孫金梅,張成杰,李堯,陳彬
腦卒中是人類死亡的第3 大原因,缺血性卒中占全部卒中的75%~80%[1]。約33%~42%的腦梗死患者發(fā)病后3~6個月仍需要他人照顧[2]。腦梗死后的康復(fù)鍛煉對改善腦梗死患者的生活質(zhì)量有重要意義[3,4]。研究發(fā)現(xiàn)小鼠局灶性腦缺血后,予適量胡須刺激可上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、Tie-1、ang2等的表達(dá)來促進(jìn)血管生成進(jìn)而改善梗死部位血流灌注[5,6],也可通過增加血清基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1,SDF-1)、雙腎上腺皮質(zhì)激素(doublecortin,DCX)等的表達(dá)促進(jìn)更多神經(jīng)母細(xì)胞從室管膜下區(qū)向缺血半暗區(qū)遷移,促進(jìn)腦梗死后的神經(jīng)發(fā)生[7]。神經(jīng)可塑性也參與康復(fù)鍛煉促進(jìn)腦梗死后功能的恢復(fù)過程[7,8],但具體機(jī)制尚未完全明確。
本研究通過建立小鼠桶狀皮質(zhì)(Barrel Cortex)局灶性腦梗死模型,探討規(guī)律胡須刺激是否具有改善神經(jīng)功能缺損的作用,并從神經(jīng)可塑性角度探討相關(guān)機(jī)制。
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 成年雄性C57bl/6 小鼠60 只,8~10 周齡,體質(zhì)量25 g 左右,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司,飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心。本研究遵循實(shí)驗(yàn)動物相關(guān)的規(guī)章制度,通過動物倫理委員會批準(zhǔn)。
1.1.2 主要試劑 突觸素(synaptophysin,SPY)-1、生長相關(guān)蛋白43(growth associated protein 43,GAP 43)購于Cell Signaling 公司;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurophic factor,BDNF)購于Santa Cruz 公司;神經(jīng)絲蛋白(neurofilament,NF)、內(nèi)參Tubulin 抗體購于Sigma公司。
1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組和設(shè)計 60 只小鼠隨機(jī)分為3 組:假手術(shù)組、腦梗死組(桶狀皮質(zhì)局灶性腦缺血模型)和胡須刺激組(桶狀皮質(zhì)局灶性腦缺血+胡須刺激),各20 只。
1.2.2 腦梗死模型的建立 10%水合氯醛麻醉小鼠,左側(cè)臥位固定于手術(shù)臺上,10-0 的縫合線永久性的結(jié)扎胡須桶狀皮質(zhì)周圍2~3 個大腦中動脈分支;4-0 縫合線阻斷兩側(cè)頸總動脈血流7 min后恢復(fù)供血;關(guān)閉顱窗,粘合傷口。手術(shù)過程維持小鼠體溫在(37.0±0.5)℃。假手術(shù)組小鼠,不進(jìn)行大腦中動脈遠(yuǎn)端的結(jié)扎,其他操作步驟相同[9]。
1.2.3 胡須刺激方案 胡須刺激組小鼠于模型建立后第3天開始,使用簡易振動棒(頻率140 次/min)反復(fù)刮撥小鼠左側(cè)所有胡須,15 min/次,3 次/d,共12 d。
