基于指紋圖譜探討白芍不同炮制品成分的差異

劉 燁，馬向慧，姜恒麗，曹麗娟

（盛實百草藥業(yè)有限公司，天津市中藥飲片炮制技術(shù)企業(yè)重點實驗室，天津 300301）

白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根，味苦、酸，性微寒，歸肝、脾經(jīng)；具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰止汗，柔肝止痛，平抑肝陽的功效；可用于治療血虛萎黃，月經(jīng)不調(diào)，自汗，盜汗，脅痛，腹痛，四肢攣痛，頭痛眩暈等癥［1］。2020年版《中國藥典》收載有白芍、炒白芍和酒白芍三種炮制規(guī)格的飲片。白芍的化學成分復雜，主要有單萜及其苷類、三萜類、黃酮類、鞣質(zhì)類和多糖類等［2-5］，但目前多只以芍藥苷作為考查指標對白芍的不同炮制品進行質(zhì)量控制，不能全面地反映白芍的質(zhì)量和不同炮制品之間的成分變化。

指紋圖譜是一種表征中藥內(nèi)在質(zhì)量整體變化的評價手段，對中藥飲片質(zhì)量控制的全面性具有重要意義［6-8］，同時用化學計量法加以輔助評價，能更全面地表現(xiàn)中藥飲片的內(nèi)在品質(zhì)。本次研究采用高效液相色譜法建立了白芍不同炮制品（各10批）的指紋圖譜方法，并通過相似度分析、聚類分析和主成分分析比較其差異性，以期為規(guī)范白芍飲片的炮制工藝提供依據(jù)，并為白芍不同炮制品的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters2695高效液相色譜儀（美國沃特世科技有限公司）；XP205電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；ME-204/02電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；KQ-600DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DZKW-110恒溫水浴鍋（STWK有限公司）；H130冷卻水循環(huán)裝置（萊伯泰科有限公司）。

1.2 試劑 超純水（娃哈哈有限公司）；乙腈（德國默克股份有限公司）、磷酸（和光純藥工業(yè)株式會社）均為色譜純。

1.3 對照品 芍藥苷（批號110736-201943，純度為95.1%）、沒食子酸（批號110831-201605，純度為90.8%）、兒茶素（批號110877-202005，純度為95.1%）均購自中國食品藥品檢定研究院；芍藥內(nèi)酯苷（批號PS011455，純度為97.52%）購自成都普思生物科技股份有限公司；五沒食子酰葡萄糖（批號ZZS19101116，純度為99.39%）購自上海甄準生物科技有限公司。

1.4 藥材 10批次白芍藥材分別購自安徽、四川、浙江，均來源于毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根，經(jīng)盛實百草藥業(yè)有限公司參照2020年版《中國藥典》（一部）檢驗合格。

1.5 飲片 取白芍藥材，參照2020年版《中國藥典》（一部）“白芍”炮制方法，洗凈，潤透，切薄片，干燥，得白芍生品飲片（編號：B1~B10）；參照“炒白芍”炮制方法，取凈白芍片，照清炒法（2020年版《中國藥典》通則0213）炒至微黃色，得炒白芍飲片（編號：CB1~CB10）；參照“酒白芍”炮制方法，取凈白芍片，照酒炙法（2020年版《中國藥典》通則0213）炒至微黃色，得酒白芍飲片（編號：JB1~JB10）。白芍、炒白芍和酒白芍的樣品詳細信息見表1。

表1 30批白芍不同炮制品樣品明細

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取兒茶素、沒食子酸、芍藥苷、五沒食子酰葡萄糖和芍藥內(nèi)酯苷對照品適量，加稀乙醇制成每1 ml含兒茶素0.916 8μg、沒食子酸43.40μg、芍藥苷93.01μg、五沒食子酰葡萄糖12.82μg、芍藥內(nèi)酯苷49.54μg的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取白芍（或炒白芍，或酒白芍）粉末（過四號篩）0.2 g，置50 ml量瓶中，加稀乙醇35 ml，超聲30 min，放置至室溫，加稀乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件 色譜柱：TSKgel ODS-80TS（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B）溶液；梯度洗脫（0~10 min，5%→7%A；10~15 min，7%→13%A；15~25 min，13%A；25~40 min，13%→25%A；40~65 min，25%→55%A）；進樣量：10μl；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；檢測波長：230 nm。

2.3 精密度試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液（B1號）1份，按照“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，以芍藥苷為參照峰，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰的相對保留時間RSD＜1.0%，相對峰面積RSD＜3.0%，表明本方法精密度良好。

2.4 重復性試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液（B1號）6份，按照“2.2”項下色譜條件進樣分析，以芍藥苷為參照峰，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰的相對保留時間RSD＜1.0%，相對峰面積RSD＜3.0%，表明本方法重復性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液（B1號）1份，分別在0、2、4、8、12和24 h按照“2.2”項下色譜條件進樣檢測，以芍藥苷為參照峰，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰的相對保留時間RSD＜1.0%，相對峰面積RSD＜3.0%，表明樣品在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3 不同炮制品HPLC指紋圖譜的測定

