腎母細(xì)胞瘤腫瘤微環(huán)境相關(guān)預(yù)后基因鑒定及免疫浸潤模式識(shí)別*

譚小軍，周 玉，伍 季，韋堂墻

(南充市中心醫(yī)院/川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院泌尿外科，四川南充 637000)

腎母細(xì)胞瘤(Wilms tumor，WT)是兒童常見的腹部惡性腫瘤，占0～14歲兒童腎臟腫瘤的90%[1]。手術(shù)與放化療相結(jié)合使WT的治療取得了很大進(jìn)展，其5年總生存率為90%，但仍存在預(yù)后不良、復(fù)發(fā)的患者[1]。國際兒科腫瘤學(xué)會(huì)(SIOP)和美國兒童腫瘤學(xué)組(Children′s Oncology Group，COG)根據(jù)腫瘤的分期和病理類型等，將腫瘤分為不同的危險(xiǎn)等級(jí)，為判斷患兒的預(yù)后提供指導(dǎo)[2]。但是近50%的復(fù)發(fā)發(fā)生在無已知危險(xiǎn)因素的患兒中[3]，顯示現(xiàn)有的分型并不完善。放化療對(duì)患兒可能產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，且對(duì)患兒的遠(yuǎn)期影響并不明確。而精準(zhǔn)醫(yī)療提出了新的要求，需根據(jù)患兒預(yù)后進(jìn)行個(gè)體化治療，避免對(duì)高?；純褐委煵蛔慵皩?duì)低?；純褐委熯^度。因此，精確的判斷患兒預(yù)后及確定特異性的治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。

腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)由腫瘤細(xì)胞、駐留和招募的宿主細(xì)胞、相應(yīng)細(xì)胞的分泌產(chǎn)物和細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞成分組成。TME和腫瘤細(xì)胞相互作用，是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥等惡性發(fā)展的機(jī)制之一。隨著二代測(cè)序的發(fā)展，基于生物信息學(xué)的方法應(yīng)運(yùn)而生。ESTIMATE是一種計(jì)算腫瘤組織腫瘤純度和微環(huán)境成分的方法，通過基因表達(dá)譜來計(jì)算腫瘤組織的免疫/基質(zhì)/總評(píng)分[4]。有助于明確TME在許多癌癥中的重要性，如肺癌和乳腺癌[5-6]。免疫浸潤算法則可以進(jìn)一步直接通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估各種免疫細(xì)胞比例，顯示了較好的準(zhǔn)確性。目前主要由兩種算法來評(píng)估免疫浸潤，一是基于標(biāo)記基因的類似單樣本基因集富集分析(ssGSEA)的算法，MCPcounter為其中代表[7]；另一種是基于反卷積的算法，經(jīng)典的有EPIC[8]。反卷積方法的一個(gè)限制是易受背景預(yù)測(cè)的影響。因此，本研究選擇了基于標(biāo)記基因的MCPcounter算法測(cè)試WT中免疫細(xì)胞的浸潤模式，并評(píng)估其與臨床特征和預(yù)后的關(guān)系[7]，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

采用R軟件(R4.0.1)的TCGAbiolink包[9]從腫瘤基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫下載WT(TARGET-WT)mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)。篩選標(biāo)準(zhǔn)：(1)來自原發(fā)腫瘤及癌旁正常組織；(2)同時(shí)具有mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)。本研究共納入130份標(biāo)本，包括124份腫瘤組織標(biāo)本和6份癌旁正常組織標(biāo)本。收集腫瘤組織標(biāo)本的臨床數(shù)據(jù)為：女71例，男53例；診斷年齡156 d至15.7歲，中位診斷年齡為4.2歲。根據(jù)國際WT分期系統(tǒng)分期，Ⅰ期16例，Ⅱ期49例，Ⅲ期46例，Ⅳ期13例；根據(jù)COG危險(xiǎn)分層，高危型66例，低危型58例。本研究的所有數(shù)據(jù)均來自公共數(shù)據(jù)庫。

