定量沉默c-Met基因表達對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖和化療敏感性的影響*

王金西，郭曉娟，程錦紅，張紹東，焦保庭

(1.河北省邯鄲市第一醫(yī)院普外四科 056002；2.河北省邯鄲市中心醫(yī)院病理科 056001)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率位居高位，且發(fā)病率有逐年升高的趨勢，逐漸成為影響女性健康的首位惡性腫瘤[1]?；熓桥R床治療乳腺癌的主要手段之一，但隨著化療藥物的長期應(yīng)用，患者易對化療藥物產(chǎn)生抗藥性,影響化療的效果[2]。這一現(xiàn)象嚴(yán)重影響了乳腺癌患者的生存質(zhì)量及疾病預(yù)后[3-4]。作為傳統(tǒng)的化療藥物，表阿霉素被認(rèn)為是治療乳腺癌最常用和有效的藥物。然而，如何提高癌細(xì)胞對表阿霉素藥物的敏感性目前已成為一個重要的臨床問題。c-Met是一種原癌基因，屬于酪氨酸激酶受體家族，其配體為肝細(xì)胞生長因子(hepato-cyte growth factor，HGF)[5]，c-Met與HGF結(jié)合形成同源二聚體，可使酪氨酸磷酸化并激活下游信號通路。c-Met基因失調(diào)或活化與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系。過去的幾十年中，多項研究證實c-Met在乳腺癌組織中過表達，與其相關(guān)的信號通路與乳腺癌的發(fā)展、預(yù)后密切相關(guān)[6]。QUE等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在骨髓瘤細(xì)胞中抑制c-Met的表達可以提高腫瘤細(xì)胞對阿霉素化療的敏感性。嚴(yán)婧等[8]研究報道，抑制c-Met信號通路可增加白血病細(xì)胞株對硼替佐米的化療敏感性。因此，針對c-Met的靶向治療可以為腫瘤耐藥后的治療提供新的策略及方法。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株購于上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫，胎牛血清購于美國Hyclone公司，RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基購于邁晨科技(北京)有限公司，嘌呤霉素購于美國Sigma公司，鼠抗人c-Met單抗購于德國CalBiochem公司，噻唑藍(MTT)及二甲基亞砜(DMSO)購于北京索萊寶生物技術(shù)有限公司，鼠抗人Cleaved 多聚二磷酸腺苷(ADP)-核糖聚合酶(PARP)、Cleaved 天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)一抗、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔二抗IgG 均購于美國Cell signaling公司；兔抗人三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)單抗購于美國Santa Cruz公司。流式細(xì)胞檢測用試劑盒購于美國Invitrogen公司；表阿霉素購于美國Sigma公司。

1.2 方法

首先參考文獻查找針對c-Met的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)，TA載體構(gòu)建并篩選沉默效果最佳的shRNA，進行慢病毒包裝，收集病毒液感染MDA-MB-231細(xì)胞，用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定細(xì)胞系PSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231，鑒定穩(wěn)定細(xì)胞系[9]。

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

MDA-MB-231細(xì)胞(空白對照)、PSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231細(xì)胞、PSD400-scramble-MDA-MB-231細(xì)胞(陰性對照)均培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d更換培養(yǎng)基，0.25%的胰酶消化傳代。

1.2.2篩選最佳多西環(huán)素(Doxycycline，DOX)誘導(dǎo)濃度

選擇對數(shù)增長期的pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板中，5×105/孔,向培養(yǎng)基中加入DOX進行誘導(dǎo)，終濃度分別調(diào)整為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μg/mL。培養(yǎng)72 h后提取細(xì)胞蛋白，進行Western blot檢測，根據(jù)c-Met蛋白表達水平篩選出最適合的DOX濃度。最終選擇0.4 μg/mL。

1.2.3細(xì)胞誘導(dǎo)

將對數(shù)生長期的3種細(xì)胞用0.25%胰酶消化，接種于6孔板中，每孔加入5×105個細(xì)胞、2 mL培養(yǎng)基，設(shè)置復(fù)孔，加入DOX，使終濃度為0.4 μg/mL，吹打均勻，誘導(dǎo)48 h。

