藤茶粉和二氫楊梅素對2種水產(chǎn)致病菌體外抑菌研究

張先姝，劉進(jìn)雄，朱 志，唐玖玖，張俊波，印雙紅，3*，張孟琴

(1.銅仁學(xué)院農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院，貴州 銅仁 554300；2.銅仁學(xué)院，貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護(hù)與利用重點實驗室，貴州 銅仁 554300；3.銅仁學(xué)院大健康學(xué)院，貴州 銅仁 554300；4.銅仁學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，貴州 銅仁 554300)

藤茶學(xué)名為顯齒蛇葡萄(Ampelopsisgrossedentata)，既能入藥又可食用，民間用其嫩莖葉入茶已有數(shù)百年的歷史，據(jù)《中草藥匯編》等文獻(xiàn)記載，藤茶入藥有清熱解毒的功效，可治感冒風(fēng)熱、咽喉腫痛等[1]。藤茶主要含有黃酮類、甾體類、萜類、多酚、多糖類等化學(xué)成分[2]，其中二氫楊梅素(Dihydromyricetin，DMY)是藤茶的主要活性成分，化學(xué)式為3，5，7，3′，4′，5′-六羥基-2，3-雙氫黃酮醇[3]，能抑制細(xì)菌等微生物的生長[4]，現(xiàn)代研究表明藤茶具有抗氧化、抑菌、提高免疫力、降血脂、清除自由基、抗血栓、抗腫瘤、消炎等作用[5]?，F(xiàn)階段關(guān)于藤茶粉及二氫楊梅素的提取工藝已經(jīng)很成熟，但對藤茶及其黃酮類成分的生物活性研究基本限于體外試驗，對體內(nèi)的相關(guān)研究較少，而且對藤茶多途徑、多靶點抗感染作用機(jī)制的研究不夠深入[2]。藤茶的抗氧化活性近年來研究較多，涉及生物醫(yī)藥、食品行業(yè)、畜禽養(yǎng)殖等[6]，但是在水產(chǎn)上的研究應(yīng)用很少。目前，細(xì)菌性疾病是危害魚類養(yǎng)殖的主要生物源疾病[7]。已報道的細(xì)菌病原微生物有維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、柱狀黃桿菌(Flavobacteriumcloumnare)、鰻弧菌(Vibrioanguillarum)等。其中維氏氣單胞菌常引起水生動物腐皮病、爛尾病、細(xì)菌性敗血癥等多種病癥[8]，嗜水氣單胞菌能夠引起細(xì)菌性敗血癥[9]、急性腸胃炎[10]、皮膚潰爛等疾病[11]，給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的損失。在水產(chǎn)細(xì)菌疾病的防治中多采用抗生素進(jìn)行治療，而抗生素的過度使用易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性和水產(chǎn)品殘留等問題[12]，當(dāng)水產(chǎn)細(xì)菌疾病暴發(fā)時再使用抗生素治療效果也不好，還會污染水源、危害人們健康。藤茶對大腸桿菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有抑菌作用[13]，二氫楊梅素對金黃色葡萄球菌、福氏志賀菌、銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、乙型副傷寒沙門菌和枯草芽孢桿菌均有抑制作用[14]。本試驗探究藤茶粉和二氫楊梅素分別對維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌的體外抑菌效果，旨在證明藤茶粉和二氫楊梅素對這2種細(xì)菌有抑制作用，為藤茶粉和二氫楊梅素代替抗生素應(yīng)用于水產(chǎn)細(xì)菌病治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

嗜水氣單胞菌(BNCC186123)和維氏氣單胞菌(BNCC138468)均從北京北納創(chuàng)聯(lián)生物有限公司購買。

1.1.2 藥品

二氫楊梅素(含量98%)購自貴州苗藥生物技術(shù)有限公司，藤茶粉購自陜西寶禾生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱取牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、瓊脂粉10 g、氯化鈉5 g，溶于1 L蒸餾水中，加熱攪拌溶解后調(diào)節(jié)pH在7.0～7.5之間，121℃滅菌20 min，備用。

液體培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱取牛肉膏 5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g，溶于1 L蒸餾水中，加熱攪拌溶解后調(diào)節(jié)pH在7.0～7.5之間，121℃滅菌30 min，備用。

1.1.4 主要儀器

高壓蒸汽滅菌鍋、搖床、全自動生化培養(yǎng)箱、超凈工作臺。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備

用小砂輪在安瓿管身1/2處劃兩圈，再用75%酒精擦拭管壁消毒，用手掰斷或用鑷子敲斷安瓿管，吸取約0.4 mL液體培養(yǎng)基溶解菌粉，菌懸液則移入指定的液體培養(yǎng)基內(nèi)，并按照37℃、150 r/min培養(yǎng)18～24 h。用移液槍取1 mL菌液于EP管中，以10 000 r/min離心1 min，倒掉上清液，加入1 mL無菌水，混勻，再進(jìn)行10倍稀釋，然后用麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行對比，得出細(xì)菌的數(shù)量。調(diào)整菌液濃度以1×108cfu/mL作為供試菌液。

