丁苯酞及其衍生物在腦缺血再灌注損傷中的保護機制

潘茁麗，成美芳，馬靜萍

腦卒中具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率的特點，其中缺血性卒中占全部腦卒中的70%～80%[1]。目前缺血性卒中急性期的治療原則仍為盡早恢復缺血腦組織的血流灌注，拯救缺血半暗帶。臨床上常采取的血管再通手段在使腦血管再通的同時也可能造成腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）。其發(fā)病機制主要包括氧化應激、炎癥破壞、線粒體功能障礙、鈣超載與谷氨酸興奮性毒性、細胞凋亡等[2]。

丁苯酞是從芹菜籽中提取并人工合成的光學異構體，目前被廣泛應用于急性缺血性腦卒中的治療[3]。研究發(fā)現(xiàn)丁苯酞及其衍生物具有緩解CIRI的作用，現(xiàn)對其機制的研究成果綜述如下。

1 保護血腦屏障，減輕腦水腫

血腦屏障由內皮細胞、星形膠質細胞、周細胞及細胞外基質組成，其中內皮細胞間的緊密連接是血腦屏障最重要的結構[4]。緊密連接水平和小窩介導的囊泡轉運參與調節(jié)內皮細胞的通透性[5]。Li等[4]發(fā)現(xiàn)丁苯酞可以抑制腦缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）后 緊 密 連 接 蛋 白 如claudin-5、occludin、ZO-1 等的減少及小窩蛋白-1（CAV-1）的升高，從而降低血腦屏障的通透性、減輕腦水腫?；|金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）可以降解細胞外基質的多種蛋白，在CIRI 大鼠中丁苯酞可抑制MMP-9 的表達而增加MMP 組織抑制因子1表達，緩解血腦屏障的損傷[6]。

2 改善腦微循環(huán)

微血管功能障礙是CIRI 中的重要因素，可表現(xiàn)為血管收縮、血栓形成、血流灌注減少等[7]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)和血栓形成系統(tǒng)參與腦缺血后大腦微循環(huán)的調節(jié)。Qin等[8]發(fā)現(xiàn)腦I/R后腎素、血管緊張素原、血管緊張素轉換酶1及其下游效應因子血管緊張素II 受體1 型和RhoA 蛋白的表達增加，而丁苯酞可以通過抑制上述因子變化發(fā)揮血管舒張作用，同時可降低血栓素A2合酶/前列環(huán)素合成酶的比值，減少血栓形成風險。Huang 等[9]的研究表明丁苯酞可通過提高核轉錄因子Nrf2、缺氧誘導因子-1α、血管內皮生長因子的表達水平促進新生血管的生成。Wang等[10]的研究提出，Dll4/Notch通路也參與丁苯酞促進血管生成的過程。

3 抑制氧化應激

氧化應激主要表現(xiàn)為活性氧（reactive oxygen species，ROS）與抗氧化因子的失衡。過量的ROS氧化細胞內脂質、蛋白質、DNA，導致細胞死亡[11]。ROS 的來源包括NADPH 氧化酶、黃嘌呤氧化酶等，相對的抗氧化因子有超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽過氧化物酶等[12]。Zhou等[13]合成的丁苯酞類似物5d 可以通過促進蛋白激酶CK2 的表達抑制細胞質亞基Rac1 與CK2α的解離，阻止Rac1、p47phox易位至細胞膜，抑制NADPH 氧化酶的激活，從而減少腦I/R 后ROS 的產生。丁苯酞的另一種衍生物8e 通過抑制P13Kγ/AKT 通路減少NADPH 氧化酶2 亞基p47phox 的表達及磷酸化，減少超氧化物的產生[14]。Yin 等[15]將開環(huán)丁苯酞與H2S、NO 供體合成一種新的衍生物，其可增加CIRI 大鼠中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽過氧化物酶的含量增加而脂質過氧化產物丙二醛的產生減少，且神經保護作用強于丁苯酞。近期研究人員將開環(huán)丁苯酞及依達拉奉類似物合成一種雜合分子10a，發(fā)現(xiàn)10a 可通過Nrf2 途徑調節(jié)下游的抗氧化酶如血紅素氧合酶）、NQO1，以此減輕氧化損傷[16]。因此，丁苯酞及其衍生物主要通過維持I/R 后腦內氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡實現(xiàn)神經保護作用。