1.2 方法

1.2.1免疫/基質(zhì)/總評(píng)分及其與患者預(yù)后的關(guān)系

使用R軟件ESTIMATE包[4]評(píng)估每份標(biāo)本的基質(zhì)評(píng)分、免疫評(píng)分及相加的總評(píng)分。所有標(biāo)本根據(jù)評(píng)分中位數(shù)分為高評(píng)分組和低評(píng)分組，使用Kaplan-Meier(KM)生存曲線分析評(píng)分與預(yù)后的關(guān)系。

1.2.2差異表達(dá)基因(DEGs)的篩選及富集分析

使用R軟件的edgeR包[10]比較免疫評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分及總評(píng)分高、低組的DEGs，以|Log2FC|>1和P<0.05篩選差異基因。用Peatmap、ggplot2包繪制熱圖和火山圖。采用clusterProfiler軟件包[11]對(duì)DEGs進(jìn)行基因本體論(GO)分析[12]和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析[13]。

1.2.3單因素及多因素回歸分析

采用KM生存曲線及單因素Cox模型確定TME相關(guān)DEGs表達(dá)與預(yù)后之間的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步將單因素Cox分析P<0.01的變量納入多因素Cox回歸分析建立預(yù)后模型。采用KM曲線、受試者工作特征(ROC)曲線、校正曲線、決策曲線及生存狀態(tài)圖評(píng)價(jià)模型的預(yù)測(cè)能力。

1.2.4免疫細(xì)胞浸潤模式

TIMER2.0[14]合并了多種不同算法用于評(píng)估腫瘤的免疫細(xì)胞浸潤情況。本研究采用MCPcounter算法，評(píng)估包括總T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、髓樣樹突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞9種細(xì)胞[7]。

1.2.5免疫細(xì)胞與臨床相關(guān)性

采用R軟件合并臨床數(shù)據(jù)與免疫細(xì)胞浸潤數(shù)據(jù)，GrphPad Prism8.0.2軟件評(píng)估免疫細(xì)胞在癌旁正常組織標(biāo)本和腫瘤組織標(biāo)本中的差異及其與性別、年齡的關(guān)系。同時(shí)采用R軟件繪制KM曲線評(píng)估各種免疫細(xì)胞與生存的關(guān)系。

1.2.6T淋巴細(xì)胞相關(guān)基因

通過相關(guān)性分析研究與T淋巴細(xì)胞數(shù)量具有相關(guān)性的基因，相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值|r|>0.5，P<0.05定義為相關(guān)基因，其中|r|>0.8定義為強(qiáng)相關(guān)。

2 結(jié) 果

2.1 ESTIMATE評(píng)分與預(yù)后的相關(guān)性

從TCGA數(shù)據(jù)庫下載的RNA數(shù)據(jù)集來自124份WT腫瘤標(biāo)本和6份癌旁正常組織標(biāo)本，其中第1、2、3、4期腫瘤分別占14%、39%、37%和10%。通過ESTIMATE算法，患者的基質(zhì)評(píng)分范圍為-1 780.3～536.7分，免疫評(píng)分范圍為-2 362.7～-824.5分，總評(píng)分范圍為-2 750.5～-2 530.0分。根據(jù)評(píng)分中位數(shù)將患者分為高評(píng)分組(62例)和低評(píng)分組(62例)進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示：基質(zhì)評(píng)分和總評(píng)分高的患者生存時(shí)間較評(píng)分低的患者長(P=1.973×10-3、1.718×10-3)，見圖1A、C；高免疫評(píng)分和低免疫評(píng)分患者生存時(shí)間無明顯差異(P=0.991 1)，見圖1B。

A：不同基質(zhì)評(píng)分的生存曲線；B：不同免疫評(píng)分的生存曲線；C：不同總評(píng)分的生存曲線。

2.2 DEGs鑒定

根據(jù)評(píng)分中位數(shù)將患者分為兩組，高評(píng)分組作為對(duì)照組?；|(zhì)評(píng)分低組有922個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，92個(gè)基因表達(dá)上調(diào)；免疫評(píng)分低組有873個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，52個(gè)基因表達(dá)上調(diào)；總評(píng)分低組有988個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，80個(gè)基因表達(dá)上調(diào)(P<0.05，|log2FC|>1.0)。熱圖和火山圖顯示高、低基質(zhì)評(píng)分不同的基因表達(dá)譜，見圖2。總評(píng)分DEGs更接近于基質(zhì)評(píng)分DEGs結(jié)果。