1.2.2 藥液的制備

根據(jù)蕭力爭等[15]的研究結(jié)果，茶葉提取物對細(xì)菌的最低抑菌濃度不超過10 mg/mL，二氫楊梅素對細(xì)菌的最低抑菌濃度不超過1.76 mg/mL，稱取1.00 g藤茶粉加入10 mL無菌水，配置成100 mg/mL藥液，再用無菌水以二倍稀釋法配成50、25、12.5、6.25 mg/mL藥液。稱取0.20 g二氫楊梅素，加入10 mL 80%乙醇配置成20 mg/mL藥液，用無菌水以二倍稀釋法配成 10、5、2.5、1.25 mg/mL藥液。

1.2.3 抑菌試驗

在超凈臺上每個平板中加入20 μL菌懸液，用無菌L型涂布器涂布均勻直到看不見明顯的水滴為止，每種菌設(shè)3個重復(fù)，用內(nèi)徑為6 mm的無菌打孔器進(jìn)行打孔，每個平板打6個孔，在每個孔中加入10 μL 0.7%瓊脂液(約60℃)進(jìn)行封底[16]，其中5個孔中依次加入80 μL不同濃度的藥液，剩下的一個孔加入80 μL溶劑(藤茶粉用無菌水，二氫楊梅素用80%乙醇[4，15])作空白對照，將加好藥液的培養(yǎng)皿放入37℃全自動生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，最后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的大小并記錄。判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑≥20 mm為極敏，15 mm≤抑菌圈直徑<20 mm為高敏，10 mm≤抑菌圈直徑<15 mm為中敏，抑菌圈直徑<10 mm為低敏[17]。

1.2.4 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定

將每種指示菌作為1組，每組取7支無菌試管并進(jìn)行編號，每支試管均加入2 mL液體培養(yǎng)基，用移液槍向1號試管中加入藥液2 mL，混勻后，吸取2 mL到2號管中依次類推，最后從5號試管中吸取2 mL丟棄，6號加入2 mL培養(yǎng)基作陰性對照(試管中均加入50 μL菌液)，7號試管中只加2 mL培養(yǎng)基作空白對照，每組設(shè)3個重復(fù)，以上操作每次均更換槍頭。最終配置成表1中的濃度。在搖床中以37℃、150 r/min培養(yǎng)24 h。觀察菌液生長狀況，菌液澄清時所對應(yīng)的藥液為MIC[18]。選取所有清晰無菌生長的試管[19]，取50 μL樣液涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng) 24 h，能殺死99.9% 接種的細(xì)菌(平板上不超過5個菌落)對應(yīng)的最低藥物濃度即為MBC[20]。

表1 藤茶成分濃度

2 結(jié)果與分析

2.1 藤茶粉對維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的抑菌效果

當(dāng)藤茶粉濃度為100 mg/mL時，維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的抑菌圈均達(dá)到最大(圖1)，抑菌圈直徑均大于20 mm，屬于極敏藥物。隨著濃度的降低，抑菌圈逐漸減小，當(dāng)濃度為6.25 mg/mL時，抑菌圈不太明顯(表2)。

表2 藤茶粉對維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的抑菌效果

注：0為空白對照，1為100 mg/mL，2為50 mg/mL，3為25 mg/mL，4為12.5 mg/mL，5為6.25 mg/mL。

2.2 二氫楊梅素對維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的抑菌效果

當(dāng)二氫楊梅素濃度為20 mg/mL時，維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的抑菌圈均達(dá)到最大(圖2)，抑菌圈直徑均大于15 mm，屬于高敏藥物。隨著濃度的降低，抑菌圈逐漸減小，當(dāng)濃度為1.25 mg/mL時，抑菌圈不太明顯，試驗結(jié)果見表3。

表3 二氫楊梅素對維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的抑菌效果

注：0為空白對照，1為20 mg/mL，2為10 mg/mL，3為5 mg/mL，4為2.5 mg/mL，5為1.25 mg/mL。

2.3 藤茶粉MIC和MBC的測定

藤茶粉MIC和MBC的測定結(jié)果如表4所示，藤茶粉對維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的MIC和MBC均為6.25 mg/mL，表明藤茶粉具有抗菌活性，對維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌均有抗菌作用。

表4 藤茶粉MIC和MBC測定

Tab.4 Determination of MIC and MBC of Ampelopsis grossedentata powder

供試菌種Tested strain最小抑菌濃度/(mg/mL) MIC最小殺菌濃度/(mg/mL)MBC維氏氣單胞菌Aeromonas veronii6.256.25嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophi-la6.256.25