1.2.4MTT法檢測適當(dāng)敲除c-Met基因后對細(xì)胞增殖的影響

把3種細(xì)胞接種在6孔板中，每孔接種4×105個細(xì)胞，每種細(xì)胞分成兩組即有DOX誘導(dǎo)組(+DOX)和無DOX誘導(dǎo)組(-DOX)。待細(xì)胞貼壁后加入DOX(0.4 μg/mL)進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)3 d后將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種1.5×103個細(xì)胞。設(shè)置6個實驗組(+DOX shRNA、+DOX scramble、+DOX MDA-MB-231、-DOX shRNA、-DOX scramble、-DOX MDA-MB-231)，每組設(shè)5個復(fù)孔，6個觀察時間點。為防止邊緣效應(yīng)周邊各孔加入200 μL的磷酸鹽緩沖液(PBS)。各組細(xì)胞在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。分別于12、24、48、72、96、120 h時間點檢測。檢測時每孔加入 20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，在37 ℃溫箱避光孵育4 h，然后去掉96孔板中的培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，將96孔板振蕩10 min。用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長下的吸光度(A490)值，并處理數(shù)據(jù)。

1.2.5MTT檢測細(xì)胞對表阿霉素的化療敏感性

將誘導(dǎo)的3種細(xì)胞及對照組細(xì)胞胰酶消化后接種于96孔板中，每孔按照2×103/mL接種，分別加入終濃度為0、0.25、0.5、1、5、10 μg/mL的表阿霉素藥物，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，并設(shè)置調(diào)零孔及空白對照孔。用MTT法檢測A490值。計算細(xì)胞存活率。使用GraphPad Prism6.0軟件計算細(xì)胞的藥物半數(shù)抑制濃度(IC50)并繪制細(xì)胞存活率曲線。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布

將誘導(dǎo)的3種細(xì)胞及對照組細(xì)胞胰酶消化后接種于6孔板中，每孔接種細(xì)胞5×105個，置于37 ℃、5% CO2溫箱孵育24 h后去掉原培養(yǎng)基，加入含表阿霉素藥物的培養(yǎng)基，使終濃度為5 μg/mL，培養(yǎng)48 h后去掉原培養(yǎng)基，用無酶消化液[含0.04%乙二胺四乙酸(EDTA)]處理細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，用PBS洗滌并重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL，取1 mL單細(xì)胞懸液，離心去上清液，加入1 mL 70%的預(yù)冷乙醇，4 ℃固定過夜。染色前用PBS洗滌2次，加入100 mg/L核糖酸酶A(RNaseA)，37 ℃水浴30 min。再加入500 μL(50 mg/L)碘化丙啶(PI)染色液混勻，4 ℃避光反應(yīng)30 min后，轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞儀進行檢測，每組重復(fù)3次。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，計算 G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞百分比。

1.2.7Western blot檢測細(xì)胞中PARP、caspase-3表達

將3種細(xì)胞于37 ℃、5% CO2孵育24 h后棄去原培養(yǎng)基，加入含終濃度為5 μg/mL表阿霉素的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，每組設(shè)3個復(fù)孔。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、電轉(zhuǎn)膜至甲醛預(yù)處理過的聚偏氟乙烯(PVDF)膜密封2 h，洗膜并分別以鼠抗人Cleaved PARP 、Cleaved caspase-3單克隆抗體作為一抗，在4 ℃下孵育過夜，洗膜加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，于室溫下孵育2 h。再用電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯示，收集影像，以GAPDH作為內(nèi)參，采用凝膠圖像處理系統(tǒng)軟件分析各組的條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 篩選最佳DOX誘導(dǎo)濃度

將嘌呤霉素篩選出來的穩(wěn)定細(xì)胞系pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231用不同濃度的DOX進行誘導(dǎo)，然后Western blot檢測c-Met蛋白表達，結(jié)果顯示c-Met蛋白表達水平隨著DOX濃度增加逐漸降低，當(dāng)DOX濃度在0.5 μg/mL時，c-Met蛋白幾乎不表達。為了避免因c-Met基因被完全敲除而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，選擇DOX濃度為0.4 μg/mL，見圖1。

shRNA：pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231細(xì)胞組；scramble：pSD400-scramble-MDA-MB-231細(xì)胞組。

