胃癌患者癌組織及血清中l(wèi)ncRNA-GC1的表達(dá)及其對化療耐藥性的影響*

陳 域，郭 欣，陳蘆斌，石秦川,劉靖圓

(空軍第九八六醫(yī)院普通外科，西安 710054)

胃癌是最常見的消化道腫瘤，在我國發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重危害患者的生命健康[1-2]。內(nèi)鏡活檢是目前診斷胃癌的金標(biāo)準(zhǔn)，然而由于患者檢查時的不適和檢查成本高昂，早期胃癌尤其是無癥狀個體篩查是臨床實踐中的一大困難[3]。順鉑是當(dāng)前治療胃癌的重要化療藥物之一，可不同程度地改善患者預(yù)后，但化療耐藥的發(fā)生阻礙其應(yīng)用[4-5]。因此，探索具有高靈敏度和特異度的胃癌診斷新方法及胃癌細(xì)胞化療耐藥的分子機(jī)制，尋找有效的治療靶點是當(dāng)前的重要課題之一[6]。近年來，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)因功能多樣性、相對穩(wěn)定性及易檢測性得到了許多研究者的關(guān)注[5]。lncRNA在細(xì)胞增殖、分化及凋亡等過程的調(diào)控中具有重要作用，已被證實可作為腫瘤篩查、治療效果及預(yù)后評估的潛在靶點[7-8]。研究表明，與胃癌相關(guān)的長鏈非編碼RNA-GC1(long non-coding RNA-GC1，lncRNA-GC1)作為一種RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄物，可通過與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase，HAT)和賴氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶2A (K-lysine acetyltransferase 2A，KAT2A)結(jié)合，激活與靶基因超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2，SOD2)有關(guān)的組蛋白修飾，從而促進(jìn)胃癌的進(jìn)展[9]。本研究通過檢測胃癌患者癌組織和血清中l(wèi)ncRNA-GC1的表達(dá)水平，探討lncRNA-GC1在胃癌篩查中的價值，以及其對胃癌患者化療耐藥性的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年1月至2021年1月于本院行手術(shù)治療的胃癌患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)組織病理學(xué)確診為胃癌；(2)年齡18～80周歲；(3)患者自愿參與研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并嚴(yán)重心、腦、肝、腎疾??；(2)合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤；(3)臨床病理資料完整。最終，納入86例胃癌患者(胃癌組)，其中男54例，女32例，平均年齡(61.25±5.21)歲。同時，納入同期在本院體檢的86例健康體檢者作為健康對照組，其中男55例，女31例，平均年齡(61.82±5.54)歲。兩組性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，均衡可比。本研究所有程序均符合赫爾辛基宣言，獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)(KYLL2020-986-22)，所有患者均自愿參與研究且簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本采集及資料收集

取所有胃癌患者術(shù)前和健康對照組血液標(biāo)本2 mL，置于無抗凝劑的真空采血管中，3 000 r/min離心5 min，取上層血清，置于-80 ℃條件下待用。術(shù)中取患者胃癌組織和癌旁正常組織(距離癌組織≥5 cm)標(biāo)本，在冰上剪碎、研磨，制成懸液，于-80 ℃條件下保存。收集胃癌患者的性別、年齡、腫瘤最大徑、浸潤程度、有無神經(jīng)侵犯、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期等臨床病理學(xué)特征。

1.2.2實時熒光定量PCR測定lncRNA-GC1表達(dá)水平

提取研究對象組織(細(xì)胞)和血清標(biāo)本總RNA，采用Nano-Drop 1000分光光度計檢測，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存待用。參照文獻(xiàn)[9]設(shè)計引物，由上海天昊生物科技有限公司合成。lncRNA-GC1上游引物序列為 5′-TGG GGT AAC TTA GCA GTT TCA AT-3′，下游引物序列為5′-GGC AAG CAG TAA TCT TAC ATG ACA C-3′，片段大小110 bp。內(nèi)參基因U6的上游引物序列為5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物序列為5′- AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′，產(chǎn)物片段大小94 bp。反應(yīng)體系包括0.75 μL E×12 TaqMan⑧基因表達(dá)檢測液，7.5 μL TaqMan PCR反應(yīng)混合液，3 μL cDNA模板，再加雙蒸水(ddH2O)至15 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40個循環(huán)，然后用熒光定量PCR儀定量測定。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對lncRNA-GC1表達(dá)水平進(jìn)行相對定量分析，應(yīng)用2-ΔΔCT法計算結(jié)果。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染細(xì)胞系構(gòu)建

選取胃癌細(xì)胞MKN-45作為實驗對象，來自美國典型培養(yǎng)物中心(American Type Culture Collection，ATCC)細(xì)胞庫。37 ℃，5% CO2條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。將lncRNA-GC1全長序列克隆進(jìn)pSin載體上，進(jìn)一步構(gòu)建慢病毒載體并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系MKN-45 GC1，對照細(xì)胞不進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理(MKN-45 Vec)。48 h后應(yīng)用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.2.4噻唑藍(lán)(MTT)實驗檢測細(xì)胞活力