3.1 指紋圖譜的建立 取“2.1.1”項下混合對照品溶液按“2.2”項下色譜條件進樣，得對照品色譜圖，見圖1。分別取白芍（B1~B10）、炒白芍（CB1~CB10）、酒白芍（JB1~JB10）按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣檢測，記錄數(shù)據(jù)并導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012年版）軟件，采用平均數(shù)法和多點校正法，時間寬度0.10 min，分別生成白芍、炒白芍和酒白芍對照指紋圖譜，見圖2-4。

圖1 混合對照品HPLC色譜圖

圖2 10批白芍樣品的HPLC指紋圖譜疊加圖

圖3 10批炒白芍樣品的HPLC指紋圖譜疊加圖

圖4 10批酒白芍樣品的HPLC指紋圖譜疊加圖

綜合上述圖譜，共標定10個共有峰，其中4號峰峰面積穩(wěn)定、分離度良好，故選擇其為參照峰。通過與對照品比對，共指認了5個色譜峰，分別為1號峰（沒食子酸）、2號峰（兒茶素）、3號峰（芍藥內(nèi)酯苷）、4號峰（芍藥苷）、6號峰（五沒食子酰葡萄糖），見圖5。

圖5 白芍（A）炒白芍（B）酒白芍（C）HPLC對照圖譜

以4號峰為參照峰，計算3種白芍炮制品的共有峰的相對峰面積，結(jié)果見表2，各共有峰的RSD范圍為16.204%~52.877%。

表2 白芍、炒白芍和酒白芍的指紋圖譜相對峰面積分析結(jié)果

3.2 相似度分析 分別通過10批次白芍、炒白芍和酒白芍生成的共有模式為對照指紋圖譜，計算各批次之間的相似度，結(jié)果見表3?？梢?0批次白芍的相似度均>0.986，10批次炒白芍的相似度均>0.989，10批次酒白芍的相似度均>0.985，表明白芍及其炮制品質(zhì)量穩(wěn)定，炮制工藝穩(wěn)定，且經(jīng)炮制后化學成分并未發(fā)生質(zhì)的變化。

表3 30批白芍不同炮制品相似度結(jié)果

3.3 白芍與炒白芍、酒白芍各共有峰相對峰面積差異分析 比較3種白芍炮制品的共有峰的相對峰面積可知，與白芍生品相比較，炒白芍和酒白芍的1號峰、3號峰、6號峰的相對峰面積均有不同程度的增加，其中1號峰具有顯著性差異；2號峰、8號峰、9號峰的相對峰面積均有不同程度的減小，其中8號峰和9號峰有顯著性差異；炒白芍中7號峰的相對峰面積也出現(xiàn)顯著性減小；10號峰和5號峰的相對峰面積均無明顯的變化，結(jié)果見表4和圖6。

圖6 白芍與炒白芍、酒白芍的相對峰面積均值對比圖

表4 白芍與炒白芍、酒白芍共有峰相對保留時間和相對峰面積（n=10）

3.4 指標性成分定量分析 分別取白芍、炒白芍和酒白芍樣品（各10批）參照2020年版《中國藥典》一部［1］白芍項下含量測定方法進行檢測，計算炮制前后芍藥苷的含量變化，結(jié)果見表5和表6。由表5可知，白芍中芍藥苷含量為2.5%~3.1%，平均含量為2.7%；炒白芍中芍藥苷含量為2.2%~3.0%，平均含量為2.5%；由表6可知，酒白芍中芍藥苷含量為2.2%~2.9%，平均含量為2.5%。炒白芍含量變化平均值為-0.2%，酒白芍含量變化平均值為-0.2%，說明炒制、酒制會影響芍藥苷的含量。

表5 白芍及炒白芍中芍藥苷質(zhì)量分數(shù)及變化

表6 白芍及酒白芍中芍藥苷質(zhì)量分數(shù)及變化

3.5 系統(tǒng)聚類分析 將各批次白芍飲片共有峰的峰面積導入SPSS 17.0系統(tǒng)軟件，進行標準化處理后，采用組間連接法，以余弦距離作為樣品間距離計算方法進行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖7。當余弦距離為25時，樣品可聚為兩大類，B1~B7為一類，B8~B10為另一類；當余弦距離為15時，樣品聚為三大類，B1、B2、B3、B6為一類，B4、B5、B7為一類，B8、B9、B10為一類。