2.4 二氫楊梅素MIC和MBC的測定

結(jié)果顯示，二氫楊梅素對維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的MIC和MBC均為1.25 mg/mL(表5)。結(jié)果表明，二氫楊梅素具有抗菌活性，對維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌均有抗菌作用。

表5 二氫楊梅素MIC和MBC測定

Tab.5 Determination of MIC and MBC of dihydromyricetin

供試菌種Tested strain最小抑菌濃度/(mg/mL) MIC最小殺菌濃度/(mg/mL)MBC維氏氣單胞菌Aeromonas veronii1.251.25嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophi-la1.251.25

3 討論

3.1 抑菌試驗的影響因素

袞秀群[21]的研究表明，藥液濃度的高低與藥物色澤的深淺有直接關(guān)系。由于本試驗中配制的藤茶粉藥液顏色較深，可能會導(dǎo)致在判斷藥液的清澈程度、觀察試管中細(xì)菌生長情況時結(jié)果不太準(zhǔn)確，但可做含藥培養(yǎng)基來解決藥液顏色干擾的問題。

本研究結(jié)果顯示，藤茶粉和二氫楊梅素對維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌均有抑制作用，藤茶粉和二氫楊梅素對以上兩種細(xì)菌的MIC和MBC分別為6.25、1.25 mg/mL；劉勝貴等[22]研究顯示，藤茶不同器官(根、莖、葉)的提取液對糞球桿菌的MIC分別為7.81、0.98、0.98 mg/mL，對大腸桿菌的MIC分別為500.00、25.00、7.81 mg/mL，對陰溝桿菌的最小抑菌濃度分別為31.25、15.68、7.81 mg/mL；蕭力爭等[4]的研究表明二氫楊梅素對枯草芽孢桿菌和鏈球菌的MIC高于3.52 mg/mL，說明不同的藤茶成分來源對不同的細(xì)菌抑制效果不同，藤茶粉和二氫楊梅素有廣譜抑菌的作用。鄧新武等[23]研究表明，不同方法提取的藤茶抑菌效果不同；吳海順等[24]研究提到提取溶劑濃度會影響藤茶活性物質(zhì)的溶解度，進(jìn)而影響其活性成分的功效。由于本試驗的藥品是從公司購買的成品，選材、加工提取的不同可能會導(dǎo)致藥品的有效成分和含量不一，可能會影響抑菌效果。

3.2 探究藤茶粉和二氫楊梅素治療由氣單胞菌屬引起的魚病

維氏氣單胞菌會引起宿主腸道、傷口及軟組織感染，導(dǎo)致敗血癥[25]。嗜水氣單胞菌能夠?qū)е滤a(chǎn)動物體表、各個組織臟器呈現(xiàn)出血性炎癥并引起大量死亡[26]。中草藥作為抗菌藥物，其活性成分可直接作用于病原菌，影響或破壞其生長、繁殖和代謝過程，從而達(dá)到殺菌、抗菌的目的[27]。藤茶粉和二氫楊梅素可能是抑制菌體的呼吸代謝、破壞菌體的結(jié)構(gòu)形態(tài)、改變細(xì)胞膜的滲透性[28]，從而發(fā)揮抗菌作用。本試驗已得出藤茶粉和二氫楊梅素在體外可以抑制以上兩種細(xì)菌的生長，后期將在魚體內(nèi)進(jìn)行抑菌研究，為中藥藤茶替代抗生素治療魚類細(xì)菌病提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論與展望

本研究選用藤茶粉和二氫楊梅素分別對維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌進(jìn)行體外試驗，結(jié)果顯示，藤茶粉對維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的MIC和MBC均為6.25 mg/mL；二氫楊梅素對維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的MIC和MBC均為1.25 mg/mL，表明藤茶粉和二氫楊梅素對以上兩種細(xì)菌均有一定的抑制作用。

中草藥具有毒副作用小、污染低[29]、不易產(chǎn)生抗藥性的特點，且含有生物堿、苷類、糖類、黃酮、油脂、氨基酸和多種常量及微量元素，這些成分既能補充動物營養(yǎng)，又有抗菌和免疫作用，可以增強機(jī)體的免疫和抗病能力[30]。藤茶是一種中草藥，除了含有黃酮、多糖、多酚和揮發(fā)油外，還含有氨基酸和微量元素等[31]。有研究表明，藤茶中含有17種氨基酸，包括蛋氨酸、谷氨酸等8種人體必須氨基酸[32]。二氫楊梅素可以促進(jìn)鯉魚生長，提高形態(tài)指標(biāo)，防止體內(nèi)脂質(zhì)的過氧化損傷[33]。藤茶粉和二氫楊梅素既能抑菌，又能促進(jìn)水產(chǎn)動物的生長，還能提高機(jī)體免疫力，因此選用適宜的抗菌藥物與中草藥聯(lián)用治療疾病[34]或者作為飼料添加劑應(yīng)用到水產(chǎn)上具有廣闊的前景。