將胃癌細(xì)胞系MKN-45 GC1及其對照細(xì)胞MKN-45 Vec接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔種植細(xì)胞數(shù)為5×103個，每種細(xì)胞平行重復(fù)3孔，24 h后細(xì)胞培養(yǎng)基換成含0、3、6、12 μg/mL順鉑的培養(yǎng)基，48 h后進(jìn)行MTT實驗，檢測570 nm處吸光度(A570)值，以空白孔為參照評估各孔的增殖活力。

1.2.53-D細(xì)胞培養(yǎng)實驗檢測細(xì)胞增殖和生長能力

將胃癌細(xì)胞系MKN-45 GC1及其對照細(xì)胞MKN-45 Vec接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔種植細(xì)胞4×103個，培養(yǎng)基體積為500 μL，每種細(xì)胞平行重復(fù)3孔，在細(xì)胞種植后48 h更換含0.6 μg/mL順鉑的培養(yǎng)基處理細(xì)胞48 h，在第8天拍照檢測并定量分析細(xì)胞增殖能力。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 胃癌患者組織和血清lncRNA-GC1表達(dá)水平

胃癌患者癌組織lncRNA-GC1表達(dá)水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(1.45±0.16vs.0.82±0.07，t=15.362，P<0.001)，見圖1A；胃癌組血清lncRNA-GC1表達(dá)水平高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(0.78±0.13vs.0.54±0.05，t=6.887，P<0.001)，見圖1B。

A：胃癌患者癌組織與癌旁正常組織中l(wèi)ncRNA-GC1表達(dá)水平比較；B：胃癌組與健康對照組血清lncRNA-GC1表達(dá)水平比較。

2.2 胃癌組織lncRNA-GC1表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性

胃癌患者癌組織中l(wèi)ncRNA-GC1表達(dá)水平與腫瘤最大徑、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，腫瘤最大徑≥5 cm的患者癌組織lncRNA-GC1表達(dá)水平高于腫瘤最大徑<5 cm者，有神經(jīng)侵犯的患者癌組織lncRNA-GC1表達(dá)水平高于無神經(jīng)侵犯者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者癌組織lncRNA-GC1表達(dá)水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 胃癌組織lncRNA-GC1表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性

續(xù)表1 胃癌組織lncRNA-GC1表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性

2.3 胃癌患者血清lncRNA-GC1表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性

胃癌患者血清lncRNA-GC1表達(dá)水平與腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)，腫瘤直徑≥5 cm的患者血清lncRNA-GC1表達(dá)水平高于腫瘤直徑<5 cm者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者血清lncRNA-GC1表達(dá)水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，腫瘤分期Ⅲ+Ⅳ的患者血清lncRNA-GC1表達(dá)水平高于腫瘤分期Ⅰ+Ⅱ者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.4 血清lncRNA-GC1水平診斷胃癌的ROC曲線分析

ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清lncRNA-GC1水平診斷胃癌的ROC曲線下面積(AUC)為0.849[95%CI(0.790，0.907)，P<0.001]，靈敏度為83.0%，特異度為81.4%，見圖2。

圖2 血清lncRNA-GC1水平診斷胃癌的ROC曲線

2.5 lncRNA-GC1對胃癌細(xì)胞MKN-45增殖生長能力及順鉑耐藥性的影響

實時熒光定量PCR實驗結(jié)果顯示，MKN-45 GC1細(xì)胞lncRNA-GC1表達(dá)水平較MKN-45 Vec細(xì)胞明顯升高，見圖3A。MTT實驗結(jié)果表明，MKN-45 GC1細(xì)胞活力較MKN-45 Vec細(xì)胞明顯升高；在分別加入3、6、12 μg/mL順鉑后，MKN-45 GC1和MKN-45 Vec細(xì)胞的細(xì)胞活力均明顯下降，且MKN-45 GC1細(xì)胞活力均明顯高于MKN-45 Vec細(xì)胞，見圖3B。此外，3-D細(xì)胞培養(yǎng)實驗顯示，MKN-45 GC1細(xì)胞增殖能力明顯高于MKN-45 Vec細(xì)胞；在加入6 μg/mL順鉑后，兩種細(xì)胞增殖能力均受到抑制，且MKN-45 GC1細(xì)胞增殖能力高于MKN-45 Vec細(xì)胞，見圖3C。

表2 胃癌患者血清lncRNA-GC1表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性

A：MKN-45 GC1與MKN-45 Vec細(xì)胞lncRNA-GC1表達(dá)水平比較；B：MTT實驗檢測不同水平順鉑作用后MKN-45 GC1和MKN-45 Vec細(xì)胞活力比較；C：3-D細(xì)胞培養(yǎng)實驗檢測MKN-45 GC1和MKN-45 Vec細(xì)胞的增殖能力；a：P<0.01;b：P<0.05。