1.2.4 行為學(xué)檢測 ①HomeCage 行為學(xué)分析。腦缺模型建立后第14天,由預(yù)先放置的攝像頭記錄24 h內(nèi)各組小鼠在籠內(nèi)進(jìn)食、飲水、跑動等自發(fā)活動。通過內(nèi)置軟件(version 3.0, Clever Systems, Inc.)對小鼠的行走時長、行走距離、跳躍、后肢站立、不動時間、活躍時間等參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計、分析[10]。②貼紙去除試驗(yàn)[11]檢測小鼠桶狀皮質(zhì)對應(yīng)區(qū)的感覺和運(yùn)動功能。經(jīng)過適應(yīng)訓(xùn)練后開始測試,左手輕抓小鼠的頸、背部皮膚,腹部朝上,右手用鑷子將4 mm×4 mm的貼紙貼于小鼠的左前腳掌上,迅速放于籠中后記錄小鼠感知到貼紙的時間(表現(xiàn)為小鼠站立、用胡須觸碰貼紙等動作)以及去除貼紙的時間(可借助對側(cè)的前爪或牙齒)。每只小鼠單側(cè)行為學(xué)評估的最長時間為180 sec;若超過180 sec,小鼠仍未感知或去除貼紙,時間記錄為180 sec。
1.2.5 Western blot 檢測蛋白表達(dá)水平 腦缺血模型建立后第14天,10%水合氯醛麻醉小鼠后斷頭取腦,取梗死灶周圍0.5 mm范圍內(nèi)鄰近皮質(zhì)腦組織,假手術(shù)組取相同部位。常規(guī)法行Western blot,檢測各組梗死灶周圍SYP-1、BDNF、GAP-43和NF蛋白的表達(dá)水平,以Tubulin為內(nèi)參,計算目標(biāo)蛋白與Tubulin的比值。
1.2.6 熒光免疫檢測NF 纖維 腦缺血模型建立后第14天,用PBS心臟灌注后取腦,4%甲醛固定,切片機(jī)切片(10 μm),乙醇:乙酸混合溶液(2∶1)固定5 min,NF一抗(1∶400)孵育過夜,PBS 沖洗后二抗孵育1 h 后顯色固定,免疫熒光照相機(jī)(BX61,Olympus)拍照,Image J軟件測量NF 纖維熒光密度。每只小鼠選擇6 個冠狀腦切片,相鄰腦片距離間隔90 μm,每個腦切片腦梗死周圍(缺血半暗帶區(qū))隨機(jī)選擇6個區(qū)域。
采用GraphPad Prism 5軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布以及方差齊性的計量資料以(±s)表示,組間比較采用獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn);P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
貼紙去除試驗(yàn)結(jié)果顯示,造模前,3組小鼠的貼紙感知時間和貼紙去除時間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05);造模后3、7、14 d,腦梗死組小鼠的貼紙感知時間和貼紙去除時間均高于假手術(shù)組(均P<0.05),提示桶狀皮質(zhì)局灶性腦缺血確實(shí)造成小鼠的神經(jīng)功能缺損;造模后7 d,胡須刺激組小鼠的貼紙去除時間短于腦梗死組(P<0.05),造模后14 d,胡須刺激組小鼠的貼紙感知時間和貼紙去除時間均短于腦梗死組(均P<0.05),提示規(guī)律的胡須刺激可明顯改善桶狀皮質(zhì)局灶性腦缺血小鼠的神經(jīng)功能缺損的情況,見表1-1、表1-2、圖1。
圖1 3組小鼠貼紙去除試驗(yàn)結(jié)果
表1-2 3組小鼠貼紙去除試驗(yàn)的貼紙去除時間比較(s, ±s)
表1-2 3組小鼠貼紙去除試驗(yàn)的貼紙去除時間比較(s, ±s)
注:與假手術(shù)組比較,①P<0.05;與腦梗死組比較,②P<0.05
組別假手術(shù)組腦梗死組胡須刺激組只數(shù)20 20 20造模前4.40±1.17 4.60±1.07 4.80±1.23造模后3 d 4.70±1.70 28.10±10.26①27.00±7.82①造模后7 d 4.51±0.93 22.40±9.28①14.00±2.83①②造模后14 d 4.39±0.79 9.00±3.13①6.60±1.83②
表1-1 3組小鼠貼紙去除試驗(yàn)的貼紙感知時間比較(s, ±s)
