IL-6表達水平及其基因啟動子區(qū)多態(tài)性與膿毒癥的相關(guān)性研究*

王聰懿，李 剛，張長喜，周瑞琴，吳慶琛△

(1.重鋼總醫(yī)院胸外科，重慶 400084;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心胸外科 400016)

膿毒癥(sepsis)是常見的臨床急危重癥，是宿主對感染的反應(yīng)失調(diào)而致的危及生命的器官功能障礙，嚴重時會引起器官功能損害或衰竭，是誘發(fā)患者死亡的主要原因之一[1-2]。雖然膿毒癥的具體發(fā)病機制尚不清晰，但大量研究表明，其主要與體內(nèi)炎癥和免疫反應(yīng)失調(diào)相關(guān)[3-5]。白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是一種在感染早期淋巴細胞、單核/巨噬細胞等產(chǎn)生的多功能炎性因子，而IL-6又可促進多種炎性因子的釋放，使機體炎性反應(yīng)產(chǎn)生放大效應(yīng)[6-7]。IL-6基因啟動子區(qū)存在-174G/C、-572C/G 、-597G/A 位點等多個單核苷酸多態(tài)性 (single nucleotide polymorphism，SNP)，而這些多態(tài)性對IL-6表達產(chǎn)生影響，并與多種炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8-9]。相關(guān)研究顯示，膿毒癥患者體內(nèi)IL-6水平明顯升高，但IL-6基因多態(tài)性與膿毒癥發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系尚不清晰。因此，本研究旨在通過研究膿毒癥患者的臨床資料，探討IL-6基因啟動子區(qū)多態(tài)性與膿毒癥發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系，以期從基因水平分析其機制，為膿毒癥的預(yù)防和治療提供一定的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年1月至2021年1月重鋼總醫(yī)院收治的膿毒血癥患者113例為觀察組，并選取同期于該院體檢健康人群132例作為對照組。并根據(jù)2016年《第三版膿毒癥與感染性休克定義國際共識》的診斷標準和分型方法，將113例膿毒癥患者分為膿毒癥組(n=51)和膿毒癥休克組(n=62)；排除年齡<18歲、患惡性腫瘤、人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染、慢性肝腎疾病、自身免疫性疾病或入院前1個月內(nèi)接受免疫治療、抗感染治療及放化療的患者。本研究通過重鋼總醫(yī)院倫理委員會審查，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1標本的采集及處理

收集納入患者的年齡、性別、合并基礎(chǔ)病(高血壓、糖尿病、高脂血癥)等一般資料，采集患者外周血3 mL于乙二胺四乙酸二鉀(ethylenediamine tetraacetic acid dipotassium，EDTA-K2)真空抗凝管，混勻，離心(3 000 r/min)10 min，分離血漿和細胞，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2標本測定

應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血漿IL-6、降鈣素原(procalcitonin，PCT)水平，嚴格按照試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)說明進行操作。

1.2.3IL-6基因多態(tài)性檢測

用人全血基因組DNA提取試劑盒 (賽默飛公司)從白細胞中提取出基因組DNA，采用聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)技術(shù)對IL-6基因啟動子區(qū)-174G/C、-572C/G 、-597G/A位點的基因多態(tài)性進行分析。采用同一對引物(上海生工生物工程股份有限公司)，上游引物為：5′-AAG TGG GCT GAA GCA GGT GA-3′,下游引物為5′-GTT TCC TCT GAC TCC ATC GCA-3′。PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次，72 ℃再延伸5 min。經(jīng)鑒定純化后，PCR擴增產(chǎn)物用對應(yīng)的限制性酶進行酶切，酶切產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，最后通過凝膠成像系統(tǒng)判斷結(jié)果并分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 對照組與觀察組一般資料比較

對照組與觀察組在性別、年齡、合并高血壓、高脂血癥、糖尿病方面比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組對象一般資料比較

2.2 對照組與觀察組IL-6和PCT的表達水平比較

觀察組中IL-6和PCT的血漿水平明顯高于對照組(P<0.05)，且膿毒癥休克組IL-6和PCT的血漿水平明顯高于膿毒癥組(P<0.05)，見表2。

表2 各組對象IL-6和PCT表達水平比較

2.3 IL-6基因啟動子區(qū)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗及等位基因分布頻率比較

IL-6基因啟動子區(qū)-174G/C位點基因型均為GG，未檢測到GC和CC；-597G/A位點基因型為GG、GA和AA；-572C/G位點基因型有CC、CG和GG ，研究對象IL-6基因-597G/A和-572C/G位點基因型/等位基因的分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，見表3。IL-6基因多態(tài)性位點-597G/A基因型/等位基因分布比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；-572C/G的基因型及等位基因分布兩組間有明顯差異(P<0.05)。PCR-RELP電泳圖見圖1。

表3 對照組與觀察組基因Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗及布頻率比較

組別n-572C/G基因[觀察值(理論值)]CCCGGGχa2/Pa等位基因CG對照組13245(40.93)57(65.18)30(25.93)2.061/0.157147117觀察組11324(19.13)45(54.73)44(39.14)3.572/0.05993133χb2/Pb9.033/0.01110.289/0.001