3 討 論

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，對人類健康造成了極大的威脅。然而，目前胃癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制和化療耐藥機(jī)制還未完全明確[10]。lncRNA已被證實在包括胃癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中表達(dá)異常[11]。顧秀玉等[12]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在胃癌患者癌組織和血清中的表達(dá)明顯增加，其表達(dá)水平與胃癌患者的腫瘤大小、分化程度、脈管癌栓、神經(jīng)侵犯及平均生存時間有關(guān)；部分lncRNA可作為胃癌篩查及預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。韓涵等[13]研究顯示，lncRNA-GC1在胃癌組織中明顯高表達(dá)，并且與患者的腫瘤體積大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理學(xué)分級具有相關(guān)性，此外，細(xì)胞實驗顯示lncRNA-GC1可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖生長和對順鉑的耐藥性。GUO等[14]在最近的研究中報道，lncRNA-GC1在胃癌患者血清外泌體中表達(dá)明顯增加，并且可作為肺癌早期診斷的無創(chuàng)性分子生物標(biāo)志物。本研究檢測了lncRNA-GC1在胃癌患者組織及血清中的表達(dá)水平，分析了其與患者臨床病理特征的相關(guān)性，評估了血清lncRNA-GC1作為胃癌篩查分子標(biāo)志物的可行性，并探討了lncRNA-GC1在胃癌細(xì)胞增殖和順鉑化療耐藥中的作用。

本研究結(jié)果顯示，胃癌患者癌組織lncRNA-GC1表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，血清lncRNA-GC1表達(dá)水平也明顯高于健康對照組，提示lncRNA-GC1表達(dá)水平升高可能與胃癌的發(fā)生機(jī)制有關(guān)。此外，胃癌患者癌組織lncRNA-GC1表達(dá)水平與腫瘤最大徑、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，血清lncRNA-GC1表達(dá)水平與腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)。既往研究顯示，腫瘤的疾病進(jìn)展在一定程度上與腫瘤大小、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)[15]。因此，lncRNA-GC1表達(dá)水平升高可能與胃癌的疾病進(jìn)展有關(guān)。盡管既往研究已表明血清外泌體lncRNA-GC1表達(dá)水平可作為肺癌早期診斷的有效分子標(biāo)志物[16-17]，但考慮到血清檢測快速、方便、廉價的優(yōu)勢，本研究應(yīng)用ROC曲線分析了血清lncRNA-GC1診斷胃癌患者的效能，結(jié)果顯示，血清lncRNA-GC1水平對胃癌的診斷效能較好，靈敏度為83.0%，特異度為81.4%，具有一定的臨床應(yīng)用價值。

本研究還進(jìn)行了細(xì)胞實驗，探究lncRNA-GC1對胃癌化療耐藥的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后的MKN-45 GC1細(xì)胞lncRNA-GC1水平明顯高于MKN-45 Vec細(xì)胞，說明轉(zhuǎn)染成功。MTT實驗結(jié)果表明，MKN-45 GC1細(xì)胞的細(xì)胞活力較MKN-45 Vec細(xì)胞明顯升高；加入順鉑后，MKN-45 GC1和MKN-45 Vec細(xì)胞的細(xì)胞活力均明顯下降，且MKN-45 GC1細(xì)胞活力高于MKN-45 Vec細(xì)胞。3-D細(xì)胞培養(yǎng)實驗顯示，MKN-45 GC1細(xì)胞的增殖能力明顯高于MKN-45 Vec細(xì)胞；加入6 μg/mL順鉑后，兩種細(xì)胞的增殖能力均受到抑制，且MKN-45 GC1細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于MKN-45 Vec細(xì)胞。以上結(jié)果表明，lncRNA-GC1可促進(jìn)胃癌細(xì)胞MKN-45的增殖生長，并促進(jìn)細(xì)胞對順鉑的耐藥。

本研究仍存在一些局限性：(1)所有研究對象均來自同一醫(yī)院，可能存在選擇偏倚；(2)納入患者的樣本量較?。?3)未進(jìn)行術(shù)前、術(shù)后及復(fù)發(fā)胃癌患者血清lncRNA-GC1表達(dá)水平的比較，對lncRNA-GC1在胃癌中診斷價值的評估還不夠全面。在今后的研究中會進(jìn)一步完善這些不足，以獲得更為準(zhǔn)確的結(jié)果。

綜上所述，lncRNA-GC1在胃癌患者組織和血清中表達(dá)上調(diào)，可作為胃癌篩查及預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物，并且體外細(xì)胞實驗表明lncRNA-GC1可促進(jìn)胃癌細(xì)胞MKN-45的增殖生長，促進(jìn)細(xì)胞對順鉑的耐藥。