表1-1 3組小鼠貼紙去除試驗(yàn)的貼紙感知時間比較(s, ±s)
注:與假手術(shù)組比較,①P<0.05;與腦梗死組比較,②P<0.05
組別假手術(shù)組腦梗死組胡須刺激組只數(shù)20 20 20造模前2.60±0.96 2.60±0.70 2.50±0.53造模后3 d 3.10±1.10 15.10±9.89①15.00±9.45①造模后7 d 2.90±0.85 9.60±8.26①8.70±5.91①造模后14 d 2.72±0.89 5.80±4.57①2.60±0.97②
HomeCage 行為學(xué)分析結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,腦梗死組和胡須刺激組小鼠活躍性指標(biāo)(活動距離、活動時長、跳躍時長、后肢站立和總體活躍時間)均有明顯下降,而不動時間明顯延長(均P<0.05);與腦梗死組相比,胡須刺激組小鼠活躍性指標(biāo)均明顯提高,不動時間明顯縮短(均P<0.05),提示規(guī)律的胡須刺激可明顯改善桶狀皮質(zhì)局灶性腦缺血小鼠的神經(jīng)功能缺損的情況,見表2、圖2。
圖2 3組小鼠HomeCage行為學(xué)檢測結(jié)果
表2 3組小鼠HomeCage行為學(xué)分析比較(±s)
表2 3組小鼠HomeCage行為學(xué)分析比較(±s)
組別假手術(shù)組腦梗死組胡須刺激組只數(shù)20 20 20活動總距離/m 266.84±15.07 146.02±41.32①194.92±42.59①②行走總時長/s 1582.64±219.34 901.66±258.30①1160.05±230.12①②跳躍總時長/s 31.48±8.32 15.14±9.85①28.77±17.09①②后肢站立總時長/s 25.38±5.38 14.39±6.32①23.86±10.51①②
注:與假手術(shù)組比較,①P<0.05;與腦梗死組比較,②P<0.05
Western blot 結(jié)果顯示,在小鼠桶狀皮質(zhì)局灶性腦缺血后14 d,梗死灶周圍SYP-1和GAP-43蛋白的表達(dá)明顯上調(diào),給予胡須刺激后上調(diào)更加明顯(均P<0.05);BDNF 呈同樣趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.06);梗死灶周圍NF的表達(dá)明顯下降,給予規(guī)律的胡須刺激可逆轉(zhuǎn)該改變(P<0.05),見圖3。
圖3 3組小鼠梗死灶周SYP-1、BDNF、GAP-43和NF蛋白表達(dá)水平的Western blot檢測結(jié)果
免疫熒光檢測顯示假手術(shù)組小鼠腦組織NF 纖維呈現(xiàn)綠色熒光,規(guī)律分布;腦梗死組病灶周圍NF 熒光強(qiáng)度變低,纖維分布排列紊亂,密度減少;胡須刺激組NF 的纖維長度較腦梗死組增加,紊亂排列的現(xiàn)象改善,定量分析提示胡須刺激組NF的熒光強(qiáng)度較腦梗死組增加(P<0.05),見圖4。
圖4 3組小鼠腦組織NF免疫熒光檢測結(jié)果
有效地康復(fù)鍛煉可以通過激活內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制促進(jìn)腦梗死后神經(jīng)功能的恢復(fù),降低致殘率。腦梗死后內(nèi)源性的修復(fù)機(jī)制可能來源于內(nèi)源性神經(jīng)生長因子分泌增加、內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞激活、遷移[12-14],也來源于抗炎細(xì)胞因子的調(diào)控[15]、梗死面積的縮小和梗死后的血管新生[16]等。內(nèi)源性修復(fù)也有賴于神經(jīng)系統(tǒng)的重塑。神經(jīng)可塑性是指神經(jīng)元及其網(wǎng)絡(luò)連接在外界應(yīng)激后出現(xiàn)結(jié)構(gòu)、功能方面的適應(yīng)性改變[17],在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的恢復(fù)中發(fā)揮著重要的作用[18,19]。研究證實(shí),胡須刺激可促進(jìn)小鼠局灶性桶狀皮質(zhì)缺血性卒中后的神經(jīng)再生及血管再生,神經(jīng)可塑性機(jī)制是否參與腦梗死小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)仍需進(jìn)一步研究。