4 抑制炎癥破壞

I/R 后過度的炎癥被激活進一步破壞缺血后腦組織，而丁苯酞的作用在于調節(jié)炎癥的程度。丁苯酞可以抑制缺血區(qū)中性粒細胞的浸潤，抑制IL-1β、IL-6、CCL2、CCL3、TNFα等炎性因子的釋放以及細胞間粘附分子-1的表達，從而減輕炎癥損害[17]。核轉錄因子-κB（NF-κB）及p38/絲裂原活化蛋白激酶（p38/MAPK）作為炎性因子的上游在腦I/R后發(fā)生磷酸化，丁苯酞可抑制上述因子的活化，在轉錄水平上減輕炎癥反應[18]。丁苯酞衍生物CD21 可以抑制高遷移率簇蛋白B1 介導的TLR4/NF-κB 通路及組織蛋白酶B 介導的NLRP3/ASC/Caspase-1 通路，進而阻止NLRP3炎性小體的激活[19]。小膠質細胞是腦缺血后最先響應的免疫細胞之一，其活化后有2 種表型：促炎性的M1型和抗炎性的M2型，目前的觀點認為平衡MG的亞型有助于減輕神經損傷[20]。近期一項關于CD21的研究指出AMPK通路參與調節(jié)MG 的極化方向，研究發(fā)現(xiàn)CD21 通過提高腺苷酸激活蛋白激酶的磷酸化水平減少M1 亞型的標志物如CD86、IL-1β和誘導型一氧化氮合酶的表達，增加M2亞型的標志物如CD206、IL-10和YM1/2的表達，并促進M2型MG分泌抗炎因子IL-10，抑制M1 型MG 分泌炎性因子IL-1β、IL-6、TNFα，以此發(fā)揮抗炎作用[21]。

5 保護線粒體功能

線粒體是CIRI 的關鍵細胞器，涉及CIRI 中的多個機制如ROS的產生、能量代謝障礙、線粒體途徑的細胞凋亡等，是調控細胞存活及疾病轉歸的關鍵因子[22]。Chen等[23]發(fā)現(xiàn)丁苯酞具有穩(wěn)定線粒體膜電位、提高線粒體呼吸鏈復合物與ATP 酶的活性、平衡線粒體的分裂與融合等作用。Zhao等[24]發(fā)現(xiàn)丁苯酞衍生物(S)-ZJM-289 可以促進抗凋亡蛋白bcl-2 的表達，抑制促凋亡蛋白bax向線粒體膜易位及凋亡誘導因子（AIF）的核易位，減少細胞色素C的釋放，進而抑制線粒體途徑的細胞凋亡。顏秀麗等[25]發(fā)現(xiàn)丁苯酞可以通過調節(jié)線粒體蛋白如細胞色素C氧化酶A2、煙酰胺核苷酸轉移酶、解偶聯(lián)蛋白3 的表達水平維持線粒體能量代謝。

6 減輕谷氨酸興奮性毒性與鈣超載

谷氨酸是中樞神經系統(tǒng)重要的興奮性神經遞質，谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)維持正常神經元內谷氨酸的低水平狀態(tài)。I/R后腦內谷氨酸含量升高，在突觸中積聚的谷氨酸激活離子型受體N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR），引起Ca2+通道開放，導致細胞內Ca2+超載，加重腦組織損傷[26]。目前關于丁苯酞減輕谷氨酸興奮性毒性的作用機制尚不明確。對于急性缺血性腦卒中患者丁苯酞處理可以降低體內谷氨酸含量減輕神經功能缺損[27]。但有研究發(fā)現(xiàn)在Na+/Ca2+交換體和興奮性氨基酸轉運體的作用下谷氨酸可以刺激神經元復氧后的氧化代謝[28]，這表示神經元內的谷氨酸為保護因子，而興奮性毒性主要是通過刺激受體實現(xiàn)的。Luo等[29]認為神經保護劑不能通過阻斷NMDAR減輕CIRI，而NMDAR與電壓門控Ca2+通道亞單位α2δ-1的結合可以作為新的干預靶點。