2.2 適當(dāng)沉默c-Met基因后對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響

3種細(xì)胞株接種在96孔板中并加入DOX(濃度：0.4 μg/mL)進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時間分別為12、24、48、72、96、120 h，在各時間點進行MTT檢測，讀取A490值。由于可誘導(dǎo)shRNA是建立在四環(huán)素操縱子(TetO)系統(tǒng)基礎(chǔ)上的慢病毒載體，穩(wěn)定細(xì)胞系在常規(guī)培養(yǎng)時與一般細(xì)胞無明顯差異，當(dāng)培養(yǎng)基中加入DOX后，便可誘導(dǎo)穩(wěn)定細(xì)胞系合成shRNA，從而對目的基因進行定量沉默。實驗結(jié)果顯示，pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231細(xì)胞株中經(jīng)過DOX誘導(dǎo)的細(xì)胞(有DOX誘導(dǎo)組)c-Met基因被適當(dāng)沉默，細(xì)胞增殖受到抑制，隨著時間的延長抑制越來越明顯，與無DOX誘導(dǎo)組相比有明顯差異(P<0.05)；而陰性對照組及空白組細(xì)胞無論有無DOX誘導(dǎo)，細(xì)胞增殖無明顯差異(P>0.05)。DOX誘導(dǎo)后pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231細(xì)胞c-Met基因被適當(dāng)沉默，較pSD400-scramble-MDA-MB-231細(xì)胞增殖明顯受到抑制(P<0.05)，見圖2。

A：加/不加DOX適當(dāng)沉默c-Met后對pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231細(xì)胞增殖的變化；B：加/不加DOX對pSD400-scramble-MDA-MB-231細(xì)胞增殖的變化；C：加/不加DOX對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的變化；D：DOX誘導(dǎo)后pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231細(xì)胞和pSD400-scramble-MDA-MB-231細(xì)胞增殖的變化；shRNA-c-Met:pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231細(xì)胞;scramble:pSD400-scramble-MDA-MB-231細(xì)胞。

2.3 適當(dāng)沉默c-Met基因后MDA-MB-231細(xì)胞對表阿霉素的化療敏感性檢測

DOX誘導(dǎo)細(xì)胞后，給予不同濃度表阿霉素作用，采用MTT法檢測其對細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果顯示，適當(dāng)沉默MDA-MB-231細(xì)胞c-Met基因表達(有DOX誘導(dǎo)組)，其細(xì)胞存活率隨著表阿霉素濃度的增加較無沉默c-Met細(xì)胞(無DOX誘導(dǎo)組)呈現(xiàn)明顯降低的趨勢，陰性對照組及空白細(xì)胞組無明顯差異。經(jīng)過DOX誘導(dǎo)、表阿霉素處理后pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231細(xì)胞株IC50為1.23 μg/mL，無DOX誘導(dǎo)組IC50為4.92 μg/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。pSD400-scramble-MDA-MB-231細(xì)胞株中有DOX誘導(dǎo)組IC50為5.56 μg/mL，無DOX誘導(dǎo)組IC50為5.13 μg/mL；MDA-MB-231細(xì)胞株中有DOX誘導(dǎo)組IC50為5.46 μg/mL，無DOX誘導(dǎo)組IC50為5.68 μg/mL；兩種細(xì)胞株有、無DOX誘導(dǎo)組IC50比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

A：加/不加DOX適當(dāng)沉默c-Met后聯(lián)合表阿霉素對pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231細(xì)胞存活率的影響；B：加/不加DOX聯(lián)合表阿霉素對pSD400-scramble-MDA-MB-231細(xì)胞存活率的影響；C：加/不加DOX對MDA-MB-231細(xì)胞存活率的影響。

2.4 適當(dāng)沉默c-Met基因表達聯(lián)合表阿霉素作用后對細(xì)胞凋亡的影響

3種細(xì)胞經(jīng)DOX誘導(dǎo)后，加入4 μg/mL表阿霉素，經(jīng)48 h后利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的周期分布情況。結(jié)果顯示，pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231細(xì)胞株經(jīng)DOX誘導(dǎo)的細(xì)胞(有DOX誘導(dǎo)組)G0/G1期細(xì)胞百分比為(53.7±1.42)%，S期及G2/M期細(xì)胞百分比降低，分別為(38.1±1.13)%、(8.2±0.78)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而未經(jīng)DOX誘導(dǎo)的細(xì)胞(無DOX誘導(dǎo)組)G0/G1期細(xì)胞百分比為(33.5±1.18)%。pSD400-scramble-MDA-MB-231細(xì)胞株中有、無DOX誘導(dǎo)組G0/G1期細(xì)胞百分比[(32.2±1.26)%vs.33.4±1.12%)]和MDA-MB-231細(xì)胞株中有、無DOX誘導(dǎo)組G0/G1期細(xì)胞百分比[(32.7±1.31)%vs.(33.1±1.42%)]均無明顯差異(P>0.05)，見圖4。

