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    好氧耐鹽反硝化菌選育及脫氮性能

    2022-07-05 12:57:58董紅紅趙子聞周小峰
    關(guān)鍵詞:總氮硝態(tài)硝化

    董紅紅, 趙子聞, 李 騰, 周小峰

    (深圳市長(zhǎng)隆科技有限公司 邁葳生物事業(yè)部,廣州 深圳 518116)

    化學(xué)法和生物法是廢水中氮去除的主要方法,其中生物法較為經(jīng)濟(jì)有效且不會(huì)造成二次污染[1-3].好氧條件下進(jìn)行硝化反應(yīng),缺氧或厭氧條件下進(jìn)行反硝化反應(yīng)是傳統(tǒng)的生物脫氮過程,由于對(duì)環(huán)境條件的要求不同,這2個(gè)過程不能同時(shí)發(fā)生,只能依次進(jìn)行.因此,傳統(tǒng)的工藝硝化反應(yīng)和反硝化反應(yīng)發(fā)生在2個(gè)不同的反應(yīng)池中,這就造成基建投入大.與傳統(tǒng)的反硝化菌相比,好氧反硝化菌有著生長(zhǎng)迅速、耐有機(jī)負(fù)荷、脫氮效率高及反硝化反應(yīng)可發(fā)生在好氧條件下等特點(diǎn)[4-7],避免了硝化和反硝化分離而投入大等缺點(diǎn).隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展,特別是第三產(chǎn)業(yè)的大量引進(jìn),污水的類型也在不斷增加,其中含鹽廢水分布最為廣泛,與傳統(tǒng)的城市污水相比,印染、農(nóng)藥、煤化工、造紙、煉油、海水利用、糧果、制藥等行業(yè)廢水都是高鹽廢水,水中鹽含量偏高[8].水中鹽含量高會(huì)降低水中微生物體內(nèi)脫氫酶活性,從而抑制其生長(zhǎng)代謝,嚴(yán)重的甚至?xí)斐杉?xì)菌細(xì)胞的質(zhì)壁分離致其破裂死亡,最終降低脫氮效率[9].因此,開發(fā)耐鹽反硝化細(xì)菌非常必要.近年來,針對(duì)特殊環(huán)境,國(guó)內(nèi)外研究者開展了大量篩選耐鹽反硝化菌株研究,為耐鹽菌的篩選奠定了重要基礎(chǔ)[10-11].目前,耐鹽耐冷氨氧化細(xì)菌已被篩選鑒定,在高鹽低溫的條件下仍具有較好的脫氮效能,之后,耐高氨氮和耐低溫特性的菌株也陸續(xù)被篩選鑒定[12-13].而能夠同時(shí)適應(yīng)高鹽廢水并具有高效反硝化脫氮性能的菌種較少[8],因此篩選耐高鹽的反硝化菌具有十分重要的意義.

    1 材料與方法

    1.1 樣品來源

    所用污泥來自廣東惠州某高鹽污水處理廠A/A/O處理工藝A池出口,取活性污泥.

    1.2 培養(yǎng)基

    牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化鈉5 g/L,pH為7.2~7.6.

    LB營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的成分及含量:酵母粉5.0 g/L,氯化鈉10.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,瓊脂20.0 g/L,pH為7.2~7.6.

    無機(jī)鹽培養(yǎng)基:乙酸鈉2 g/L,硝酸鉀1.0 g/L,磷酸二氫鉀1.0 g/L,七水合硫酸亞鐵0.05 g/L,氯化鈣1 g/L,七水合硫酸鎂1.0 g/L,pH為7.2~7.6.