本研究中采用的模型為小鼠桶狀皮質(zhì)局灶性腦缺血模型,是大腦中動脈遠(yuǎn)端的永久性結(jié)扎所致局灶性腦缺血,缺血部位主要累及感覺皮質(zhì)、運(yùn)動皮質(zhì)和桶狀皮質(zhì)區(qū)域,表現(xiàn)為對側(cè)肢體的感覺和運(yùn)動障礙及胡須感覺障礙。該模型具有梗死面積小、梗死體積相對穩(wěn)定、死亡率低和存活時間長等優(yōu)點(diǎn)[20]。桶狀皮質(zhì)為嚙齒類動物胡須感覺功能區(qū),胡須刺激可以作為桶狀皮質(zhì)缺血后功能康復(fù)的良好模型。行為學(xué)是評估神經(jīng)功能缺損的直接體現(xiàn),在本研究中小鼠的行為學(xué)不僅采用經(jīng)典的貼紙感知、去除實(shí)驗(yàn),也同時采用了HomeCage系統(tǒng)。HomeCage系統(tǒng)可定量分析小鼠行為學(xué)變化,盡可能避免人為干擾因素,提供更客觀的評測數(shù)據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)桶狀皮質(zhì)腦梗死后小鼠的貼紙感知和去除時間都長于對照組,HomeCage行為學(xué)的活躍性指標(biāo)低于對照組,不動時間長于對照組;證實(shí)了桶狀皮質(zhì)缺血后小鼠存在明確的神經(jīng)功能缺損。與腦梗死組相比,胡須刺激組小鼠的上述指標(biāo)均出現(xiàn)改善,即規(guī)律的胡須刺激可以明顯改善腦梗死小鼠的神經(jīng)缺損情況。
SYN-1和GAP-43是神經(jīng)可塑性的標(biāo)志,在神經(jīng)康復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[21]。SYN-1 是一種鈣結(jié)合蛋白,位于突觸前囊泡膜,參與突觸可塑性的調(diào)節(jié);GAP-43 是一種神經(jīng)組織特異性磷酸蛋白,參與軸突和突觸的“生長”或“可塑性”[22]。本實(shí)驗(yàn)Western blot 檢測結(jié)果顯示SYN-1和GAP-43蛋白在腦梗死后明顯的上調(diào),給予胡須刺激后上調(diào)的程度明顯增加,且SYN-1 和GAP-43的上調(diào)趨勢與BDNF 一致,提示神經(jīng)可塑性和腦梗后的神經(jīng)再生同時存在,可能共同參與腦梗死后的神經(jīng)功能的恢復(fù)。NF 是神經(jīng)元主要細(xì)胞骨架蛋白,作為一種神經(jīng)元特異性的中間絲,其亞基蛋白表達(dá)和磷酸化水平可直接影響軸突直徑、髓鞘形成和傳導(dǎo)速率等,反映軸突缺血性損傷程度,可作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷標(biāo)志[23]。神經(jīng)系統(tǒng)損傷導(dǎo)致NF 被破壞后釋放入血和腦脊液,在腦脊液和外周血可檢測到NF的表達(dá)升高[24]。本實(shí)驗(yàn)通過免疫熒光技術(shù)檢測到腦缺血后腦實(shí)質(zhì)內(nèi)NF崩解、紊亂,熒光變淡,而胡須刺激可逆轉(zhuǎn)這一改變。
綜上所述,本研究表明胡須刺激可促進(jìn)腦梗死后神經(jīng)功能缺損的恢復(fù),可能的機(jī)制是通過調(diào)控NF、SYP-1 和GAP-43 等參與的神經(jīng)可塑性。這為腦卒中的康復(fù)提供了新的思路。