A：加/不加DOX適當(dāng)沉默c-Met后聯(lián)合表阿霉素pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231細(xì)胞周期的變化；B：加/不加DOX適當(dāng)沉默c-Met后聯(lián)合表阿霉素pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231細(xì)胞不同周期細(xì)胞百分比；C：加/不加DOX聯(lián)合表阿霉素pSD400-scramble-MDA-MB-231細(xì)胞周期的變化；D：加/不加DOX聯(lián)合表阿霉素pSD400-scramble-MDA-MB-231細(xì)胞不同周期細(xì)胞百分比；E：加/不加DOX MDA-MB-231細(xì)胞周期的變化；F：加/不加DOX MDA-MB-231細(xì)胞不同周期細(xì)胞百分比。

2.5 Western blot檢測細(xì)胞凋亡蛋白表達

適當(dāng)敲除MDA-MB-231細(xì)胞c-Met基因后聯(lián)合表阿霉素，Western blot檢測細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白PARP、caspase-3的表達變化。結(jié)果顯示，pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231細(xì)胞株Cleaved PARP、Cleaved caspase-3表達水平增加明顯，而pSD400-scramble-MDA- MB-231細(xì)胞株無論有無DOX誘導(dǎo)，Cleaved PARP、Cleaved caspase-3表達水平無明顯差異，見圖5。

shRNA-c-Met：pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231細(xì)胞；scramble：pSD400-scramble-MDA-MB-231細(xì)胞。

3 討 論

化療目前仍為乳腺癌主要的治療方法，但癌細(xì)胞對化療藥物的耐藥性是影響乳腺癌患者預(yù)后的主要障礙。表阿霉素由于抗腫瘤效果好且價格低廉，目前為乳腺癌化療常用藥物，但其嚴(yán)重的心臟毒性及骨髓抑制，使不少乳腺癌患者不能完成整個化療療程。如何增加乳腺癌細(xì)胞對表阿霉素的敏感性顯得尤為重要。

c-Met是一種原癌基因，HGF是其配體，屬于受體酪氨酸蛋白激酶家族成員[10]。腫瘤的侵襲性、脈管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、耐藥性及預(yù)后與c-Met過度表達密不可分[11]。因此，c-Met可能是一個潛在的腫瘤治療靶點，其抑制劑的研究現(xiàn)已成為腫瘤治療領(lǐng)域的熱點。過去很多年的研究中證實，乳腺癌組織中c-Met呈過表達，乳腺癌的發(fā)展及預(yù)后與c-Met相關(guān)的信號通路有密切關(guān)系[12]。c-Met抑制劑SGX523能明顯抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞周期G0/G1期阻滯，這一研究被馮煒紅等[13]證實，這為c-Met靶向治療的臨床轉(zhuǎn)化提供了良好的實驗及理論基礎(chǔ)。

RNA干擾(RNAi)是有效沉默或抑制目標(biāo)基因表達的過程。RNAi沉默機制是由小干擾RNA(siRNA)或shRNA誘導(dǎo)實現(xiàn)靶mRNA的降解，或者通過微RNA(miRNA)誘導(dǎo)特定mRNA翻譯的抑制[14]。目前shRNA慢病毒載體被廣泛地用于RNAi研究中，這得益于shRNA在宿主細(xì)胞中能高效、長期穩(wěn)定地表達。本研究所采用的可誘導(dǎo)shRNA是建立在TetO系統(tǒng)基礎(chǔ)上的誘導(dǎo)系統(tǒng)，它含有TetO序列，后者可以與四環(huán)素阻遏蛋白(TetR)結(jié)合并能阻止TetO的啟動子啟動shRNA的轉(zhuǎn)錄。四環(huán)素(Tet)或DOX可以與TetR結(jié)合，可使TetR的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，最終導(dǎo)致TetO序列上的TetR脫落，使shRNA轉(zhuǎn)錄表達。