    1.3 菌株富集馴化

    將5 g的活性污泥接種至硝態(tài)氮(0.5 g/L,鹽度為10 %)的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,在30 ℃、鹽度為10 %,180 r/min的搖床上培養(yǎng)1 d,得到第1菌液;吸取10 %的第1菌液轉(zhuǎn)接至硝態(tài)氮(1.5 g/L,鹽度為10 %)的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,在30 ℃,180 r/min的搖床上培養(yǎng)3 d,得到第2菌液;吸取10 %第2菌液轉(zhuǎn)接至硝態(tài)氮(2.0 g/L,鹽度為10 %)的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,在30 ℃,180 r/min的搖床上培養(yǎng)3 d,得到第3菌液.此過程為耐鹽反硝化菌的富集馴化過程[14].

    1.4 菌株的純化分離

    吸取1 mL馴化后的菌液采用涂布平板法用LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行分離,在30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d,獲得單菌落;采用平板劃線法把單菌落分別劃線接種至LB固體培養(yǎng)基上,在30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d,獲得單菌落;之后再重復(fù)以上操作2次(即劃線3)次使其純化[10].

    1.5 菌株的鑒定

    對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行形態(tài)鑒定,將其與《伯杰氏細(xì)菌手冊(cè)》進(jìn)行對(duì)照.對(duì)篩選出的菌株做革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)后,用電子顯微鏡觀察其微觀形態(tài).使用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒對(duì)篩選出的菌株DNA進(jìn)行提取,并送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行16S rRNA基因序列測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中與其他菌種基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì),從而確定所篩出菌株的菌屬.下載親緣關(guān)系較近的菌株16S rRNA基因,并同目標(biāo)菌株通過MAGA 6.0進(jìn)行親緣關(guān)系分析.

    1.6 菌株脫氮效果的影響因素

    為了探究不同菌株反硝化脫氮效果,選取從活性污泥中篩選出的3株耐鹽反硝化菌HX-1,IL-3和YFX-6,作為研究對(duì)象,設(shè)置菌劑添加量為20 %,在好氧環(huán)境中對(duì)提升鹽度10 %的糧果廢水進(jìn)行16 h處理,并測(cè)定硝態(tài)氮脫除效率.反應(yīng)前糧果廢水的硝態(tài)氮含量為110.41 mg/L,總氮含量為122.01 mg/L.以乙酸鈉為碳源,將菌株接種到不同C/N質(zhì)量濃度比的某糧果廢水中,提升鹽度10 %,投加量為20 %,反應(yīng)16 h,考察不同C/N質(zhì)量濃度比對(duì)菌株脫氮效果的影響,測(cè)定初始和結(jié)束時(shí)糧果廢水的硝態(tài)氮;將菌株接種到某糧果污水中,鹽度提升10 %,在不同的溶解氧條件下培養(yǎng)16 h,考察不同溶解氧對(duì)菌株脫氮效果的影響,測(cè)定初始和結(jié)束時(shí)糧果廢水的硝態(tài)氮.將不同量的菌株接種到某糧果污水中,鹽度提升10 %,培養(yǎng)16 h,考察不同接種量對(duì)菌株反硝化脫氮效果的影響,測(cè)定初始和結(jié)束時(shí)糧果污水的硝態(tài)氮;將菌株接種到糧果廢水中,在鹽度10 %的條件下培養(yǎng)不同的時(shí)間,考察不同處理時(shí)間對(duì)菌株脫氮效果的影響,測(cè)定初始和結(jié)束時(shí)市政污水的硝態(tài)氮.

    1.7 測(cè)定方法

    采用水質(zhì)硝酸鹽氮紫外分光光度法(HJ/T 346—2007)測(cè)定反應(yīng)前后的硝態(tài)氮.

    2 結(jié)果與討論

    2.1 菌株的篩選與鑒定

    a.在平板培養(yǎng)基上的菌落形態(tài); b.革蘭氏染色后在油鏡下的形態(tài).圖1 菌株YFX-6的形態(tài)特征Fig.1 The Morphological Characteristics of Strain YFX-6