A：熱圖；B：火山圖。

2.3 GO分析和KEGG富集分析

分別采用基于免疫評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分及總評(píng)分的DEGs進(jìn)行GO分析和KEGG富集分析。基質(zhì)評(píng)分的DEGs在腎素分泌、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)通路、鈣通道信號(hào)通路等富集，見圖3。根據(jù)免疫評(píng)分確定的DEGs通路包括細(xì)胞因子受體交互、抗原加工提呈、核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路?？傇u(píng)分和基質(zhì)評(píng)分DEGs相似，其富集通路也較為接近。

A：差異基因的KEGG富集分析；B：差異基因的GO富集分析。

2.4 預(yù)后模型的建立與驗(yàn)證

考慮到基質(zhì)評(píng)分和總評(píng)分與預(yù)后相關(guān)，而免疫評(píng)分與預(yù)后無明顯相關(guān)性，將基質(zhì)評(píng)分和總評(píng)分相關(guān)DEGs取交集得到928個(gè)共同DEGs。對(duì)共同DEGs進(jìn)行KM生存分析和單因素Cox回歸分析，計(jì)算出175個(gè)基因與WT患者生存相關(guān)。進(jìn)一步將P<0.01的17個(gè)基因行逐步多元Cox回歸分析解決共線性問題，構(gòu)建預(yù)后公式。 5個(gè)基因被納入最終變量，分別為C10orf71、FMOD、REN、ST6GALNAC1、GABRA5,對(duì)這5個(gè)基因繪制了KM曲線,結(jié)果顯示，各基因高、低表達(dá)患者生存時(shí)間均有明顯差異(P=1.191×10-2、3.607×10-2、5.309×10-3、1.417×10-2、2.678×10-4)，見圖4。多因素cox回歸結(jié)果見表1。

表1 多因素COX分析各基因與預(yù)后的關(guān)系

A：C10orf71基因高、低表達(dá)的生存曲線；B：FMOD基因高、低表達(dá)的生存曲線；C：GABRA5基因高、低表達(dá)的生存曲線；D：REN基因高、低表達(dá)的生存曲線；E：ST6GALNAC1基因高、低表達(dá)的生存曲線。

根據(jù)預(yù)后模型對(duì)患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，KM生存曲線顯示：與低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者比較，高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者死亡率更高(P=3.678×10-5)，見圖5A；預(yù)后模型預(yù)測(cè)3年和5年生存率的ROC曲線下面積分別為0.735、0.771，見圖5B、C。校正曲線顯示預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際較一致，且比較穩(wěn)定，見圖6；決策曲線表明根據(jù)預(yù)測(cè)模型可獲得對(duì)患者預(yù)后判斷的凈獲益，而且該模型對(duì)患者遠(yuǎn)期預(yù)測(cè)更優(yōu)(圖7)，與ROC曲線結(jié)果一致。生存狀態(tài)圖顯示隨著風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分增加，患者死亡率上升，見圖8。

2.5 免疫浸潤模式

采用MCPcounter計(jì)算130份標(biāo)本(124份腫瘤標(biāo)本和6份癌旁正常組織標(biāo)本)的總T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、髓樣樹突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞共9種細(xì)胞的浸潤數(shù)量。配對(duì)樣本t檢驗(yàn)顯示，癌旁組織中T淋巴細(xì)胞、髓樣樹突狀狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量明顯高于腫瘤組織(P<0.05)，見圖9A；而CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量在兩組間無明顯差異(P>0.05)。

A：基于危險(xiǎn)評(píng)分的KM生存曲線；B：預(yù)后模型預(yù)測(cè)3年生存率的ROC曲線；C：預(yù)后模型預(yù)測(cè)5年生存率的ROC曲線。

A：3年校正曲線；B：5年校正曲線。

圖7 預(yù)后模型的3年及5年決策曲線

2.6 免疫細(xì)胞與臨床的相關(guān)性

采用KM生存曲線評(píng)估124份腫瘤組織標(biāo)本中免疫細(xì)胞與生存的相關(guān)性，結(jié)果顯示T淋巴細(xì)胞數(shù)量與患者生存相關(guān)(P<0.05)，腫瘤中有較高T淋巴細(xì)胞浸潤的患者顯示更好的預(yù)后，見圖9C。進(jìn)一步分析年齡、性別與免疫細(xì)胞的關(guān)系，提示免疫細(xì)胞數(shù)量與性別無關(guān)，年齡與免疫細(xì)胞的浸潤存在一定相關(guān)性，3歲以下患者中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量明顯高于3歲及以上的患者(P<0.05)，見圖9B。