7 調節(jié)神經發(fā)生

傳統(tǒng)的觀點認為成熟神經元的再生能力很低，但近年來的研究提出成年人的大腦中仍有神經發(fā)生。在海馬齒狀回的亞顆粒區(qū)和側腦室的腦室下區(qū)存在具有增殖分化潛能的神經干細胞（neural stem cells，NSCs）。在缺血缺氧時NSCs 可被激活進行增殖和遷移，新生細胞逐步分化成熟并且建立突觸聯(lián)系[30]。Yang等[31]發(fā)現(xiàn)丁苯酞可以激活I/R后受損半球海馬齒狀回中的NSCs，促進神經前體細胞增殖，并提高新生細胞存活率，調節(jié)NSCs向神經元方向分化，改善突觸可塑性。有研究提出丁苯酞可激活腦源性神經營養(yǎng)因子（brain derived neurophic factor，BDNF）、神經生長因子（nerve growth factor，NGF）及表皮生長因子受體介導的相關通路，促進神經細胞生長錐及突觸形成，減輕I/R 誘導的突觸受損，增加神經突起的數(shù)量、分支及長度[32]。也有研究顯示丁苯酞可以通過BDNF/TrkB/CREB 與P13K/Akt通路促進NSCs的增殖、遷移、分化[33]。Sun等[34]提出丁苯酞可以促進腦缺血后皮質脊髓束向損傷區(qū)生長，對腦室下區(qū)的神經發(fā)生起積極作用。近期的一項研究中提出丁苯酞促進神經突起生長發(fā)育的作用與生長相關蛋白-43的表達、Sonic Hedgehog(Shh)通路的激活有關[35]。白小梅等[36]發(fā)現(xiàn)丁苯酞對于神經髓鞘也有一定的保護作用，表現(xiàn)為提高髓鞘堿性蛋白的表達水平、抑制髓鞘相關糖蛋白的表達，從而減輕I/R誘導的髓鞘損傷。

8 抑制細胞死亡

現(xiàn)有的研究表明腦I/R 誘導的細胞死亡形式包括壞死、細胞凋亡、自噬、焦亡、壞死性凋亡等[2]。Xu 等[37]的試驗表明丁苯酞可以通過P13K/Akt/mTOR通路提高bcl-2/bax的比值、降低自噬標志蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及beclin-1的含量，同時抑制凋亡與自噬2 種神經細胞死亡形式。p38 是MAPK 家族的成員，參與炎癥、細胞凋亡及生長，Liao 等[38]認為丁苯酞可以抑制p38/MAPK 通路誘導的細胞凋亡。劉偉等[39]發(fā)現(xiàn)經丁苯酞處理后CIRI大鼠腦內PARP-1及AIF表達減少，Parthanatos樣細胞死亡受抑制。細胞壞死性凋亡與經典的細胞壞死、凋亡不同，表現(xiàn)為細胞器腫脹、細胞膜破裂、有炎性反應等，其過程受受體相互作用蛋白（RIP）的調控。郭生龍等[40]的研究發(fā)現(xiàn)丁苯酞可以減少RIP1、RIP3的表達、阻止AIF與RIP3的結合及核轉移，從而抑制腦I/R誘導的細胞壞死性凋亡。

9 小結

丁苯酞及其衍生物具有保護血腦屏障、改善微循環(huán)、抑制氧化應激及炎癥破壞、調節(jié)神經發(fā)生、抑制細胞死亡等的藥理作用。目前的研究發(fā)現(xiàn)丁苯酞不僅可以用于急性缺血性腦卒中的治療，對于阿爾茲海默病、血管性癡呆、帕金森病、肌萎縮側索硬化等神經內科常見病也有改善神經功能的作用；此外，對于非神經系統(tǒng)疾病，丁苯酞也有一定的藥用價值。丁苯酞的作用機制較為復雜，涉及多種分子及信號通路，并且作用廣泛，仍需進一步探索。