基于團(tuán)聚原理的納米金比色法測(cè)定甲巰咪唑

莊登科，毛麗惠，李保峰，黃子源，劉博園，顧順郁，李 嘉

(信陽學(xué)院理工學(xué)院，河南 信陽 464000)

甲巰咪唑(Thiamazole,2-mercapto-1-methylimidazole,MMI)為咪唑類抗甲狀腺藥物[1]，在臨床上用于治療各種類型的甲狀腺功能亢進(jìn)癥，長(zhǎng)期或過量使用，會(huì)影響人體血液系統(tǒng)和消化系統(tǒng)，導(dǎo)致骨骼、關(guān)節(jié)不適[2-3]。所以，建立一種準(zhǔn)確、靈敏、快速測(cè)定甲巰咪唑含量的方法對(duì)指導(dǎo)臨床用藥有著極為重要的作用。目前，測(cè)定甲疏咪唑的方法主要有化學(xué)發(fā)光法[4]、紫外可見分光光度法[5]、高效液相色譜法[6]、光度法[7]、電化學(xué)法[8]、熒光猝滅法[9]等。其中，化學(xué)發(fā)光法穩(wěn)定性、重現(xiàn)性不好；高效液相色譜法所需儀器價(jià)格昂貴；電化學(xué)法操作不便；熒光猝滅法的機(jī)理復(fù)雜，且干擾因素多。紫外可見分光光度法因具有儀器簡(jiǎn)單、操作方便、靈敏度高、分析速度快等特點(diǎn)而備受關(guān)注。

納米金的粒徑在1～100 nm之間，具有強(qiáng)大的表面等離子體共振(SPR)效應(yīng)，較高的電子密度、介電性能、催化性能及良好的穩(wěn)定性，能與多種生物大分子結(jié)合而不影響其生物活性，此外，納米金還具有易于修飾和功能化等特點(diǎn)[10]，廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域[11]。納米金制備簡(jiǎn)單，常采用檸檬酸鈉還原法，通過控制還原劑檸檬酸鈉的用量可以得到不同粒徑的納米金。

納米金比色法是基于納米金粒子的表面等離子體共振效應(yīng)，被測(cè)物質(zhì)與納米金粒子發(fā)生相互作用，誘導(dǎo)納米金粒子團(tuán)聚，從而可以通過肉眼觀察體系顏色變化或紫外可見分光光度法實(shí)現(xiàn)定性定量檢測(cè)，具有消光系數(shù)高、靈敏度高、不需要昂貴復(fù)雜儀器等特點(diǎn)。當(dāng)前，納米金比色法已廣泛應(yīng)用于核酸、適體蛋白、酶、金屬離子等物質(zhì)的檢測(cè)[12]。郭昱辰等[13]采用鉍試劑-Ⅱ修飾的納米金溶液檢測(cè)汞離子，汞離子與鉍試劑-Ⅱ選擇性配位，使納米金粒子團(tuán)聚，汞離子濃度與吸光度呈一定的線性關(guān)系，線性范圍為5×10-5～1 mg·L-1，回收率為93%～107%，RSD值為1.98%～3.52%，該方法具有較高的精密度和穩(wěn)定性。王慎等[14]采用納米金比色法測(cè)定頭孢噻肟鈉，檢出限為0.006 μg·mL-1，加標(biāo)回收率為97.5%～105.0%，RSD值為1.0%～2.3%，該方法的選擇性、準(zhǔn)確度和重復(fù)性能夠滿足實(shí)際需要。曲黎等[15]采用納米金比色法成功測(cè)定了多西環(huán)素和土霉素，多西環(huán)素和土霉素分子中的氨基官能團(tuán)誘導(dǎo)納米金粒子團(tuán)聚，導(dǎo)致納米金吸收光譜發(fā)生紅移和展寬，溶液顏色由酒紅色變成藍(lán)色，測(cè)定多西環(huán)素和土霉素的線性范圍分別為0.06～0.66 mg·L-1和0.59～8.85 mg·L-1，檢出限分別為0.008 6 mg·L-1、0.083 8 mg·L-1，符合藥品質(zhì)量管理的規(guī)定。邢海波等[16]采用基于團(tuán)聚原理的納米金比色法檢測(cè)牛奶中的三聚氰胺，通過紫外可見分光光度計(jì)可檢測(cè)的檢出限為34 nmol·L-1，遠(yuǎn)低于美國(guó)FDA和歐盟規(guī)定的牛奶中三聚氰胺的最大殘留標(biāo)準(zhǔn)2.5 mg·L-1(20 000 nmol·L-1)，加標(biāo)回收率為90%～120%，該方法可滿足精確檢測(cè)牛奶中三聚氰胺殘留的要求。么亞男等[17]建立了納米金比色法測(cè)定啶蟲脒，利用啶蟲脒誘導(dǎo)納米金粒子團(tuán)聚變色，使其在520 nm 處吸收峰強(qiáng)度減弱，同時(shí)在700 nm 附近產(chǎn)生新的吸收峰，檢出限為1.27 μmol·L-1。戴衛(wèi)江等[18]成功將納米金比色法應(yīng)用于家蠶微孢子蟲的檢測(cè)，基于團(tuán)聚原理，采用納米金探針檢測(cè)到的家蠶微孢子蟲總蛋白量最低為10 ng，該方法對(duì)家蠶微粒子病的防治具有重要意義。田銳等[19]成功將納米金比色法用于阿米卡星的測(cè)定，利用阿米卡星誘導(dǎo)納米金粒子團(tuán)聚，使其在520 nm處吸收峰強(qiáng)度減弱，同時(shí)在640 nm附近產(chǎn)生新的吸收峰，線性范圍為2.0×10-7～5.0×10-6mol·L-1，檢出限為0.6×10-8mol·L-1，回收率為100.0%～105.0%。