圖7 10批白芍樣品聚類分析圖

3.6 主成分分析 采用SPSS 17.0軟件對白芍不同炮制品（各10批）的共有峰峰面積進行標準化處理后，對指紋圖譜所得的10個共有峰進行主成分分析，所得累計方差貢獻率和特征值結(jié)果見表7、圖8。以特征值＞1為提取標準，得到2個主成分因子，方差百分比分別為58.67%和31.70%，累積貢獻率為90.37%，說明提取的2個主成分可以代表原始色譜峰峰面積90.37%的信息，具有很好的代表性，提示主成分因子1、2可作為白芍不同炮制品的評價指標。

圖8 主成分分析碎石圖

表7 特征值及方差貢獻率

主成分載荷矩陣（表8）反映了各變量對主成分的貢獻大小和作用方向，對其分析可知7個變量與主成分因子1呈正相關(guān)，其中以峰1（沒食子酸）、峰3（芍藥內(nèi)酯苷）、峰5、峰6和峰10對其貢獻較大；7個變量與主成分因子2呈正相關(guān)，其中峰7、峰8和峰9對其貢獻較大，與不同白芍炮制品各共有峰相對峰面積差異分析結(jié)果基本一致。

表8 主成分載荷矩陣

對上述主成分載荷值進行計算，得出各主成分的線性模型：F1＝0.38×Z峰1+0.31×Z峰2+0.4×Z峰3+0.35×Z峰4+0.39×Z峰5+0.4×Z峰6-0.10×Z峰7-0.02×Z峰8-0.09×Z峰9+0.39×Z峰10；F2＝-0.11×Z峰1-0.12×Z峰2-0.03×Z峰3+0.28×Z峰4+0.09×Z峰5+0.06×Z峰6+0.52×Z峰7+0.55×Z峰8+0.54×Z峰9+0.13×Z峰10。其中，F(xiàn)1、F2分別表示第1、2個主成分因子，Z峰1～Z峰10分別表示10個共有峰峰面積的標準化數(shù)據(jù)。

將各樣品數(shù)據(jù)代入上述計算模型后，可得其主成分得分，結(jié)果見表9，以兩個主成分因子的得分值分別為橫縱坐標建立散點圖，結(jié)果見圖9。其可直觀表現(xiàn)出各樣品間的差異，B4、B5、B7分布較集中，B1、B2、B3、B6分布較集中，與聚類分析結(jié)果一致。

圖9 30批白芍不同炮制品的主成分因子得分圖

表9 30批白芍不同炮制品的主成分因子得分表

4 討論

本研究前期采用DAD檢測器對白芍樣品進行全波長掃描，綜合對比后，230 nm波長下，色譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰數(shù)量較多且吸收強度均勻，因此選用其為檢測波長。

分析比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸和乙腈-0.1%磷酸四種不同的流動相系統(tǒng)，乙腈-0.1%磷酸條件下圖譜基線平穩(wěn)，色譜峰分離度良好，受干擾因素影響小，因此選擇其作為最佳流動相系統(tǒng)。

對不同提取方式、不同提取溶劑和不同提取時間進行了考查，從提取的全面性、穩(wěn)定性，操作的便捷性等方面考慮，選擇稀乙醇作為樣品提取溶劑，超聲法提取30 min。

白芍、炒白芍和酒白芍（各10批）的指紋圖譜相似度均大于0.98，證明其炮制前后化學成分種類未發(fā)生變化，同時，相對峰面積的RSD為16.204%~52.877%，證明白芍炮制前后化學成分含量變化較大。含量測定結(jié)果表明，白芍炒制前后指標性成分芍藥苷含量變化為-0.8%~0.4%，整體呈下降趨勢；酒制前后指標性成分芍藥苷含量變化為-0.8%~0.1%，整體也呈下降趨勢。

聚類分析結(jié)果與主成分分析結(jié)果互相印證，即B1、B2、B3、B6聚為一類，B4、B5、B7聚為一類，B8、B9、B10聚為一類。由此可知，雖然產(chǎn)地一致，但受生長環(huán)境等其他因素影響，白芍飲片的質(zhì)量也有差異。主成分分析結(jié)果與白芍不同炮制品共有峰相對峰面積差異分析結(jié)果基本一致，色譜峰1（沒食子酸）、3（芍藥內(nèi)酯苷）、5、6（五沒食子酰葡萄糖）、7、8、9、10對炮制前后化學成分差異的貢獻較大，與白芍生品相比較，炒白芍和酒白芍的1號峰、3號峰、6號峰的相對峰面積均有不同程度的增加，其中1號峰具有顯著性差異；2號峰、8號峰、9號峰的相對峰面積均有不同程度的減小，其中8號峰和9號峰有顯著性差異；炒白芍中7號峰的相對峰面積也出現(xiàn)顯著性減小。

芍藥內(nèi)酯苷具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗驚厥及護肝等作用［9］。炒白芍、酒白芍與白芍相比，寒性減弱，鎮(zhèn)痛能力增強，推測其與芍藥內(nèi)酯苷的含量增加有一定的關(guān)系。