多項實驗研究證實，在多種腫瘤細(xì)胞中shRNA對c-Met的沉默是有效的[15-16]。本次研究成功構(gòu)建針對c-Met的shRNA穩(wěn)定細(xì)胞系，該細(xì)胞系常規(guī)培養(yǎng)時與陰性對照組無差別，不表達shRNA，在加入DOX誘導(dǎo)后，穩(wěn)定細(xì)胞系可表達shRNA，從而導(dǎo)致穩(wěn)定細(xì)胞c-Met蛋白表達水平降低，細(xì)胞增殖能力受到抑制。前期研究發(fā)現(xiàn)，如果完全敲除細(xì)胞c-Met基因后細(xì)胞會死亡，所以本研究選擇可調(diào)控沉默c-Met基因的慢病毒載體系統(tǒng)進行后續(xù)實驗。在實驗中發(fā)現(xiàn)DOX濃度在0.4 μg/mL時c-Met沉默率可達80%左右，所以最終選擇DOX誘導(dǎo)濃度為0.4 μg/mL。適當(dāng)敲除MDA-MB-231細(xì)胞c-Met基因后加入表阿霉素聯(lián)合作用，發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，同時促進了細(xì)胞的凋亡。乳腺癌細(xì)胞對表阿霉素作用的IC50由4.92 μg/mL降至1.23 μg/mL，細(xì)胞增殖活性明顯降低，這與QUE等[17]的研究結(jié)果一致。同時適當(dāng)沉默c-Met基因與表阿霉素聯(lián)合作用誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)G1期阻滯，從而抑制細(xì)胞的增殖。這些結(jié)果或許說明針對腫瘤細(xì)胞中特定的原癌基因，調(diào)控其在腫瘤細(xì)胞中的表達，對于有效提高化療藥物對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性具有重要作用。

本次研究結(jié)果也表明，適當(dāng)沉默MDA-MB-231細(xì)胞c-Met基因表達聯(lián)合表阿霉素作用后，細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白PARP和caspase-3表達水平增高。目前已經(jīng)證實caspase-3及其底物PARP在細(xì)胞凋亡中起重要作用。當(dāng)細(xì)胞DNA受損嚴(yán)重時可以激活caspase-3，從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，此時PARP被caspase-3裂解。裂解的PARP切斷煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)合成時對三磷酸腺苷(ATP)的消耗，促使細(xì)胞凋亡的完成[17]。PARP常被用作細(xì)胞凋亡的指標(biāo)。本研究中適當(dāng)敲除c-Met后，MDA-MB-231細(xì)胞上調(diào)caspase-3和PARP表達，結(jié)果表明shRNA對c-Met基因適當(dāng)敲除聯(lián)合表阿霉素引起caspase相關(guān)細(xì)胞凋亡，這可能是導(dǎo)致細(xì)胞活性下降的部分原因。這與QUE等[7]研究結(jié)果一致，該研究顯示shRNA靶向c-Met可誘發(fā)U266細(xì)胞caspase依賴性凋亡。本研究顯示，在pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231細(xì)胞(有DOX誘導(dǎo)組)中細(xì)胞增殖能力的下降與凋亡率的增加關(guān)系密切，并且細(xì)胞周期阻滯發(fā)生在G0/G1期。

腫瘤耐藥性是導(dǎo)致乳腺癌患者治療失敗和死亡的重要原因。在本研究中，下調(diào)c-Met表達可以增加乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231對表阿霉素的敏感性，表明c-Met可能是乳腺癌的輔助化療靶點。作者認(rèn)為，除了MDA-MB-231細(xì)胞以外，本研究還應(yīng)分析更多的乳腺癌細(xì)胞，以證實適當(dāng)敲除c-Met基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞增殖、侵襲的抑制作用，以及增加乳腺癌細(xì)胞對表阿霉素化療敏感性的作用。此外，除了研究下調(diào)c-Met對表阿霉素的化療敏感性外，還應(yīng)分析其他化療藥物的化療敏感性。因此，適當(dāng)敲除c-Met基因產(chǎn)生的抗癌作用有待進一步研究。