    從該污水處理廠A/A/O處理工藝反應(yīng)池出口活性污泥中共篩選出3株耐鹽反硝化菌,分別命名為HX-1,IL-3,YFX-6,其中僅有YFX-6在30 ℃下對(duì)硝態(tài)氮的去除率可達(dá)90 %以上.在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行多次劃線分離,挑選生長(zhǎng)形態(tài)特征較好的單菌落進(jìn)行觀察和革蘭氏染色,菌落形態(tài)如圖1所示.菌落呈規(guī)則形狀,圓凸透明,大小統(tǒng)一,直徑2~4 mm,表面濕潤(rùn),邊緣平整,革蘭氏染色為陰性,具有運(yùn)動(dòng)性,兼氧生長(zhǎng).菌株生長(zhǎng)溫度為20~35 ℃,pH為6.0~9.0.最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃,pH為7.5.通過油鏡觀察,該菌是長(zhǎng)桿菌.通過測(cè)序,把該株菌的16S rRNA序列同NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì),顯示YFX-6菌與TG67鹽單包菌(DQ994161.1)的序列相似度為100 %.將親緣關(guān)系較近的菌株的同基因通過MEGA 6.0進(jìn)行親緣關(guān)系分析,如圖2所示.通過生物學(xué)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析后,初步確定該菌株為鹽單胞菌(Halomonassp.).

    圖2 菌株YFX-6及部分鹽單胞菌屬菌株的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic NJ Tree of Strain YFX-6 and Some Halomonas Strains

    2.2 不同菌株對(duì)硝態(tài)氮的去除效果

    圖3 菌株HX-1,IL-3和YFX-6分別 對(duì)高鹽度廢水的硝態(tài)氮去除情況Fig.3 The Removal of Nitrate Nitrogen from High-salinity Wastewater by Strain HX-1,IL-3 and YFX-6,Respectively

    如圖3所示,3株反硝化菌選擇添加量占總體積的20 %,處理16 h時(shí),YFX-6菌已在好氧環(huán)境中,對(duì)糧果高鹽(10 % NaCl)廢水處理16 h時(shí)的硝態(tài)氮脫除效率達(dá)到98.54 %,此時(shí)硝態(tài)氮質(zhì)量濃度為1.68 mg/L.而HX-1菌與IL-3菌反硝化性能顯著低于YFX-6菌,硝態(tài)氮處理效率分別為75.69 %和85.33 %.因此,YFX-6菌的脫氮效果更優(yōu),可進(jìn)行后續(xù)研究.從圖3中可以看出,YFX-6菌的脫氮效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于HX-1菌與IL-3菌.

    2.3 C/N質(zhì)量濃度比的影響

    碳源是影響硝化過程的重要因素,反硝化細(xì)菌多為異養(yǎng)型細(xì)菌,異養(yǎng)反硝化細(xì)菌可以以有機(jī)物為碳源,硝態(tài)氮為能源進(jìn)行反硝化作用,其生化過程為5CH3COOH+8NO3-→6H2O+10CO2↑+4N2↑+8OH-+能量.碳源濃度的高低影響著反硝化作用的進(jìn)程.如圖4所示,在YFX-6菌株添加量為20 %,溶解氧(DO)為3.5 mg/L的環(huán)境中好氧反應(yīng)16 h,以乙酸鈉為碳源,分別對(duì)C/N質(zhì)量濃度比為2,4,6,8和10的硝態(tài)氮的去除效果進(jìn)行考察,結(jié)果顯示碳氮質(zhì)量濃度比越高,硝態(tài)氮和總氮的脫除速率越大.C/N質(zhì)量濃度比為2,4,6,8和10處理后的硝態(tài)氮質(zhì)量濃度分別為58.52,33.08,14.23,3.87和10.40 mg/L.YFX-6菌利用NO2-和NO3-為呼吸作用的最終電子受體,把硝酸還原成氮(N2),其脫氮作用過程:NO3-→NO2-→N2↑.C/N質(zhì)量濃度比為2,4和6時(shí),碳源相對(duì)不足,硝態(tài)氮及總氮濃度相對(duì)較高,其中硝態(tài)氮脫除效率分別為47.04 %,70.06 %,87.12 %.碳氮質(zhì)量濃度比為8時(shí),碳源濃度適宜,此時(shí)硝態(tài)氮和總氮脫除效率分別達(dá)到96.49 %和90.92 %,處理后質(zhì)量濃度分別為3.87,11.09 mg/L,碳氮質(zhì)量濃度比為10時(shí),碳源較為充足,硝態(tài)氮和總氮脫除效率反而有所降低,為90.58 %和86.15 %,在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度均低于0.36 mg/L,氨氮處于1.07~2.92 mg/L.