Lane1、Lane4：GG基因型(202、94 bp)；Lane2：CC基因型(296 bp)；Lane3：CG基因型(296、202、94 bp)。

2.4 不同膿毒癥患者IL-6基因位點基因型及等位基因頻率分布情況比較

膿毒癥休克組與膿毒癥組患者中的IL-6基因-174G/C和-597G/A位點比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而膿毒癥休克組患者IL-6基因-572C/G位點基因型CC及等位基因C頻率明顯低于膿毒癥組，兩組患者IL-6基因-572C/G位點基因型CC及等位基因C頻率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 不同膿毒癥患者IL-6基因型及等位基因頻率分布比較(n)

2.5 IL-6基因-572C/G單倍體基因型頻率與膿毒癥的相關(guān)性

Logistic回歸分析結(jié)果顯示，GG基因型是CC基因型患病風(fēng)險的2.427倍(OR=2.427，P<0.05)，顯性模型中，CG+GG基因型是CC型患病風(fēng)險1.775倍；隱性模型中，GG基因型是CC+CG型患病風(fēng)險的2.078倍，見表5。

表5 Logistic回歸分析單倍體基因型頻率與膿毒癥的關(guān)系(n)

2.6 IL-6基因-572C/G位點多態(tài)性對膿毒癥患者炎性因子表達水平的影響

IL-6基因-572G/C位點基因型為CC膿毒癥患者的血漿IL-6和PCT水平低于基因型為CG/GG膿毒癥患者(P<0.05)，見表6。

表6 IL-6基因-572G/C位點多態(tài)性對膿毒癥組炎性因子表達量的影響

3 討 論

膿毒癥是常見的臨床急危重癥，嚴重威脅患者的健康和生命，每年導(dǎo)致大量患者死亡，流行病學(xué)資料顯示，膿毒癥發(fā)病率呈逐年上升態(tài)勢，近年來盡管在膿毒癥的臨床治療方面取得了一定的進步，但其病死率仍較高，且其診治費用高昂，對患者的健康和社會經(jīng)濟發(fā)展產(chǎn)生了較大影響，因此，膿毒癥一直是臨床研究的重點課題。已有研究表明，膿毒癥患者在因感染引起的全身炎性反應(yīng)時，機體釋放大量炎性介質(zhì)，引發(fā)炎癥的瀑布樣反應(yīng)，最終可能導(dǎo)致膿毒性休克，甚至引起多器官功能障礙綜合征(MODS)[6,10-12]。PCT是降鈣素的前肽，是炎癥活動和膿毒癥診斷的可靠指標，美國傳染病協(xié)會和美國危重病學(xué)會聯(lián)合推薦PCT作為區(qū)別膿毒血癥和非感染性的全身炎性反應(yīng)的輔助診斷標記物[13]，由于其準確性高靈敏度好現(xiàn)已作為醫(yī)院感染患者常規(guī)檢測項目。IL-6由活化的單核細胞、成纖維細胞等分泌，正常情況下水平較低，在感染患者中水平明顯升高，是炎癥應(yīng)答中重要的炎性介質(zhì)，與嚴重全身感染密切相關(guān)，其表達水平受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的嚴格調(diào)控。有研究表明，IL-6基因啟動子區(qū)單核苷酸突變對IL-6的表達水平產(chǎn)生影響。有研究顯示，血清IL-6等炎性因子水平變化與膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可作為膿毒癥的檢測指標之一[14-17]。但IL-6基因啟動子區(qū)多態(tài)性與膿毒癥的相關(guān)性尚不清楚。因此，本研究通過探討膿毒癥發(fā)生、發(fā)展與IL-6基因啟動子區(qū)多態(tài)性之間的關(guān)系，以期為膿毒癥的臨床防治提供指導(dǎo)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者PCT和炎性因子IL-6血漿水平明顯高于對照組，并且隨著膿毒癥病情程度的加重而增高，且IL-6和PCT的變化趨勢高度一致，表明可通過關(guān)注膿毒癥患者血漿PCT和炎性因子IL-6的水平變化，來評估膿毒癥的進展情況。本研究進一步分析IL-6基因多態(tài)性位點-572C/G的基因型及等位基因C頻率的分布，發(fā)現(xiàn)兩組之間存在明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，與膿毒癥組比較，基因型CC及等位基因C頻率在膿毒癥休克組明顯偏低，提示IL-6啟動子區(qū)基因多態(tài)性位點-572C/G在膿毒癥的進展過程中發(fā)揮重要作用。進一步通過logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，GG基因型是CC基因型患病風(fēng)險的2.427倍，表明GG基因型是膿毒癥的易感基因型，CC基因型是保護基因型。IL-6基因-572G/C位點基因型為CC膿毒癥患者的血漿IL-6和PCT水平低于基因型為CG/GG膿毒癥患者(P<0.001)，說明其多態(tài)性影響PCT和促炎性因子IL-6的水平，抑制其表達，可減輕炎性反應(yīng)。因此，可對膿毒癥患者進行早期IL-6基因-572C/G多態(tài)性檢測，及早采取有效干預(yù)措施，抑制病情的進展。

綜上所述，IL-6基因-572C/G多態(tài)性與膿毒癥的發(fā)病風(fēng)險具有相關(guān)性，且與膿毒癥的進展明顯相關(guān)，其多態(tài)性可影響PCT和炎性因子IL-6表達水平，但其機制還有待進一步研究。