圖8 預(yù)后模型的生存狀態(tài)圖

A：WT組織及癌旁組織不同免疫細(xì)胞浸潤的差異；B：不同年齡WT患者免疫細(xì)胞浸潤的差異；C：基于T淋巴細(xì)胞浸潤數(shù)量的KM生存曲線。

2.7 免疫細(xì)胞與基因表達(dá)的相關(guān)性

由于T淋巴細(xì)胞數(shù)量在癌旁組織中與腫瘤組織中有明顯差異，并且與預(yù)后相關(guān)，進(jìn)一步通過相關(guān)性分析尋找T淋巴細(xì)胞相關(guān)基因，結(jié)果顯示：共1 135個(gè)基因與T淋巴細(xì)胞數(shù)量相關(guān)，特別是TMEM213、FXYD2、KCNJI1、ATP6V0A4、MAL、MUC1、TACSTD2、BLNK、DEFB1、TFAP2B、PROM2、SCIN、PAGR5、CLDN8、SCTR、CASR這16個(gè)基因的表達(dá)水平與T淋巴細(xì)胞數(shù)量呈強(qiáng)相關(guān)(|r|>0.8)。

3 討 論

WT是兒童常見的腹部腫瘤之一，通過手術(shù)、放療和化療等綜合治療有較高的治愈率[2]，但依然存在一些棘手的問題，如缺乏早期診斷的標(biāo)志物，高?；颊叩淖R(shí)別和治療等。WT由胚胎細(xì)胞而不是成熟的上皮細(xì)胞組成[2]，可分為不同的組織學(xué)類型，對(duì)預(yù)測(cè)患者預(yù)后有重要意義。此外，1 q和16 q的染色體擴(kuò)增對(duì)預(yù)后也有重要作用[15]。1 q擴(kuò)增被認(rèn)為是最有力的預(yù)后預(yù)測(cè)因子，有1 q擴(kuò)增的患者其生存時(shí)間明顯低于沒有1 q擴(kuò)增的患者[15]。COG基于年齡、腫瘤重量、1 q/16 q雜合度缺失和化療對(duì)肺轉(zhuǎn)移的反應(yīng)對(duì)患者進(jìn)行危險(xiǎn)分層[2]，但是不能很好地預(yù)測(cè)患者預(yù)后，近50%的復(fù)發(fā)發(fā)生在沒有高危因素的兒童[3]，因此，需要探索更多的具有預(yù)后意義的指標(biāo)。

目前，WT免疫治療效果不佳，可能與WT的TME有關(guān)。WT中可能存在免疫抑制的微環(huán)境[16]。TME與腫瘤細(xì)胞之間的雙向通信對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要，不僅腫瘤細(xì)胞有異質(zhì)性，TME也存在差異，這可能是影響腫瘤預(yù)后的因素之一[17]。靶向TME而不是腫瘤細(xì)胞本身提供了一種新的腫瘤治療策略。