    2.4 溶解氧的影響

    如圖5所示,從評(píng)價(jià)結(jié)果來看,對(duì)比80 r/min(ρ(DO)=1 mg/L),120 r/min(ρ(DO)=2 mg/L),150 r/min(ρ(DO)=2.8 mg/L),180 r/min(ρ(DO)=3.5 mg/L)及230 r/min(ρ(DO)=4.5 mg/L)5個(gè)處理組可以看出,隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加,硝態(tài)氮和總氮的去除率逐漸提高,當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min,相應(yīng)的ρ(DO)為3.5 mg/L,硝態(tài)氮和總氮的去除率分別為97.28 %,90.20 %,處理后的硝態(tài)氮質(zhì)量濃度為2.99 mg/L,總氮濃度為11.92 mg/L;搖床轉(zhuǎn)速繼續(xù)提升到230 r/min,相應(yīng)的ρ(DO)為4.5 mg/L,硝態(tài)氮和總氮的去除率分別為97.88 %和91.33 %,處理后的質(zhì)量濃度分別為2.33,10.55 mg/L,所有處理組中亞硝態(tài)氮和氨氮質(zhì)量濃度分別低于0.42,2.96 mg/L,該菌反硝化性能較好,但氨氧化性能不明顯.綜合考慮,性價(jià)比最高的搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min,ρ(DO)為3.5 mg/L.

    圖4 C/N質(zhì)量濃度比對(duì)菌株FX-6去除硝態(tài)氮 和去除總氮的影響Fig.4 The Effect Mass Concentration Ratio of C/N on the Removal of Nitrate Nitrogen and Removal of Total Nitrogen by Strain FX-6

    圖5 不同轉(zhuǎn)速對(duì)菌株FX-6去除硝態(tài)氮和 去除總氮的影響Fig.5 The Effect of Different Speeds on the Removal of Nitrate Nitrogen and Removal of Total Nitrogen by Strain FX-6

    2.5 接種量的影響

    在鹽度為10 %的水體中,鹽含量會(huì)抑制水中微生物的活性.因此,水體中菌種的初始投加量對(duì)其硝態(tài)氮脫除效果影響較大.在C/N質(zhì)量濃度比為8,分別投加菌液5 %,10 %,15 %,20 %,25 %和30 %(體積分?jǐn)?shù)),對(duì)糧果廢水處理16 h,ρ(DO)保持為3.5 mg/L的條件下,觀察接種量對(duì)菌株FX-6去除硝態(tài)氮和總氮的影響,見圖6.結(jié)果表明,當(dāng)菌株添加量為5 %~15 %時(shí),菌株投加量越大,硝態(tài)氮和總氮脫除效率越高;當(dāng)添加菌株體積分?jǐn)?shù)為20 %時(shí),YFX-6菌脫氮效率較高,性價(jià)比最高,其中硝態(tài)氮去除率為97.09 %、總氮去除率為90.36 %,此時(shí)硝態(tài)氮和總氮質(zhì)量濃度分別為3.23,11.79 mg/L;繼續(xù)增加菌株體積分?jǐn)?shù)為25 %和30 %時(shí),總氮去除率提升不明顯,硝態(tài)氮去除率提升也較低,在添加菌株體積分?jǐn)?shù)為25 %和30 %時(shí)硝態(tài)氮去除率分別為97.12 %和97.33 %,處理后質(zhì)量濃度分別為3.20,2.96 mg/L.當(dāng)添加不同體積分?jǐn)?shù)的菌株時(shí)各組亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度均較低,最高值僅為0.47 mg/L.各組氨氮去除效果不明顯,其含量為1.21~2.44 mg/L,體現(xiàn)出該菌不具備明顯的氨氧化能力.