作者基于團(tuán)聚原理建立納米金比色法測(cè)定甲巰咪唑，對(duì)納米金與甲巰咪唑的反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行初步探討，并對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

甲巰咪唑標(biāo)準(zhǔn)品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲巰咪唑片，Merck KGaA公司；氯金酸、檸檬酸鈉、磷酸、硼酸、醋酸、氫氧化鈉；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

TU-1901型紫外可見分光光度計(jì)，F(xiàn)EI-Tecnai-F20型透射電子顯微鏡，PHS-3E型 pH計(jì)，F(xiàn)A2004型電子分析天平，DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器。

1.2 納米金的制備

采用檸檬酸鈉還原法制備納米金[20]。取2.0 mL 1%氯金酸溶液，加熱煮沸，迅速加入5.6 mL 1%檸檬酸鈉溶液，邊加熱邊用磁力迅速攪拌；待溶液持續(xù)沸騰至顏色不再發(fā)生變化時(shí)，停止加熱，繼續(xù)攪拌直至溶液溫度降為室溫；轉(zhuǎn)移至棕色容量瓶中，置于冰箱中，4 ℃保存，備用。

1.3 納米金比色法測(cè)定甲巰咪唑

Britton-Robinson緩沖溶液的配制：用濃度均為0.04 mol·L-1的磷酸、硼酸和醋酸配成100 mL混合溶液，加入一定體積的0.2 mol·L-1NaOH溶液，并用酸度計(jì)調(diào)節(jié)溶液pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。

準(zhǔn)確移取1 mL 0.01 mol·L-1Britton-Robinson緩沖溶液、1 mL納米金溶液，加入1 mL不同濃度甲巰咪唑溶液，混合均勻，室溫反應(yīng)5 min。拍攝記錄溶液的顏色變化，掃描溶液的紫外可見吸收光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)機(jī)理分析

納米金粒子的共振吸收能帶位于可見光區(qū)，分散狀態(tài)的納米金在520 nm處有一個(gè)很明顯的特征吸收峰，加入甲巰咪唑后，團(tuán)聚狀態(tài)的納米金粒子在520 nm處的吸收峰強(qiáng)度減弱，且在660 nm處產(chǎn)生一個(gè)新的吸收峰(圖1)，兩處吸光度比值(A660/A520)與甲巰咪唑濃度呈正比。加入甲巰咪唑后，溶液顏色由酒紅色變?yōu)樗{(lán)紫色。其可能的反應(yīng)機(jī)理為：甲巰咪唑是一種常見的有機(jī)小分子，含有1個(gè)巰基(-SH)和2個(gè)氮原子，其中飽和氮原子為吡咯氮，不飽和氮原子為吡啶氮，甲巰咪唑加入納米金溶液后，具有一對(duì)sp2孤對(duì)電子的吡啶氮可以通過弱表面結(jié)合將檸檬酸根離子置換，與納米金發(fā)生強(qiáng)烈的配位作用，甲巰咪唑中的-SH可以與納米金形成Au-S鍵，從而使納米金粒子發(fā)生團(tuán)聚，此時(shí)膠體溶液顏色呈藍(lán)紫色納米金與甲巰咪唑反應(yīng)前后的透射電鏡照片如圖2所示。

圖1 納米金與不同濃度甲巰咪唑反應(yīng)前后的紫外可見吸收光譜Fig.1 UV-Vis absorption spectra of gold nanoparticles before and after reaction with different concentrations of methimazole

圖2 納米金與甲巰咪唑反應(yīng)前(a)后(b)的透射電鏡照片F(xiàn)ig.2 TEM images of gold nanoparticles before(a) and after(b) reaction with methimazole

[21]