本研究分析了腫瘤中基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的浸潤水平，用基質(zhì)評(píng)分和免疫評(píng)分來表示。結(jié)果顯示，基質(zhì)評(píng)分高的患者預(yù)后較好，但預(yù)后與免疫評(píng)分無明顯相關(guān)性。這也顯示腫瘤純度越高，惡性程度越強(qiáng)。而免疫評(píng)分與預(yù)后無關(guān)，推測(cè)可能原因?yàn)槊庖叱煞謱?duì)腫瘤的雙向作用抵消了這種影響，如巨噬細(xì)胞的M1及M2極化分別發(fā)揮抑制和促進(jìn)癌癥的作用[18]。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞也在腫瘤中發(fā)揮著重要作用[19]。通過差異分析發(fā)現(xiàn)，在評(píng)分高的組大多基因下調(diào)，而基質(zhì)評(píng)分和總評(píng)分越高預(yù)后越好，說明這些下調(diào)基因的功能可能與預(yù)后不良有關(guān)。富集分析顯示腎素分泌、PI3K/Akt信號(hào)通路、鈣通道信號(hào)通路等可能參與了這種免疫微環(huán)境的構(gòu)建，與免疫微環(huán)境的差異有關(guān)。作者對(duì)差異基因進(jìn)行了回歸分析，建立了基于5個(gè)基因的預(yù)后模型，其中REN/ST6GALNAC為危險(xiǎn)因素，提示降低REN/ST6GALNA基因表達(dá)也許可以起到抑制腫瘤的作用。REN基因編碼腎素，腎素是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的一部分，參與調(diào)節(jié)血壓和電解質(zhì)平衡。據(jù)統(tǒng)計(jì)，30%的WT患者有高血壓癥狀[20]，這種高血壓可能是由WT自主分泌的腎素導(dǎo)致[21]。鑒于REN基因表達(dá)水平升高對(duì)預(yù)后的不良影響，作者推測(cè)高血壓可能與患者預(yù)后有聯(lián)系。而一項(xiàng)單中心回顧性研究支持這一推測(cè)，其研究表明初診時(shí)的高血壓與WT患者的不良預(yù)后相關(guān)[22]。唾液酰基轉(zhuǎn)移酶是一系列參與糖鏈合成的酶。在惡性腫瘤中，ST6GALNAC1將唾液酸添加到絲氨酸或蘇氨酸殘基上的α-2,6鍵，在各種類型的腫瘤中發(fā)揮重要作用，如乳腺癌、結(jié)直腸癌[23-24]。有研究顯示，白細(xì)胞介素-13(IL-13)介導(dǎo)巨噬細(xì)胞刺激結(jié)腸細(xì)胞激活ST6GALNAC1的轉(zhuǎn)錄[25]?？傊狙芯恐械念A(yù)后模型揭示了可能受到微環(huán)境影響的與腫瘤轉(zhuǎn)歸相關(guān)的基因。

鑒于有研究顯示免疫對(duì)腫瘤進(jìn)展有重要影響，本研究進(jìn)一步探索了WT的免疫浸潤模式，顯示T淋巴細(xì)胞在WT腫瘤組織中較癌旁正常組織低且與預(yù)后相關(guān)，較高T淋巴細(xì)胞浸潤的患者預(yù)后好。這可能與腫瘤的免疫逃逸相關(guān)，惡性程度低的腫瘤更容易被T淋巴細(xì)胞識(shí)別并招募T淋巴細(xì)胞，進(jìn)而被T淋巴細(xì)胞殺傷[26]。蔡志明等[27]發(fā)現(xiàn)，預(yù)后不良患者免疫抑制更重，血液中CD3+T淋巴細(xì)胞更少。作者分析了與T淋巴細(xì)胞表達(dá)相關(guān)的基因，值得注意的是TMEM213顯示了和T淋巴細(xì)胞很好的相關(guān)性，但它并不是T淋巴細(xì)胞標(biāo)記物。TMEM213是一種跨膜蛋白，其功能并不明確，在腎、肺、唾液腺中表達(dá)，其他組織中幾乎不表達(dá)。關(guān)于這些基因與T淋巴細(xì)胞浸潤的相互關(guān)系值得進(jìn)一步研究。作者還發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞與年齡相關(guān)，3歲以下患者中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)量更多?？赡茉?yàn)槟[瘤初期免疫細(xì)胞浸潤良好，而隨著腫瘤細(xì)胞的發(fā)展，其免疫抑制作用使得局部免疫細(xì)胞越來越弱，從而影響患者預(yù)后。一項(xiàng)來自歐洲的大樣本研究顯示，0～3歲兒童的預(yù)后更好[1]。這提示也許早期發(fā)現(xiàn)、早期治療WT會(huì)帶來更大的收益。

綜上所述，本研究構(gòu)建了一個(gè)預(yù)測(cè)能力良好的預(yù)測(cè)模型，可以為判斷WT患者預(yù)后提供參考，并發(fā)現(xiàn)REN基因與患者預(yù)后相關(guān)，為分子靶向治療提供了一定的思路。另外，本研究顯示T淋巴細(xì)胞在WT中發(fā)揮了重要作用，這值得進(jìn)一步的探索。