    2.6 處理時(shí)間的影響

    反硝化時(shí)間也是影響硝態(tài)氮和總氮去除率的一個(gè)重要因素,時(shí)間過短,反硝化進(jìn)行不徹底;時(shí)間過長(zhǎng),反硝化進(jìn)行完全,但成本增加.在添加YFX-6菌株體積分?jǐn)?shù)為20 %,ρ(DO)為3.5 mg/L的條件下分別考察0,5,10,13,16,19和23 h的硝態(tài)氮和總氮去除效果,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7,可以看出,硝態(tài)氮和總氮的去除率均隨著時(shí)間的增加逐漸升高.其中,處理16 h時(shí),YFX-6菌脫氮效率最高,硝態(tài)氮和總氮的去除率分別為98.69 %和92.36 %,此時(shí)硝態(tài)氮和總氮質(zhì)量濃度分別為1.45,9.39 mg/L;不同處理時(shí)間組中氨氮的質(zhì)量濃度為1.79~2.91 mg/L,該菌氨氧化性能不明顯,亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度也都低于0.39 mg/L,未發(fā)現(xiàn)亞硝態(tài)氮積累現(xiàn)象.從性價(jià)比綜合考慮,16 h為最佳的反應(yīng)時(shí)間.

    圖6 接種量對(duì)菌株FX-6去除硝態(tài)氮和總氮的影響Fig.6 The Effect of Inoculation Amount on the Removal of Nitrate Nitrogen and Total Nitrogen by Strain FX-6

    圖7 不同處理時(shí)間對(duì)菌株FX-6去除 硝態(tài)氮和總氮的影響Fig.7 The Effect of Different Treatment Time on the Removal of Nitrate Nitrogen and Total Nitrogen by Strain FX-6

    3 結(jié) 論

    本實(shí)驗(yàn)從某污水處理廠A/A/O處理工藝反應(yīng)池出口活性污泥中篩選出一株耐鹽異氧反硝化菌YFX-6,經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明其與鹽單胞菌(Halomonassp)同源性較高,且為革蘭氏陰性菌.所篩選出的3株耐鹽菌中YFX-6菌硝態(tài)氮去除效果最好,其對(duì)硝態(tài)氮質(zhì)量濃度為110.41 mg/L的高鹽糧果廢水處理16 h后脫氮效果為98.54 %,此時(shí)硝態(tài)氮質(zhì)量濃度為1.68 mg/L.在碳氮質(zhì)量濃度比為8時(shí),硝態(tài)氮和總氮的脫除效率最高,分別達(dá)到96.49 %和90.92 %;溶解氧質(zhì)量濃度為3.5 mg/L時(shí),YFX-6硝態(tài)氮和總氮去除率已達(dá)較高水平,分別為97.28 %和90.20 %;接種菌株體積分?jǐn)?shù)為20 %時(shí)綜合性價(jià)比最高,YFX-6菌硝態(tài)氮去除率為97.09 %,總氮去除率為90.36 %,處理16 h時(shí)該菌硝態(tài)氮和總氮達(dá)最高去除率,分別為98.69 %和92.36 %.

    與傳統(tǒng)的缺氧/厭氧反硝化菌相比,好氧反硝化菌具有生長(zhǎng)繁殖快、耐有機(jī)負(fù)荷、脫氮效率高、對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng),反硝化反應(yīng)可發(fā)生在好氧條件下等特點(diǎn),在高鹽廢水的脫氮應(yīng)用方面具有很大意義.本研究篩選出的好氧耐鹽菌YFX-6能在高鹽含量(10 %鹽度)的廢水中生長(zhǎng)繁殖并在好氧條件下發(fā)揮出較好的脫氮性能,這對(duì)高鹽廢水總氮的處理具有重要意義.

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