與羅氏假單胞菌匹配指數(shù)最高.經(jīng)革蘭氏染色，該菌株是革蘭氏陰性菌.

2) 反硝化菌是異樣菌，需要外加碳源，碳源的數(shù)量影響反硝化效率.由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在一定的C/N質(zhì)量濃度比范圍內(nèi)，隨著C/N質(zhì)量濃度比升高，硝態(tài)氮質(zhì)量濃度越低，硝態(tài)氮去除率越大.C/N質(zhì)量濃度比為10時(shí)，硝態(tài)氮脫除效率最高，為97.94 %.碳氮質(zhì)量濃度比小于10時(shí)，碳源不足，影響反硝化速率；當(dāng)C/N質(zhì)量濃度比大于10時(shí)，碳源充足，反硝化速率不受碳源數(shù)量的影響.

3) 溫度會(huì)影響微生物體內(nèi)酶的活性，隨著溫度的升高，硝態(tài)氮的去除率先升高后降低，8 ℃時(shí)硝態(tài)氮去除率最高，為97.59 %.由此可知，該菌是嗜冷菌，溫度高于8 ℃時(shí)酶活性會(huì)受到影響.

4) 反硝化反應(yīng)一般是在缺氧條件下發(fā)生，本文中反硝化反應(yīng)可以在好氧條件下進(jìn)行，隨著溶解氧的增加，硝態(tài)氮脫除效率先升高再趨于穩(wěn)定；當(dāng)DO質(zhì)量濃度為3.0 mg/L時(shí)，IL-2菌脫氮效率最高，為98.18 %.

5) 菌種接種量影響反硝化速率，隨著好氧反硝化細(xì)菌IL-2接種量的提高，反硝化速率先增強(qiáng)后減弱；當(dāng)接種量為30 %時(shí)，反硝化效率最高，為96.26 %.當(dāng)接種量小于30 %時(shí)，菌種的多少限制反硝化速率；當(dāng)接種量大于30 %時(shí)，菌濃足夠，反硝化速率不變.

6) 隨著處理時(shí)間的增加硝態(tài)氮去除率先增加后穩(wěn)定，處理14 h時(shí)脫氮效率最高，為97.84 %.

傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為只有在缺氧或者厭氧的條件下反硝化作用才會(huì)發(fā)生，好氧反硝化菌的發(fā)現(xiàn)打破了這一觀點(diǎn)，并為同步硝化反硝化工藝的實(shí)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)，好氧反硝化菌的富集是實(shí)現(xiàn)同步硝化反硝化工藝的關(guān)鍵.篩選出的低溫好氧反硝化菌主要應(yīng)用于冬季溫度比較低的污水處理系統(tǒng)，主要作用是進(jìn)行反硝化把硝態(tài)氮先轉(zhuǎn)化為亞硝態(tài)氮，再轉(zhuǎn)化成氮?dú)猓瑥亩鴱乃w中脫除，減少二次污染.