由圖2可以看出，納米金粒子呈球形，有很好的分散性(圖2a)；甲巰咪唑加入納米金溶液后，使納米金粒子產(chǎn)生了明顯的團(tuán)聚(圖2b)。

2.2 檢測(cè)條件的優(yōu)化

2.2.1 反應(yīng)時(shí)間的選擇

將濃度分別為2 μmol·L-1和6 μmol·L-1的甲巰咪唑溶液與納米金溶液反應(yīng)不同時(shí)間,考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)A660/A520的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)A660/A520的影響Fig.3 Effect of reaction time on A660/A520

由圖3可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，A660/A520逐漸降低，體系反應(yīng)不完全；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過5 min后，繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，A660/A520變化不明顯。因此，選擇反應(yīng)時(shí)間為5 min。

2.2.2 緩沖溶液pH值的選擇

反應(yīng)體系pH值會(huì)影響納米金粒子和甲巰咪唑在溶液中的存在形態(tài)及二者之間的相互作用。配制pH值為3.0～9.0的0.01 mol·L-1Britton-Robinson緩沖溶液，考察緩沖溶液pH值對(duì)A660/A520的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 緩沖溶液pH值對(duì)A660/A520的影響Fig.4 Effect of pH value of buffer solution on A660/A520

由圖4可知，緩沖溶液pH值為3.0時(shí)，A660/A520最高；緩沖溶液pH值在3.5～7.0時(shí)，A660/A520在一定范圍內(nèi)波動(dòng)，在pH值為7.0時(shí)達(dá)到最高；緩沖溶液pH值>7.0后，A660/A520降低。這可能是由于，在酸性條件下甲巰咪唑的巰基可以質(zhì)子化，增強(qiáng)其與帶負(fù)電荷的納米金粒子的相互作用；而在堿性條件下，甲巰咪唑的巰基會(huì)失去質(zhì)子帶負(fù)電荷，減弱其與納米金粒子的相互作用[22-23]。因此，選擇pH值為3.0的0.01 mol·L-1Britton-Robinson緩沖溶液作為反應(yīng)介質(zhì)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

在Britton-Robinson緩沖溶液pH值為3.0、反應(yīng)時(shí)間為5 min的最佳條件下，在甲巰咪唑濃度為0.2～10 μmol·L-1時(shí)，采用納米金比色法測(cè)定甲巰咪唑濃度與A660/A520的關(guān)系，結(jié)果如圖5所示。

圖5 甲巰咪唑的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of methimazole

由圖5可知，甲巰咪唑濃度在0.2～1.0 μmol·L-1范圍內(nèi)時(shí)，線性回歸方程為：A660/A520=0.162c+0.1642，R2=0.9959(圖5a)；在2～10 μmol·L-1范圍內(nèi)時(shí)，線性回歸方程為：A660/A520=0.0642c+0.6145，R2=0.9991(圖5b)。

對(duì)4 μmol·L-1的甲巰咪唑溶液平行測(cè)定11次，RSD值為4.7%，檢出限為0.06 μmol·L-1。

2.4 干擾物質(zhì)的影響

當(dāng)甲巰咪唑濃度為4 μmol·L-1時(shí)，考察125 倍量的Al3+、Ba2+、Co2+、Cr3+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、葡萄糖、蔗糖對(duì)A660/A520的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 潛在干擾物質(zhì)對(duì)A660/A520的影響Fig.6 Effect of potentially interfering substances on A660/A520

由圖6可知，反應(yīng)體系A(chǔ)660/A520無明顯變化。表明潛在的干擾物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果無影響，該方法選擇性好。

2.5 樣品測(cè)定

將甲巰咪唑藥片研細(xì)混勻后，加入去離子水溶解，轉(zhuǎn)至 50 mL棕色容量瓶中定容，靜置；逐步稀釋至濃度為5 μmol·L-1，在最佳條件下進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得每片藥片甲巰咪唑的含量為9.26 mg，與藥品生產(chǎn)企業(yè)標(biāo)示含量基本一致。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性，向健康人的尿樣中加入濃度為4 μmol·L-1的甲巰咪唑標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，測(cè)得甲巰咪唑濃度為4.12 μmol·L-1，加標(biāo)回收率為115%，RSD值為2.2%(n=6)。表明，該方法可用于甲巰咪唑藥片中甲巰咪唑含量的測(cè)定。

3 結(jié)論

采用檸檬酸鈉還原法制備納米金，基于團(tuán)聚原理建立了納米金比色法測(cè)定甲巰咪唑。結(jié)果表明，室溫下，在Britton-Robinson緩沖溶液pH值為3.0、反應(yīng)時(shí)間為5 min的最佳條件下，測(cè)定甲巰咪唑的線性范圍為0.2～1.0 μmol·L-1、2～10 μmol·L-1，檢出限為0.06 μmol·L-1；對(duì)健康人的尿樣進(jìn)行分析，加標(biāo)回收率為115%。該方法簡(jiǎn)單、快速，可用于甲巰咪唑含量的測(cè)定。